專利名稱：一種細胞分離介質及細胞分離方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種復方細胞分離介質及細胞分離方法。
背景技術：
細胞治療技術如免疫細胞治療、干細胞治療極大的推動了現代醫學技術的發展。 在細胞治療過程中，目標細胞的采集與分離是的一個重要步驟。高純度目標細胞的獲取是得到優良質量的細胞終產品即效應細胞的前提。在細胞治療過程中，除了需要用到治療用的效應細胞外，還有一類為獲取效應細胞而用到的輔助產品即細胞治療輔料，用于效應細胞的分離、生長、存儲、運輸及輸注等諸多環節，由于不在細胞治療的終產品中出現，其重要性通常被忽略。密度梯度離心法(Density Gradient Centrifugation)作為一種傳統的分離技術，用于細胞分離已經存在了半個世紀。基于密度梯度離心法的細胞分離介質產品即細胞治療輔料，例如GE公司的Ficoll-PaquePLUS，已成為利用密度梯度離心法進行細胞分離的常規介質，特別是用于淋巴細胞的分離，其說明書推薦的相應操作步驟也已成為本領域技術人員公知的操作步驟。一般步驟包括在離心管中加入一定體積的淋巴細胞分離介質，待分離的血液樣品平鋪于分離介質上，接著對其在恒定溫度下進行低速離心。樣品中各細胞群將由于密度差異分布在離心管的不同部位，例如，如果分離介質具有與目標細胞群相同的密度，目標細胞將富集在分離介質層與樣本層的交界面，用吸管將該層細胞吸出就達到了對目標細胞群的分離。由于Ficoll-Paque PLUS本身并不在終產物中出現，其屬于一種典型的細胞治療輔料。淋巴細胞作為一種效應細胞，廣泛存在于人外周血液、骨髓或人臍帶血中。高純度的淋巴細胞的獲取對于疾病的細胞學診斷、成分輸血、治療用細胞產品的制備等具有非常重要的意義。淋巴細胞分離介質是具有恒定密度、滲透壓及PH值的混合體系。國際上傳統的分離介質包括 GE Healthcare 公司的產品 Ficol 1-Paque PLUS、Ficol 1-Paque PREMIUM ；Axis-Shield 公司的產品 Lymphopi^p ；Sigma 公司的產品 Histopaque 1077 ;以及Mediatech 公司的產品Cellgro Lymphocyte Separation Medium(LSM)等。上述商品化的淋巴細胞分離介質以Ficoll 400(聚蔗糖400)和泛影酸鈉為主要成分，密度在1. 073g/ cm3 和 1. 084g/cm3 之間，滲透壓在 ^OmOsmol/kg 和 3IOmOsmol/kg 之間，pH 在 6 和 9 之間。 為了提高產品的技術標準以適應細胞治療特殊行業要求，GE Healthcare公司在2005年推出的產品Ficoll-Paque PREMIUM不僅依據IS013485 :2003將生產在受到嚴格控制的環境中進行，更是根據歐洲GMP附件1中“無菌醫藥產品的制造”和美國藥典USP<1043>關于細胞治療輔料的建議，將內毒素控制在了 0. 12EU/ml的范圍內，這個標準符合了靜脈注射用藥物對內毒素含量的要求。盡管如此，截至目前全球仍沒有一種分離介質宣稱可以用于臨床治療用途；上述產品的包裝說明書和使用指導中均明確指出該產品的適用范圍為研究而非體外診斷和治療用途。除法規因素外，產品特性不明確是限制其臨床使用的另一個重要因素。在淋巴細胞的工業化生產過程中，細胞分離介質是僅次于培養基外，與細胞接觸時間最久的外源物質。在標準的分離過程中，細胞必須與分離液接觸15-45分鐘的時間，以達到最佳分離效果。在這段時間內，分離液中各組分可能通過被動擴散、細胞的主動運輸、胞吞/胞飲作用、表面黏附等途徑，在細胞內部蓄積，且此部分蓄積成分，很難通過常規的洗滌從分離得到的目標細胞(例如淋巴細胞)中完全去除。