專利名稱：敲除氧-甲基轉移酶基因獲得格爾德霉素衍生物的方法
技術領域：
本發明涉及利用分子生物學手段，通過敲除參與鏈霉菌活性代謝產物生物合成的基因獲得新化合物的方法。
背景技術：
以格爾德霉素(geldanamycin)為代表的苯醌安莎類化合物(benzoquinone ansamycin)是目前研究最多、效果很好的抗腫瘤化合物之一。此類化合物的抗腫瘤機制是與腫瘤細胞中的熱休克蛋白(heat shock protein)Hsp90特異結合，導致腫瘤細胞內許多需要Hsp90維持功能的重要蛋白質迅速降解，從而抑制腫瘤細胞的生長或引發腫瘤細胞死亡。雖然格爾德霉素具有很強的抗腫瘤活性，但因其毒副作用大、水溶性差和穩定性差，不適合臨床使用。通過對格爾德霉素一些化學基團進行修飾，可以提高其活性并降低毒性。目前多種極具潛力的格爾德霉素衍生物已經進入臨床實驗，這些化合物的共同特點是在格爾德霉素的碳-17位進行了不同程度的修飾。苯醌安莎化合物的生物合成是以3-氨基-羥基苯甲酸為起始物，通過聚酮合酶 (polyketide synthase, I3KS)逐步加入一些延伸元件如乙酸、丙酸和羥基乙酸等，形成一個聚酮的核心結構，最后再經過后修飾酶進行修飾而成。目前國內外對于此類化合物的生物合成研究表明，其合成核心結構的PKS酶很相似，主要區別在于后修飾，其中最為重要的是碳-17位的修飾，修飾的結果對該類化合物的抗腫瘤活性及細胞毒性具有很重要的影響。雖然多個苯醌安莎化合物生物合成的基因簇已經克隆，如吸水鏈霉菌 hygroscopicus)WSL 3602中格爾德霉素生物合成基因簇和吸水鏈霉菌AM 3672中的除莠霉素(herbimycin)基因簇等，但是編碼參與17-氧甲基化的酶的基因一直未能找到。我們從一株產格爾德霉素的放線菌新種一一自溶鏈霉菌 autolyticus CGMCC 0516) (ZL 00134063. 8)中克隆并測序了格爾德霉素生物合成的全基因簇，首次發現了編碼參與碳-17位修飾的氧-甲基轉移酶基因，并通過體內和體外實驗證明了此基因的功能，有關該基因的研究尚未見報道。在此基礎上，我們對自溶鏈霉菌野生型菌株進行了遺傳改造，負責格爾德霉素生物合成途徑中碳-17位甲基化的氧-甲基轉移酶基因(^/―)被敲除后，菌株完全喪失了產生格爾德霉素的能力，卻能夠產生17-氧-去甲基格爾德霉素(17-0-Demethyl-geldanamycin)和17-氨基-17-去甲氧基格爾德霉素(17-Amino-17-demethoxy-geldanamycin)。其中17-氧-去甲基格爾德霉素可作為格爾德霉素碳-17位改造的起始物質，通過結構改造可能獲得具有更好藥理學特性的抗腫瘤藥物。而 17-氨基-17-去甲氧基格爾德霉素是目前最有前途的格爾德霉素類抗腫瘤藥物，目前正由美國hfinity !Pharmaceuticals開發，并進入一期臨床試驗。但是17-氨基_17_去甲氧基格爾德霉素的生物合成至今未見報道。本發明涉及的17-氧-去甲基格爾德霉素和17-氨基-17-去甲氧基格爾德霉素可以通過所構建的氧-甲基轉移酶基因敲除工程菌發酵產生，與化學合成方法相比，更加經濟、環保，并可持續利用。CN 102533896 A
發明內容
本發明構建了自溶鏈霉菌的全基因文庫，以和/基因片段為探針通過菌落原位雜交和Southern雜交篩選獲得格爾德霉素生物合成基因簇，采用鳥槍法對所克隆基因簇DNA序列進行了測定，并從中發現了苯醌安莎類化合物生物合成基因簇中都未見報道的氧-甲基轉移酶基因，此基因編碼氧-甲基轉移酶的功能經體內和體外實驗證實。采用 Red/ET 一步PCR法構建了該氧-甲基轉移酶基因的敲除突變株，發酵產物分析表明，所構建氧-甲基轉移酶基因敲除工程菌能夠產生17-氧-去甲基格爾德霉素和17-氨基-17-去甲氧基格爾德霉素。本發明提供了構建該氧甲基轉移酶基因敲除工程菌的方法，以及通過發酵獲得17-氧-去甲基格爾德霉素和17-氨基-17-去甲氧基格爾德霉素的方法。本發明所涉及的17-氧-甲基轉移酶基因全長678個核苷酸，蛋白質全長225個氨基酸。本發明基因工程菌自溶鏈霉菌autoIyticus, CGMCC 0516)氧-甲基轉移酶(GdmMT) 突變株保藏于中國典型培養物保藏中心(0^0)，地址武漢大學，保藏編號M 2011200, 保藏日期2011年6月16日。
