專利名稱：一種用于羊口瘡病毒增殖的永久細胞系制備方法
技術領域：
本發明涉及一種用于增殖羊口瘡病毒的永久細胞系制備方法，其為一種利用犢牛睪丸細胞制備成細胞系，羊口瘡病毒利用此細胞系增殖的方法。背景技術：
背景技術：
中，羊傳染性膿皰俗稱羊口瘡(Orf virus)，是綿羊和山羊的一種由口瘡病毒所致的人獸共患傳染病，世界動物衛生組織(OIE)將該病列為需申報類動物疾病，我國將其列為一類動物疫病。本病幾乎分布于世界所有養羊國家，自然情況下主要侵害綿羊和山羊，山羊較為多發。本病常呈群發性流行，3飛月齡羔羊最易感染，成年羊發病較少，病羊和帶毒羊是本病的傳染源。病毒可隨病羊的唾液、膿皰和水皰分泌物以及脫落的痂皮排出， 其傳播途徑主要是經損傷的皮膚或黏膜而感染。健康羊與病羊直接接觸，或接觸被病羊污染的飼槽、飼料、飲水、用具、墊草、牧場及廄舍等而感染。近年來隨著我國肉用羊、毛用羊及奶山羊養殖業的迅速發展，我國已成為世界第一養羊大國，養羊業已成為我國許多地方的支柱和特色產業之一。另一方面，羊疫病，尤其是羊口瘡也成了威脅養羊業的主要疫病之一。養羊戶急需優質高效價格低廉的羊口瘡疫
田ο但目前市場上卻沒有羊口瘡疫苗可供用戶使用，造成這一問題的原因在于疫苗生產企業不愿意生產羊口瘡弱毒疫苗，因為該疫苗生產需要的細胞是犢牛原代睪丸細胞，這些細胞制備程序復雜，生產成本過高，耗費時間和財力，且難以實現有效地質量控制，企業難以獲得較豐厚的利潤。因此，研發適于羊口瘡病毒(疫苗株)增殖的細胞系有著重要的應用價值。
發明內容
本發明為了解決上述背景技術中的不足之處，提供一種用于增殖羊口瘡病毒的永久細胞系制備方法，其利用該細胞系接種羊口瘡病毒(疫苗株)，病毒達到穩定增殖目的，為羊口瘡病毒弱毒疫苗研制和生產提供了穩定的細胞環境和標準化的培養條件。為實現上述目的，本發明采用的技術方案為
一種用于增殖羊口瘡病毒的永久細胞系制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)犢牛睪丸細胞的獲取、分離與培養；(2)犢牛睪丸細胞永久化的建立；(3)羊口瘡病毒的穩定增殖。步驟(1)中，犢牛睪丸細胞的獲取為犢牛出生后未進食前采集犢牛的睪丸，低溫運輸，然后分離睪丸細胞。步驟(1)中犢牛睪丸細胞的分離為機械法或胰蛋白酶消化法。步驟(1)中犢牛睪丸細胞的培養液為M199、DMEM高糖或RPMI-1640培養基。步驟(2)中犢牛睪丸細胞永久化的建立是通過導入端粒酶逆轉錄基因方法實現的。步驟(2)中在犢牛睪丸細胞永久化的建立過程中，利用脂質體2000進行真核表達載體細胞轉染，并利用RT-PCR法檢測穩定轉染的犢牛睪丸細胞中hTERT的表達。
與現有技術相比，本發明具有的優點和效果如下
本發明分離培養犢牛睪丸細胞，達到穩定的培養條件后，轉染人端粒酶逆轉錄酶基因 (hTERT)使犢牛睪丸細胞永生化，建立犢牛睪丸細胞系。利用此犢牛睪丸細胞系接種羊口瘡病毒(疫苗株)，病毒(疫苗株)能夠在該系細胞培養環境中穩定增殖，為羊口瘡病毒弱毒疫苗研制和生產提供了穩定的細胞環境和標準化的培養系統，可用于羊口瘡疫苗的大量生產。四、附圖表說明
圖1為犢牛睪丸細胞系的培養(正常)結果； 圖2為RT-PCR檢測轉染細胞系中hTERT的表達結果； 圖3為犢牛睪丸細胞系接種羊口瘡病毒地方分離株后的細胞病變結果； 圖4為犢牛睪丸細胞系接種羊口瘡病毒疫苗株后的細胞病變結果； 五具體實施例方式
參見圖1，圖1為本發明犢牛睪丸細胞系的培養(正常)結果；參見圖2，利用RT-PCR法擴增.N為陰性對照未轉染hTERT的細胞，20和60分別為轉染hTERT的犢牛睪丸細胞傳20 代、60代hTERT表達情況，P為陽性對照。參見圖3，接種羊口瘡病毒地方分離株后的細胞病變，細胞出現空泡；參見圖4，接種羊口瘡病毒疫苗株后的細胞病變，細胞病變比較緩慢；參見表1，表1為羊口瘡疫苗毒株接種犢牛睪丸細胞系后96h的滴度測定結果。
表1為羊口瘡病毒接種犢牛睪丸細胞系后96h的涌度測定結果病毒毒株病毒涌度(TCID;:)
原代細胞犢牛睪丸細胞系
竿P雍疫苗抹陜西分離襪5.
