專利名稱：從纖維素分解復合菌系中分離分解纖維素的厭氧菌的方法
技術領域：
本發明涉及的是微生物領域中的菌種分離方法，具體的是一種從纖維素分解復合菌系中分離分解纖維素的厭氧菌的方法。
背景技術：
目前人們可分離培養的微生物只占世界上微生物總量的1%左右，還有99%的微生物目前沒有分離得到純培養菌株。對于好氧菌的純培養的分離與純化技術自1880年Koch 發明的平板分離法以來已有130多年的歷史了，稀釋平板涂布法、稀釋混合平板法、平板劃線法、顯微操作器單細胞挑取法都是常規的分離和純化微生物的方法。前三種方法不需要特殊昂貴的儀器設備，極易操作，一般情況下都能順利進行，達到好的效果。對于厭氧微生物的分離與培養有著特殊性，主要是采取各種方法使他們處于沒有氧的環境或氧化還原點位低的條件下進行培養。對于厭氧要求相對較低的一般厭氧菌的培養主要有堿性焦性沒食子酸法、庖肉培養基法，這兩種方法是最常用的厭氧培養技術，雖然兩種方法無需特殊昂貴的設備操作簡單，適用于任何可密封的容器，可迅速建立厭氧環境，但其缺點是在氧化過程中會產生少量的有毒氣體，會抑制某些厭氧菌的生活，其中庖肉培養基法多應用于厭氧的芽孢菌的分離與保存中。對于嚴格厭氧菌的分離和培養主要有 Hungate滾管技術、厭氧罐法、厭氧手套操作培養箱，以上方法操作復雜對實驗儀器的要求也比較高并且試驗成本很高，但也有其自身的優點，就是可以保證環境的絕對厭氧，也不會產生任何有毒的物質而抑制微生物的生長。纖維素分解復合菌系是一組以高溫期堆肥為原料富集獲得的具有高效穩定分解纖維素能力的細菌復合群體(一組木質纖維素分解菌復合系的篩選及培養條件對分解活性的影響，王偉東、崔宗均、牛俊玲、樸哲、劉建斌，中國農業大學學報，9 (5) 7 11,2004), 為了研究其微生物組成，篩選出分解能力更強的菌株，需要將復合菌系進行分離，分離出具有分解纖維素功能的單菌。但是在現有研究中，得到具有分解纖維素功能的單菌比較困難， 因為纖維素分解復合菌系中具有分解纖維素功能的菌株通常為厭氧菌，并且在分離的過程中需要隨時觀察降解纖維素的能力，以上提到的幾種厭氧菌分離方法均不適宜。分解纖維素的厭氧菌的分離關鍵點在于1、單菌的分離；2、單菌功能的隨時檢測。目前一般采用 Hungate厭氧管技術，Hungate厭氧管能隨時觀察纖維素降解的情況，但不便進行單菌分離操作，易染菌，因為Hungate厭氧管體比較長，即便產生了單個菌落，菌落在挑出時難度也比較大，容易碰倒其他菌落、挑出時極易與管壁接觸，造成挑出的單菌不純，影響后續實驗； 而厭氧罐不便隨時觀察菌種降解纖維素情況。因此，需要發明一種能夠適合分解纖維素的厭氧菌的分離方法。
發明內容
本發明的目的是針對上述問題提供一種從纖維素分解復合菌系中分離分解纖維素的厭氧菌的方法，解決目前Hungate厭氧管挑出菌落困難，容易染菌，造成菌落不純以及厭氧罐法無法隨時觀察菌種降解纖維素情況的問題。本發明通過以下技術方案來實現從纖維素分解復合菌系中分離分解纖維素的厭氧菌的方法，包括以下步驟
A、將纖維素分解復合菌系用添加有濾紙的厭氧菌液體培養基在50°C培養5 8天，濾紙占厭氧菌液體培養基重量的1% 21 ；
B、取出菌液用磷酸緩沖液(以下簡稱PBS)按照1:10000 1000000的體積比進行稀
釋；
C、稀釋后的菌液用平板培養，平板為添加有纖維二糖的厭氧菌固體培養基，纖維二糖占厭氧菌固體培養基重量的0. 5% 1%，在50°C培養5 8天；