盡管常規理化指標及菌落、內毒素等生化指標外已達到較高標準，但原料組分的不確定性給細胞分離介質的臨床應用帶來了極大的障礙。例如，Ficoll-Paque 是一套密度為1. 077g/cm3的均質混合體系，每IOOml混合液中含有5. 7g 聚蔗糖 400 (Polysaccharide 400，即 Ficoll400)、9g 泛影酸鈉(sodium diatrizoate)、0· 0231g EDTA(calcium disodium ethylenediamintetraacetic)。體系中的泛影酸鈉和EDTA分別被用于血管造影及治療血鉛中毒，其藥學相關數據已被闡明，安全性得到了保證。然而，Ficoll-Paque 臨床應用的最大障礙源于體系中的主體成分聚蔗糖 400 (Ficoll 400), Ficoll 400并無臨床應用，其毒理學、藥物代謝動力學特性均沒有相關數據支撐。密度梯度離心法分離淋巴細胞已成為生物醫學諸多領域中不可缺少的試驗技術之一，而分離介質的配方選擇是密度梯度離心法中的技術核心。早在1968年B0yum等人逐步建立了以Ficoll 400和甲泛影鈉(2，4，6-三碘-3-乙酰氨基-4-(N-甲乙酰氨基) 苯甲酸鈉)為主配方的混合分離體系(B0yum,A. Scand J Clin Lab Invest 21Suppl， 1968,97 :77-89 ； B0yum, A. Scand J Clin Lab Invest 21Suppl，1968，97 :31-50 ; B0yum,A. Scand J Clin Lab Invest 21Suppl，1976，5 :9-15 ；)，同時開發了密度梯度離心這一簡單快速的純化細胞的方法，并成功將它們用于分離人血液樣本中的白細胞。基于 B0yum等人的先驅工作成果，許多研究者將Ficoll 400-碘化密度梯度介質的混合體系進一步完善并最終該確立了利用泛影酸鈉(2，4，6_三碘-3，5-二乙酰氨基苯甲酸鈉)替代甲泛影鈉組成Ficoll 400-泛影酸鈉優化體系，該分離介質配方在世界范圍內廣泛得以應用。Ficoll 400和泛影酸鈉的選擇并不是偶然的。Ficoll 400是由蔗糖和環氧氯丙烷通過化學合成而得到的高分子量聚合物，可溶于水，其化學結構高度分支化形成球型，斯托克斯半徑為5nm左右。其化學結構決定了 Ficoll 400具有分離介質適宜的特性，比如相對密度和特性粘度。Ficoll 400最大水溶液密度可達1. 23g/cm3(陳培剛，實驗室儀器， 1990,4:9-15)，這已大于血細胞中密度最大的紅細胞，因此分離譜廣泛；而特性粘度則較低，為17ml/g，使分離過程更加高效。泛影酸鈉則是一種適宜與Ficoll 400形成低粘度高密度溶液的化合物，在醫學上用作X光造影劑。在典型的分離淋巴細胞的操作中，采用等量的平衡鹽溶液對抗凝劑(比如肝素、 枸櫞酸鈉)處理過的血樣進行稀釋，然后將其小心鋪在裝入離心管的分離介質層上，維持界面清晰。在室溫下進行短時低速離心(比如400g，30-40min)后，密度為1. 077g/cm3的淋巴細胞、單核細胞由于無法穿透密度更高的分離介質層而在血漿與分離介質層交界面處富集，而紅細胞和粒細胞則由于密度較大而沉降在離心管底部。因此，淋巴細胞和單核細胞將在血漿層和分離介質層交界面的細胞條帶處收獲，繼而通過對收獲的細胞洗滌和離心， 以除去少量的血小板、血漿和分離介質本身，得到高純度的淋巴細胞和單核細胞。在此過程中，Ficoll 400還將起到另外的關鍵性作用，即對紅細胞的凝集作用。紅細胞凝集的分子基礎為紅細胞的表面電荷。紅細胞表面分布的唾液酸(Sialic Acid)水解呈負電性，使紅細胞表面帶有負電荷，因此在等滲溶液中，紅細胞膜周圍會屏蔽一層帶相反電荷的離子層(雙電層)，并產生細胞間的靜電斥力。