圖1.自溶鏈霉菌CGMCC 0516中格爾德霉素生物合成基因簇。(A)以探針1和探針2篩選得到覆蓋格爾德霉素生物合成全基因簇粘粒質粒PBS17001，pBS17002和pBS17003 ； (B) 格爾德霉素生物合成基因簇的遺傳組成及相關ORF的推測功能；(C)格爾德霉素可能的合成途徑。圖2.表達純化的氧-甲基轉移酶。1為低分子量蛋白標準，2為純化的氧-甲基轉移酶蛋白。圖3.不同pH對氧-甲基轉移酶活性的影響。圖4.不同金屬離子對氧-甲基轉移酶活性的影響。圖5.氧-甲基轉移酶敲除突變株的構建及Southern雜交分析。(A)突變株的構建策略；(B)Southern雜交分析，其中1為BamR I酶切的野生型菌株基因組DNA，2為及
I酶切的突變株基因組DNA。圖6.氧-甲基轉移酶敲除突變株的產物檢測。I 格爾德霉素標樣；II :17-氧-去甲基格爾德霉素標樣；III =Ag-/突變株產物；IV 野生型菌株產物V -AgdmMT r勉； VI 互補菌株產物；VII 失活的氧-甲基轉移酶催化17-氧-去甲基格爾德霉素反應產物； VIII 氧-甲基轉移酶催化17-氧-去甲基格爾德霉素反應產物； 17-氨基-17-去甲氧基格爾德霉素。
具體實施例方式
1.自溶鏈霉菌中格爾德霉素生物合成基因簇的克隆和測序
以粘粒質粒PHAQ34為載體構建自溶鏈霉菌的全基因文庫，首先用部分酶切自溶鏈霉菌染色體DNA，回收40 1Λ左右片段，去磷酸化處理后與I酶切的 pHAQIM連接，連接產物經包裝后轉染大腸桿菌(fecAericAia coli ) XLl Blue MR建立基因文庫。以PCR擴增的gdmN (探針1，擴增引物為5 ‘ -AAGGTGATGGGCCTGGCGCC-3 ‘ 和 5 ‘ -CGCGCGGTGCCGTCCACATG-3 ‘)和 gdmAI (探針 2，擴增弓丨物為 5' -TGCTGAGGCTGGATTGGG-3‘和 5' -ACAGAACCAGGATCAGGAGACC-3‘)基因片段為探針，通過菌落原位雜交和Southern雜交篩選陽性克隆，利用DNA酶切分析和末端序列測定將格爾德霉素生物合成基因簇定位于粘粒質粒PBS17001、pBS17002和pBS17003 (圖1A)。以 PSmart為載體分別構建了 3個序列測定質粒文庫，然后對所構建測序文庫中的插入片段進行DNA序列測定，序列經kqScape拼接后得到格爾德霉素生物合成基因簇的完整序列。2.氧-甲基轉移酶基因的驗證
借助NCBI網站的ORF finder, glimmer和BLAST等工具對格爾德霉素基因簇進行分析，推測各開放閱讀框架(open reading frame, 0RF)功能(圖IB)及格爾德霉素可能的合成途徑(圖1C)。根據氨基酸序列同源性確定可能編碼氧-甲基轉移酶的基因(^/―)，其含有三個特征性的依賴于SAM的甲基轉移酶結構域和與二價陽離子結合的D)(D)(D結構域。 以pBS17003為模板采用PCR擴增卯ferr基因(擴增引物5' -GGAATTCCATATGCCGTCCACACTG CACAC-3‘和 5' -CCCAAGCTTCAGCCGAGCCGCACACCCG-3')，克隆至載體 pET48a(+)中構建表達質粒PBS17009。將PBS17009轉化至大腸桿菌BL21中，通過IPTG誘導表達此氧-甲基轉移酶(GdmMT)，并采用親和層析純化GdmMT。純化的GdmMT在SDS-PAGE電泳中為單一條帶，表觀分子量為沈kDa,與通過序列計算的26. 2 kDa相符(圖2)。此GdmMT在SAM存在下能夠在體外催化17-去甲基格爾德霉素生成格爾德霉素，催化反應的最佳pH值為7. 0 (圖3)，最佳金屬離子為Mg2+ (圖4)。3.氧-甲基轉移酶基因敲除突變株的構建