D、挑取單個菌落用添加有濾紙的厭氧菌液體培養基在50°C培養5 8天，濾紙占厭氧菌液體培養基重量的1% 21 ；
E、取能夠降解濾紙的菌液，用添加有纖維二糖的厭氧菌固體培養基在50°C培養5 8 天，纖維二糖占厭氧菌固體培養基重量的0. 5% 1% ；
所述的A、D、E步驟在Himgate厭氧管中進行，C步驟在厭氧罐中進行。重復D、E步驟3 4次。所述的濾紙被秸稈取代。采用上述技術方案的積極效果本發明根據纖維素降解實驗的實際問題，將 Hungate厭氧管和厭氧罐結合使用，用Himgate厭氧管進行平行培養，并能夠肉眼觀察秸稈或濾紙的降解情況，便于功能驗證，克服了厭氧罐法觀察不方便的問題，同時采用厭氧罐中的平板分離出單個菌落，從平板上挑出單個菌落是比較容易的，避免了菌落之間的相互接觸，防止菌落污染，單菌率更高，方便后續步驟的進行，這樣就克服了 Himgate厭氧管挑菌困難，容易產生污染的問題；本方法綜合了兩種方法的優點，適于從纖維素分解復合菌系中分離出能夠分解纖維素的功能性厭氧菌株，大大提高了分離效率。
圖1是本發明的流程示意圖2是菌落的PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠圖譜。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步的說明。實施例1
圖1是本發明的流程示意圖，如圖所示，首先在Hungate厭氧管中，將纖維素分解復合菌系用添加有濾紙的厭氧菌液體培養基在50°C培養8天，濾紙占厭氧菌液體培養基重量的 1%，取出菌液用PBS按照1:10000的體積比進行稀釋。取稀釋后的菌液涂布在平板上，平板為添加有纖維二糖的厭氧菌固體培養基，纖維二糖占厭氧菌固體培養基重量的0. 5%，于厭氧罐中在50°C培養8天。待長出菌落后，挑取單個菌落用添加有濾紙的厭氧菌液體培養基在50°C培養6天，濾紙占厭氧菌液體培養基重量的1%，篩選出能夠降解濾紙的菌液后，用添加有纖維二糖的厭氧菌固體培養基在50°C培養5天，纖維二糖占厭氧菌固體培養基重量的 0. 5%，重新產生單菌落，得到單菌，此過程均在Himgate厭氧管中進行。
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其中，厭氧菌液體培養基的配方是每Ikg中含有KCl 0. 2g，K2HPO3 3. 5g，KH2PO3 1.5g，NaCl 1. 0g，NH4Cl 1. Og, MgCl 20. 5g，酵母粉 2. 0g，蛋白胨 2. 0g，半胱氨酸 0. 5g，微量元素5g，維生素lg，刃天青lg，余量為水。其中，刃天青為指示劑，在缺氧條件下，刃天青不顯色，而一旦進入氧氣后，刃天青則顯示紅色。半胱氨酸的作用是使其與液體環境中的氧進行氧化反應生成胱氨酸進而消耗氧，保證無氧環境。厭氧菌固體培養基是在厭氧菌液體培養基的基礎上每Ikg中添加20g的瓊脂。微量元素配方為每Ikg 中含有 FeCl2 · 4H20 1. 5g，MnCl2 · 4H20 IOOmg, CoCl2 · 6H20 190mg, NiCl2 · 6H20 24mg, ZnCl2 70mg, H3BO3 6mg, CuCl2 · 2H20 2mg, NaMoO4 · 2H20 36mg，余量為水。維生素配方為每Ikg中含有核黃素0. Ig,硫胺素0. 2g，尼克酰胺0. 2g，吡哆胺 0. 5g，泛酸0. lg，生物素0. 02g，氰鈷胺素0. lg，對氨基苯甲酸0. lg，葉酸0. 05g，硫辛酸 0. 05g，余量為水。PBS 配方為每 Ikg 中含有 KCl 0. 2g, NaCl 8. 0g, Na2HPO3 1. 44g, KH2PO3 0. 24g, 1% (重量比)L-鹽酸半胱氨酸，pH為7. 4。實施例2