當雙電層被大分子的吸附作用所破壞時，這種靜電斥力也會被降低從而促使紅細胞凝集。(李萍，魏巖山，徐維家，等.，中國檢驗醫學與臨床，2001,8(4) :175-176.)紅細胞對懸液體系中的大分子有吸附作用，吸附量與大分子的種類和濃度都密切相關，當溶液中含有合適的大小、電荷分布的大分子時，相鄰紅細胞將破壞紅細胞間固有的靜電斥力而出現凝集現象，凝集會隨著大分子濃度升高而增多，并會出現飽和現象。一般而言，分子量越大，凝集現象越顯著(盛佳，曾衍鈞，莊逢源，力學進展，1999，四(1) :105-111)，綜上可知Ficoll 400具有較強的這種凝集作用。由于在全血樣品中，紅細胞比白細胞的數量高約1000倍，淋巴細胞純度和產量在很大程度上依賴于對紅細胞去除的有效性，例如，紅細胞沉降速度過快，一些淋巴細胞將被非特異性地捕獲進入紅細胞的凝塊之中，導致淋巴細胞收率降低；而紅細胞沉降速度過慢，將導致淋巴細胞產品中的紅細胞污染，或進而通過繼續延長的離心操作而導致白細胞收率降低。因此，高分子-泛影酸鈉分離介質體系中的高分子種類選擇是至關重要的，特別地，其應該具有合適的凝集紅細胞的作用，這種凝集作用必須是使紅細胞凝集速度適宜的。Ficoll 400用于構建整個體系的密度。Ficoll是一種中性的、高分支化合成蔗糖聚合物，具有高密度、低滲透壓等特點，配制Ficoll-Paque 所使用的Ficoll —般分子量在400kD左右，即Ficoll 400。Ficoll 400在分離中不表現出對細胞的毒性，但化學品安全說明書(MSDQ中的數據顯示，慢毒試驗中Ficoll 400表現出一定毒性，包括惡心、嘔吐、頭痛甚至昏迷，皮膚嚴重紅腫、水腫等。更重要是高分子量聚合物通常會引起血流動力學禾口血液流變學性質的改變(Nadia Antonova,Zdravko Lazarov,Clinical Hemorheology and Microcirculation，2004，30 (3-4) :381-390 ；李福龍，劉艷凱，牛春麗等，中國臨床康復，2006，1(K24) :91-93.等)。此外，高分子量聚合物還可能起致敏反應，并且分子量越大， 抗原性越強。Ficoll 400還作為半抗原載體，以增強小鼠對弱抗原的免疫應答反應，例如 McMasters, P. R. B.等，Immunochemistry, 1977,14 189. ；Inman, J. K. , J. Immunol, 1975, 114 :704. ；Xue, B.等，J. Exp. Med.，1984，159 :103-113. ；DeHeer, D. H.，Edgington, R. S.， Mol. Immunol.，1980，，17 :1231-1236.等。最重要地，由于Ficoll 400本身并非藥用分子， 其藥學相關數據，尤其是毒理學、藥物代謝動力學等數據尚無文獻報道。上述潛在的風險和未知因素的存在導致Ficoll 400必需受到最嚴格的控制以防進入人體。由于分離介質不可避免的會存在最終細胞產品中，必須有嚴格的洗脫步驟及殘留量檢測以證明Ficoll 400降到足夠低的水平；這些步驟提高了成本、拉長了生產周期， 提高了工業化細胞生產的復雜度。美國藥典USP<1043>關于細胞、基因和組織工程產品輔料的描述中明確將此類缺乏臨床醫用經歷的物料劃分為中等風險(Moderate Risk)范疇， 而將符合治療用藥物和生物制品的物料劃分為低風險(Low Risk)范疇。在細胞生產過程中，低風險的材料使用具有最高優先級。如果能應對Ficoll 400生物安全性不足的問題， 尋找新的替代，建設出一套符合USP<1043>要求的低風險的分離體系，將大大提高細胞治療產業中細胞分離這一步驟的安全性和規范度
發明內容