采用Red/ET —步PCR法構建氧-甲基轉移酶基因的插入突變(圖5A)。在此方法中， 首先以PHY773為模板采用PCR擴增兩端帶有與氧_甲基轉移酶基因同源序列的aac (3) IV 基因插入盒(引物為 5 ‘ -CTATCCGGTGACCGTGTCGACCCTGAAGGAGATCGCATGATTCCGGGGATCCGTCG ACC-3‘和5' -GGCCGCCCCCGGGAACAGCGCCGTCCAGCGGAGCGCTCATGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3')， 然后通過電轉化把PCR擴增片段導入含PIJ790和目的基因即氧-甲基轉移酶基因的大腸桿菌中，篩選阿泊拉霉素(Apramycin)抗性的結合轉移子獲得插入突變基因。利用結合轉移把突變基因導入野生型自溶鏈霉菌中，通過同源重組構建氧-甲基轉移酶基因的敲除突變株SB17002。此突變株經PCR和Southern雜交驗證(圖5B)，其中PCR驗證所有引物為 5 ‘ -TGCACCCCGACTACCAGG-3 '和 5 ‘ -CGCCGGAAGAAGAATCTATCC-3 ‘，制備 Southern 雜交探針的PCR引物為 5' -GCGACTGGTCGAAGTGGTGTTC-3‘和5' -CGGTGGAGCGGCAGATTGA-3‘。 同時構建此突變株的互補菌株，以PBS17003為模板PCR擴增野生型gdmMT基因(引物為 5 ‘ -GGAATTCCATATGGGGCCTGAGATCGAGATTGC-3'和 5 ‘ -CGGGATCCTCAGCCGAGCCGCACACCCGC CAGGATG-3 ‘)，擴增片段克隆至帶有份7 俠啟動子的質粒pBS9010中，然后利用結合轉移把互補質粒導入SB17002中獲得互補菌株SB17003。4.氧-甲基轉移酶基因敲除突變株發酵產物的檢測
自溶鏈霉菌菌株的新鮮孢子接種至50 mL TSB培養基中，于^°C、250 rpm培養40小時制備發酵種子液，然后以1 %的接種量接種0.5 mL種子液至發酵培養基中(2 %豆粉，0.2 %蛋白胨，2 %葡萄糖，0.5 %可溶性淀粉，0.2 %酵母浸膏，0.4 % NaCl, 0. 05 % K2HPO4, 0.05 % MgSO4,0. 2 % CaCO3),于 28。C、250 rpm 發酵培養 5 天。發酵液離心(3500 g，30 分鐘)取上清，用乙酸乙酯抽提兩次，然后經硅膠柱層析及半制備HPLC進行純化，洗脫液蒸干后溶于丙酮并進行分析。所構建氧-甲基轉移酶基因敲除突變株失去產生格爾德霉素的能力，而產生新的化合物17-氧-去甲基格爾德霉素和17-氨基-17-去甲氧基格爾德霉素(圖6)。化合物結構經質譜和1H^3C核磁共振分析確認。 序列表
<110> 云南大學
<120>敲除氧-甲基轉移酶基因獲得格爾德霉素衍生物的方法 <130>氧甲基轉移酶 <160> 2
<170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 678 <212> DNA
<213> 自溶鏈霉菌autolyticus) <400> 1
tcagccgagc cgcacacccg ccaggatccc gtgtgcgacg ggcaggcgca gtgcgagata 60
gccgctggaggggtcggcgaggtagtcccgcatctcacggtgcatatcgaagccgaagtc120catgtccatgtcgtccacgagcaccagcgcgccccggcgcagccggggttccaccacctc180gagcaccgcgcggttgaggttgggccagccgtccatcagcaggaggtccaccgactcggg240cagctcccgcagggtctcccgtgcgtcgccgacccggacgctcgcgatgtcggagaggcc300ggcggcggcgatggcctccgtggccctggccaccttgtccgcctggagctccgtgccgat360cacctgcccgCCgCCgttgtcccgtaccgcgctggccaggtagagggtggacacgccgaa420agaggtcccgtactcgacgacggtcctggcgccggtcgcgcgggtgagcaggtagagcag480ctcaccgccttccttggacaccgacatggaggcgtccttgaacgtctcggccatctggcc540ggcatccagctcggcccaggccgccttcgggtcggtcacaccggtctcggcgaacgcgcg600ctcgtcgccttcgcgctcggcctccagcagtccgtccaggacggtcgccacgggctcggt660
gtgcagtgtg gacggcat <210> 2
<211> <212> <213> <400> Met 1
Leu