首先在Hungate厭氧管中，將纖維素分解復合菌系用添加有濾紙的厭氧菌液體培養基在50°C培養5天，濾紙占厭氧菌液體培養基重量的2%，取出菌液用PBS按照1:100000的體積比進行稀釋。取稀釋后的菌液涂布在平板上，平板為添加有纖維二糖的厭氧菌固體培養基，纖維二糖占厭氧菌固體培養基重量的1%，于厭氧罐中在50°C培養7天。待長出菌落后，挑取單個菌落用添加有濾紙的厭氧菌液體培養基在50°C培養5天，濾紙占厭氧菌液體培養基重量的洲，篩選出能夠降解濾紙的菌液后，用添加有纖維二糖的厭氧菌固體培養基在50°C培養6天，纖維二糖占厭氧菌固體培養基重量的1%，重新產生單菌落，此過程均在 Himgate厭氧管中進行。為了使單菌更純，挑取單個菌落用添加有濾紙的厭氧菌液體培養基在50°C培養5天，濾紙占厭氧菌液體培養基重量的2%，再取能夠降解濾紙的菌液，用添加有纖維二糖的厭氧菌固體培養基在50°C培養6天，纖維二糖占厭氧菌固體培養基重量的1%。 挑取單個菌落用添加有濾紙的厭氧菌液體培養基在50°C培養5天，濾紙占厭氧菌液體培養基重量的2%，再取能夠降解濾紙的菌液，用添加有纖維二糖的厭氧菌固體培養基在50°C培養6天，纖維二糖占厭氧菌固體培養基重量的1%。挑取單個菌落用添加有濾紙的厭氧菌液體培養基在50°C培養5天，濾紙占厭氧菌液體培養基重量的2%，再取能夠降解濾紙的菌液， 用添加有纖維二糖的厭氧菌固體培養基在50°C培養6天，纖維二糖占厭氧菌固體培養基重量的1%。挑取單個菌落用添加有濾紙的厭氧菌液體培養基在50°C培養5天，濾紙占厭氧菌液體培養基重量的洲，再取能夠降解濾紙的菌液，用添加有纖維二糖的厭氧菌固體培養基在50°C培養6天，纖維二糖占厭氧菌固體培養基重量的1%，產生單菌。其中，各種試劑的配方同實施例1。實施例3
首先在Hungate厭氧管中，將纖維素分解復合菌系用添加有秸稈的厭氧菌液體培養基在50°C培養6天，秸稈占厭氧菌液體培養基重量的1%，取出菌液用PBS按照1:1000000的體積比進行稀釋。取稀釋后的菌液涂布在平板上，平板為添加有纖維二糖的厭氧菌固體培養基，纖維二糖占厭氧菌固體培養基重量的0. 5%，于厭氧罐中在50°C培養5天。待長出菌落后，挑取單個菌落用添加有秸稈的厭氧菌液體培養基在50°C培養8天，秸稈占厭氧菌液體培養基重量的1%，篩選出能夠降解秸稈的菌液后，用添加有纖維二糖的厭氧菌固體培養基在50°C培養8天，纖維二糖占厭氧菌固體培養基重量的0. 5%，重新產生單菌落，此過程均在Himgate厭氧管中進行。為了使單菌更純，挑取單個菌落用添加有秸稈的厭氧菌液體培養基在50°C培養8天，秸稈占厭氧菌液體培養基重量的1%，篩選出能夠降解秸稈的菌液后， 用添加有纖維二糖的厭氧菌固體培養基在50°C培養8天，纖維二糖占厭氧菌固體培養基重量的0. 5%。挑取單個菌落用添加有秸稈的厭氧菌液體培養基在50°C培養8天，秸稈占厭氧菌液體培養基重量的1%，篩選出能夠降解秸稈的菌液后，用添加有纖維二糖的厭氧菌固體培養基在50°C培養8天，纖維二糖占厭氧菌固體培養基重量的0. 5%。挑取單個菌落用添加有秸稈的厭氧菌液體培養基在50°C培養8天，秸稈占厭氧菌液體培養基重量的1%，篩選出能夠降解秸稈的菌液后，用添加有纖維二糖的厭氧菌固體培養基在50°C培養8天，纖維二糖占厭氧菌固體培養基重量的0. 5%，產生單菌。其中，各種試劑的配方同實施例1。試驗例1