為了尋求安全性更高，分離效果更優的配方，本發明的一個主要方面是提供了一種用于單個核細胞分離的組合物，由分子量大于40kD的右旋糖酐、藥學上可接受的羥乙基淀粉與泛影酸鈉或泛影葡胺組成。以分子量大于40kD的右旋糖酐和藥學上可接受的羥乙基淀粉以組合形式替代淋巴細胞分離介質中高分子Ficoll 400的選擇，而本發明中分離介質的另一種主要原料則為泛影酸鈉或泛影葡胺。這種替代的原因在于，常規分離介質配方中的另一種組分Ficoll 400沒有任何臨床應用，原料不確定性大，安全性低，因此常規分離介質難以真正用于臨床并得到法律法規的認可。例如，以細胞治療為代表的多種臨床應用均對淋巴細胞分離介質有較大的依賴性。作為優選，所述分子量大于40kD的右旋糖酐為Dextran 70或Dextran 40。更優選地，所述羥乙基淀粉為羥乙基淀粉200/0. 5或羥乙基淀粉130/0. 4。右旋糖酐(Dextran)是一種分支化的葡聚糖，其通過一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和變形鏈球菌。Dextran分支度大約為5%，其長度在3 2000kD間變化，分支長度大約為1 2個葡萄糖單位長度。Dextran主鏈通過α _1，6糖苷鍵連接葡萄糖分子，而支鏈則通過α -1，3糖苷鍵相連。斯托克斯半徑在2 27nm之間。Dextran70的斯托克斯半徑為5. 8nm,臨床常用的制劑為6%中分子右旋糖酐含 0. 9%氯化鈉制劑，平均分子量為70kD(60kD IOOkD)，分子量最接近血漿蛋白的重量。其分子的大小范圍較廣，排出復雜，在血管內半衰期約6 他。它能從組織中吸收水分，適用于補充血容量，6%右旋糖酐500ml可增加血漿容量450 500ml，其擴容作用可持續 4h(5 幾)。臨床上主要用于防治低血容量性休克，失血量在總血容量20%以內者可全部用右旋糖酐作補充，不需輸血。羥乙基淀粉200/0. 5由高分支支鏈淀粉經酸水解、羥乙基化后制得，屬中分子量低取代度羥乙基淀粉，是一種電中性球狀分子。C2位置上的羥乙基基團對血清淀粉酶的降解具有特別強的抵抗力。分子結構與糖原相似，平均分子量(MW = 200kD)，能引起紅細胞聚集。羥乙基淀粉200/0. 5可增加血漿容量，從而改善心排血量和氧輸送值，可改善低血容量和休克患者的血液動力學和氧輸送；并能夠降低紅細胞壓積，降低血液和血漿粘滯度，同時羥乙基淀粉200/0. 5還具有減少受損毛細血管中的血漿滲漏和水腫的獨特藥理作用，這有利于將發生或已發生器官衰竭的危重患者。它具有起效快而強的擴容作用，能維持中等強度的擴容作用達4小時，能較完全地從腎臟清除，在血漿和組織中的蓄積較少。羥乙基淀粉200/0. 5 (HES200/0. 5)注射液是歐洲目前最常用的血漿代用品，為治療和預防低血容量和休克的首選藥物。羥乙基淀粉200/0. 5對小鼠的半數致死量(LD50)超過6g/kg，相當于將420g的羥乙基淀粉用于體重為70kg的患者，此劑量遠超過臨床常用劑量。狗的慢性及亞急性毒性實驗結果表明，按體重每日4g/kg的羥乙基淀粉用量，除引起臟器重量增加及組織病理顯示暫時性網狀內皮系統空泡樣變性外，對肝、脾、肺、淋巴結沒有不可逆性的毒副作用，其沒有致畸性。本發明用特定比例的兩種功能分子提供了適宜的紅細胞凝集速度，也因此實現了良好的淋巴細胞純度和淋巴細胞回收率。這種適宜的紅細胞凝集速度是兩種分子中單一的某一種分子所無法實現的，即，Dextran 70對紅細胞幾乎沒有凝集作用，這將導致細胞產品中大量紅細胞的污染；而羥乙基淀粉200/0. 5有很強的紅細胞凝集作用，這將導致紅細胞沉降速度過快，一些淋巴細胞將被非特異性地捕獲進入紅細胞的凝塊之中，導致淋巴細胞收率降低。單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞。用本發明所述單個核細胞分離的組合物配成生理溶液狀態的分離介質，對血樣樣品進行離心處理后，淋巴細胞與單核細胞將在分離介質和血漿的交界面形成比較明顯的云霧狀細胞條帶，而紅細胞、粒細胞等其它細胞將主要分布在離心管底和分離介質層。在本發明的具體實施方式