225 PRT
自溶鏈霄菌(Streptomyces autolyticus )
2
Pro Ser Thr Leu His Thr 5
Leu Glu Ala Glu Arg Glu 20
Gly Val Thr Asp Pro Lys 35
Met Ala Glu Thr Phe 50
Glu Leu Leu
Glu Pro 10
Gly Asp
25 Ala
Val Ala Thr Val 15
Glu Arg Ala Phe 30 Leu Asp
Leu Asp Gly
Ala Glu Thr
Ala Gly Gln
Gly 65
Tyr 70
Lys 55 Leu
Ala Ala Trp Ala Glu 4045
Asp Ala Ser Met Ser Val Ser Lys Glu Gly 60
Leu Thr Arg Ala Thr Gly Ala Arg Thr Val 7580
678Val Glu Tyr Gly Thr Ser Phe Gly Val Ser Thr Leu Tyr Leu Ala Ser
859095
Ala Val Arg Asp Asn Gly Gly Gly Gln Val lie Gly Thr Glu Leu Gln
100105110
Ala Asp Lys Val Ala Arg Ala Thr Glu Ala lie Ala Ala Ala Gly Leu
115120125
Ser Asp lie Ala Ser Val Arg Val Gly Asp Ala Arg Glu Thr Leu Arg
130135140
Glu Leu Pro Glu Ser Val Asp Leu Leu Leu Met Asp Gly Trp Pro Asn 145150155160
Leu Asn Arg Ala Val Leu Glu Val Val Glu Pro Arg Leu Arg Arg Gly
165170175
Ala Leu Val Leu Val Asp Asp Met Asp Met Asp Phe Gly Phe Asp Met
180185190
His Arg Glu Met Arg Asp Tyr Leu Ala Asp Pro Ser Ser Gly Tyr Leu
195200205
Ala Leu Arg Leu Pro Val Ala His Gly lie Leu Ala Gly Val Arg Leu 210215220
Gly 22權利要求
1.利用敲除氧-甲基轉移酶基因獲得格爾德霉素衍生物的方法，其特征在于構建氧-甲基轉移酶基因插入突變，獲得氧-甲基轉移酶基因突變菌株，發酵產生17-氧-去甲基格爾德霉素和17-氨基-17-去甲氧基格爾德霉素等格爾德霉素衍生物。
2.根據權利要求1所述的構建氧-甲基轉移酶基因插入突變，其特征在于采用Red/ET 一步PCR法在質粒上構建該突變基因。
3.根據權利要求1所述的構建氧-甲基轉移酶突變菌株，其特征在于采用接合轉移導入突變基因，同源重組獲得具阿泊拉霉素抗性標識的工程菌株。
4.根據權利要求1所述的產物發酵，其特征在于將氧-甲基轉移酶突變工程菌進行發酵培養，對發酵產物進行提取、HPLC檢測和質譜及1H^3C核磁共振分析。
全文摘要
本發明所提供的敲除氧-甲基轉移酶基因獲得格爾德霉素衍生物的方法涉及利用分子生物學手段敲除參與鏈霉菌活性代謝產物生物合成的基因獲得新化合物的方法。本發明克隆并測序了自溶鏈霉菌中格爾德霉素生物合成基因簇，發現并通過實驗驗證了在苯醌安莎類化合物生物合成基因簇中都未見報道的氧-甲基轉移酶基因。采用Red/ET一步PCR法構建了此基因的插入突變并通過同源重組獲得其敲除突變株。所構建的氧-甲基轉移酶基因敲除菌株發酵可獲得格爾德霉素衍生物17-氧-去甲基格爾德霉素和17-氨基-17-去甲氧基格爾德霉素，它們可作為抗腫瘤藥物或合成類似抗腫瘤藥物的前體。采用本發明所提供的方法構建工程菌合成這兩種化合物比其它方法更加經濟和環保。
文檔編號C12R1/465GK102533896SQ20111040518
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月7日 優先權日2011年6月17日
發明者尹敏, 沈奔, 趙立興, 韓§ 林, 魯濤 申請人:云南大學