0
1
C-5.
0
15.
0
1
-D5.
O實施例
以下實施例用于說明本發明，但不限制本發明的使用范圍。1、犢牛睪丸細胞的分離與培養
無菌條件下，Hank’ s液(雙抗)沖洗睪丸3次，無菌剪刀剪去附睪及白膜，留下睪丸實質。Hank，s液沖洗睪丸實質，直至無血液，然后將其移至無菌三角瓶內。用眼科剪將睪丸剪碎，約廣3mm大小，Hrnik，s液沖洗，靜置2_3min。棄去上清，反復洗滌3次，加入 7. 6,0. 25%的胰蛋白酶，用量為組織體積的2、倍，4°C靜置過夜。隔天后，吸去胰蛋白酶，加入M199培養液，輕輕吹打，將細胞吹散，50mL離心管離心，IOOOrpm,離心lOmin，棄去上清，加入培養液重懸細胞，調整細胞密度，37°C，5% CO2培養。2、牛睪丸上皮細胞永久化的建立
培養的犢牛睪丸細胞鋪滿培養瓶的60% 70%時，利用脂質體2000進行真核表達載體pCI-neo-hTERT (購于Addgen)細胞轉染，進行新霉素(neo)篩選培養，進行細胞擴
4大傳代。提取第20、60代轉染細胞和未轉染的細胞的總RNA，逆轉錄反應合成cDNA，利用特異性引物擴增hTERT片段和內參GAPDH，檢測hTERT的表達。hTERT引物hup 5， GCTGCTCAGGTCTTTCTTTTATG 3' ；hdown 5' CGACGTAGTCCATGTTCACAA 3，，退火溫度 55 °C; GAPDH 引物Gup :5’ GAAGGTGAAGGTCGGAGT 3’ ；Gdown 5' GAAGATGGTGATGGGATTTC 3，，退火溫度56°C。結果顯示，經過篩選轉染后的犢牛睪丸細胞傳代至60代以后，hTERT呈陽性，細胞生長呈石子路狀。
3.羊口瘡病毒的穩定增殖
取細胞系凍存細胞復蘇后，用含10%犢牛血清的1640培養基懸浮細胞，37°C，5%C02培養48h。取300 L 500 L的羊口瘡疫苗株病毒，接種細胞系，繼續培養96h，觀察病變。 待培養細胞出現空斑時，冰凍整個培養物。然后反復凍融三次后，離心，收集上清，測定病毒滴度。
權利要求
1.一種用于羊口瘡病毒增殖的永久細胞系制備方法，其特征在于包括以下步驟(1) 犢牛睪丸細胞的獲取、分離與培養；(2)犢牛睪丸細胞永久化的建立；(3)羊口瘡病毒在細胞系的增殖培養。
2.根據權利要求1所述的一種用于羊口瘡病毒增殖的永久細胞系制備方法，其特征在于步驟(1)中，犢牛睪丸細胞的獲取為犢牛出生后未進食前采集犢牛的睪丸，低溫運輸， 然后分離睪丸細胞。
3.根據權利要求1所述的一種用于羊口瘡病毒增殖的永久細胞系制備方法，其特征在于步驟(1)中犢牛睪丸細胞的分離為機械法或胰蛋白酶消化法。
4.根據權利要求1所述的一種用于羊口瘡病毒增殖的永久細胞系制備方法，其特征在于步驟(1)中犢牛睪丸細胞的培養液為M199、DMEM高糖或RPMI-1640培養基。
5.根據權利要求2所述的一種用于羊口瘡病毒增殖的永久細胞系制備方法，其特征在于步驟(2)中犢牛睪丸細胞永久化的建立是通過導入端粒酶逆轉錄基因方法實現的。
6.根據權利要求2所述的一種用于羊口瘡病毒增殖的永久細胞系制備方法，其特征在于步驟(2)中，在犢牛睪丸細胞永久化的建立過程中，利用脂質體2000進行真核表達載體細胞轉染，并利用RT-PCR法檢測穩定轉染的犢牛睪丸細胞中hTERT的表達。
全文摘要
本發明涉及一種用于羊口瘡病毒增殖的永久細胞系制備方法，其利用此犢牛睪丸細胞系接種羊口瘡病毒，達到病毒病毒能夠穩定大量增殖的目的，為羊口瘡病毒弱毒疫苗研制和生產提供了穩定的細胞環境和標準化的培養系統。本發明包括以下步驟(1)犢牛睪丸細胞的獲取、分離與培養；(2)犢牛睪丸細胞永久化的建立；(3)羊口瘡病毒在細胞系的增殖培養。
文檔編號C12R1/91GK102533660SQ201110452708
公開日2012年7月4日 申請日期2012年3月7日 優先權日2012年3月7日
發明者尚川川, 李 杰, 羅軍, 陳德坤 申請人:西北農林科技大學