圖2是菌落的PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠圖譜，如圖所示，將實施例1、實施例2、實施例3中得到的單菌落，采用氯苯法提取細菌總DNA。采用細菌16S rDNA通用引物27F (5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)和 1492R (5，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，)，常規 PCR 方法擴增菌株的16S rDNA基因片段。PCR擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢查，EB染色后用凝膠成像系統照相，結果如圖2所示，M為marker，1、2、3分別代表實施例1、實施例2、實施例3，所有擴增條帶為單一條帶，無雜帶，分子量為1500bp，可以確定菌落為單菌。試驗例2
分別挑取實施例1、實施例2、實施例3中得到的單菌落，接種到添加有秸稈的厭氧菌液體培養基中，秸稈占厭氧菌液體培養基重量的2%，以沒有接菌的培養基做對照，在50°C培養。培養7天后，取出秸稈，烘干后分別稱重，實施例1、實施例2、實施例3中的秸稈分別減重55. 6%,53. 5%,49. 8%，而對照中的秸稈減重小于1. 0%。因此，篩選出的單菌表現出了很強的降解纖維素的能力。
權利要求
1.一種從纖維素分解復合菌系中分離分解纖維素的厭氧菌的方法，其特征在于該方法包括以下步驟A、將纖維素分解復合菌系用添加有濾紙的厭氧菌液體培養基在50°C培養5 8天，濾紙占厭氧菌液體培養基重量的1% 21 ；B、取出菌液用PBS按照1:10000 1000000的體積比進行稀釋；C、稀釋后的菌液用平板培養，平板為添加有纖維二糖的厭氧菌固體培養基，纖維二糖占厭氧菌固體培養基重量的0. 5% 1%，在50°C培養5 8天；D、挑取單個菌落用添加有濾紙的厭氧菌液體培養基在50°C培養5 8天，濾紙占厭氧菌液體培養基重量的1% 21 ；E、取能夠降解濾紙的菌液，用添加有纖維二糖的厭氧菌固體培養基在50°C培養5 8 天，纖維二糖占厭氧菌固體培養基重量的0. 5% 1% ；所述的A、D、E步驟在Himgate厭氧管中進行，C步驟在厭氧罐中進行。
2.根據權利要求1的所述的一種從纖維素分解復合菌系中分離分解纖維素的厭氧菌的方法，其特征在于還包括重復D、E步驟3 4次。
3.根據權利要求1的所述的一種從纖維素分解復合菌系中分離分解纖維素的厭氧菌的方法，其特征在于所述的濾紙被秸稈取代。
全文摘要
本發明涉及一種從纖維素分解復合菌系中分離分解纖維素的厭氧菌的方法，將Hungate厭氧管和厭氧罐結合使用，Hungate厭氧管用于肉眼觀察纖維素的降解情況，根據功能篩選菌株，厭氧罐中的平板分離出單個菌落。該方法綜合了兩種方法的優點，適于從纖維素分解復合菌系中分離出能夠分解纖維素的功能性厭氧菌株，大大提高了分離效率。
文檔編號C12N1/22GK102424812SQ20111045272
公開日2012年4月25日 申請日期2011年12月30日 優先權日2011年12月30日
發明者劉權, 晏磊, 溫雪, 王偉東, 王彥杰, 王艷霞, 高亞梅 申請人:黑龍江八一農墾大學