中提供的用于淋巴細胞分離的組合物Dextran 70、羥乙基淀粉200/0. 5的質量比為1 1、2 1或3 1。在本發明的另一個具體實施方式
中提供的用于淋巴細胞分離的組合物Dextran 70、羥乙基淀粉130/0. 4的質量比為1:1。在本發明的另一個具體實施方式
中提供的用于淋巴細胞分離的組合物Dextran 40、羥乙基淀粉200/0. 5的質量比為1:1。在本發明的一方面提供了一種復方淋巴細胞分離介質，用于通過密度梯度離心法分離多種樣本(人臍帶血、外周血、骨髓等)中的淋巴細胞，其特點在于全部原料均符合臨床醫用靜注級標準，具有極小的生物學毒性，并且安全性較含Ficoll 400的傳統淋巴細胞分離介質有顯著的提高，具有潛在的臨床應用價值。本發明提供的復方淋巴細胞分離介質，含有分子量大于40kD的右旋糖酐、藥學上接受的羥乙基淀粉與泛影酸鈉或泛影葡胺，該分離介質為生理溶液，其密度在1.060g/cm3 和1. 090g/cm3之間，滲透壓在^OmOsmol/kg和3IOmOsmol/kg之間，pH在6和9之間，黏度為3. 0-5. Ocp0本發明由上述原料以任意比例混合，并通過攪拌和過濾除菌后而得，使其保持生理溶液狀態，即密度在1. 060g/cm3和1. 090g/cm3之間，滲透壓在^0m0smol/kg和 3IOmOsmol/kg之間，pH在6和9之間。作為優選，本發明所述復方淋巴細胞分離介質的配方為含有0-6% (w/w)的右旋糖酐70、0-10% (w/w)的泛影酸鈉、0-6% (w/w)的羥乙基淀粉200/0. 5。更優選地，其含有1-3% (w/w)的右旋糖酐70、5-10% (w/w)的泛影酸鈉、1-3% (w/w)的羥乙基淀粉(200/0. 5)。在本發明的具體實施方式
中提供的用于淋巴細胞分離的復方淋巴細胞分離介質中Dextran 70、羥乙基淀粉200/0. 5、泛影酸鈉的質量百分比為2. 25%、2. 25%、9. 0%或 3. 0 %、1. 5 %、9. 0 % 或 2. 45 %、2. 45 %、9. 0 % 或 3. 6 %、1. 3 %、9. 0 % 或 2. 85 %、2. 85 %、 9. 0%，形成澄清透明的無色或微黃色水溶液，該溶液在20°C條件下為生理溶液狀態，該混合水溶液的主要特征密度在1. 060g/cm3和1. 090g/cm3之間，滲透壓在^0m0smol/kg和 3IOmOsmol/kg之間，pH在6和9之間。在本發明的另一個具體實施方式
中提供的用于淋巴細胞分離的復方淋巴細胞分離介質中Dextran 40、羥乙基淀粉200/0. 5、泛影酸鈉的質量百分比分別為2.45%、 2.45%、9.0%。在本發明的另一個具體實施方式
中提供的用于淋巴細胞分離的復方淋巴細胞分離介質中Dextran 70、羥乙基淀粉130/0. 4、泛影酸鈉的質量百分比分別為2. 45%, 2. 45%,9. 0%。作為優選，還含有0-0. 9% (w/w)的NaCl。作為優選，其為無菌狀態，內毒素含量< 0. 5EU/ml。本發明所述復方淋巴細胞分離介質回收的淋巴細胞純度及淋巴細胞回收率與Ficoll-Paque Premium 對照組無顯著性差異；經分離得到的淋巴細胞，在經過典型的CIK 細胞培養后，在增殖、形態學、表面標記物CD3+CD56+及對A549細胞的殺瘤活性測試四項指標中均與Ficoll-Paque Premium 對照組有相當的效果，說明其安全、有效。在本發明的另一方面還提供了所述復方淋巴細胞分離介質分離樣本細胞的方法， 其特征在于，包括以下步驟步驟1 將O-SOml所述淋巴細胞分離介質加入離心管；步驟2 再將利用抗凝劑處理過的平衡鹽溶液或無血清培養基稀釋后的樣品鋪在淋巴細胞分離介質上，在溫度為4°C -30°C進行離心。作為優選，步驟1為15ml離心管中裝入3-5ml分離介質，或50ml離心管中裝入 20-30ml分離介質。作為優選，步驟2所述稀釋的稀釋比例為1 2-2 1，優選為1 1_1 1. 5 ； 步驟2所述離心的溫度為20-25°C，在IOO-SOOg的條件下進行離心；優選的離心條件為 300-500g，離心時間為 15-30min。更優選地，所述樣品選自外周血、臍帶血或骨髓。淋巴細胞將在分離介質和血漿的交界面形成比較明顯的云霧狀細胞條帶，而紅細胞、粒細胞等其它細胞將主要分布在離心管底和分離介質層。任選地，淋巴細胞通過一定方式(比如利用移液管或其它移液器吸取)取出，并任選地經過0-2次平衡鹽溶液或無血清培養基的洗滌和離心，優選地經過1次無血清培養基洗滌和離心；最終獲得純度較高的淋巴細胞懸液。分離收獲的淋巴細胞可通過進一步處理達到其它目的，例如通過典型的CIK 細胞培養流程進行培養，并最終用于對抗腫瘤的細胞治療。本發明還提供復方淋巴細胞分離介質在疾病的細胞學診斷、成分輸血、細胞治療、 細胞產品的制備等現代生物技術領域和醫學領域的用途。典型地，本發明尤其適用于CIK 細胞的培養和相關的細胞培養和相關的細胞治療，優選地，本發明適用于用于腫瘤治療的 CIK細胞培養前的淋巴細胞富集。本發明配方中的全部原料均有符合靜注級原料藥可以購得，原料不確定性小，安全性高，且分離效果與常規分離介質沒有顯著性差異。因此，本發明為臨床醫用級淋巴細胞分離介質的誕生起到了巨大的推動作用。術語與定義如在本說明書中所用的，無論在過渡性短語或權利要求書的主體中，術語“包含” 被解釋為不定額的意義。S卩，術語被解釋為與短語“具有至少”或“包括至少”同義。當用于方法，術語“包含”意思是該方法包括至少列舉出的步驟，但還可包括另外的步驟。當用于化合物或組合物，術語“包含”意思是化合物或組合物包括列舉出的特征或組分，但還可包括另外的特征或組分。本文所用的術語“任選”或“任選地”意思是隨后描述的事件或狀況可能，但不必需發生，該描述包括事件或狀況發生的情況或不發生的情況。本文所用的，對于變量的數值范圍的列舉是為了表達本發明可實行變量等于在該范圍內的任何值。因此，對于本質上是非連續的變量，變量可以等于數值范圍的任何整數值，包括范圍的終點。同樣地，對于本質上是連續的變量，變量可以等于數值范圍的任何實際值，包括范圍的終點。舉例來說，所述的值在0和2之間的變量，對于本質上是非連續的變量可以是0、1或2，對于本質上是連續的變量可以是0.0、0. 1,0. 01,0. 001或任何實際值。細胞治療是指應用人的自體、同種異體或異種的成體或胚胎細胞經體外操作后回輸人體的治療方法。密度梯度離心法在密度梯度離心法中，需要將一種具有特定密度的分離介質預先鋪在離心管底，然后將待分離的樣本小心鋪在該介質上，隨后將離心管在一定離心條件下離心一段時間并取出，樣品中各細胞群將由于密度差異分布在離心管的不同部位，例如， 如果分離介質具有與目標細胞群相同的密度，目標細胞將富集在分離介質層與樣本層的交界面，用吸管將該層細胞吸出就達到了對目標細胞群的分離。淋巴細胞分離介質在上述描述中，用于分離淋巴細胞的分離介質稱為淋巴細胞分離介質。靜注級原料藥原料藥由化學合成、植物提取或者生物技術所制備的各種用來作為藥用的粉末、結晶、浸膏等，用于生產各類制劑的原料藥物，是制劑中的有效成分，但病人無法直接服用的物質。靜注級原料藥指用于制備靜注制劑的有效成分。CIK細胞全稱為Cytokine Induced Killer cells，即細胞因子誘導的殺傷細胞， 其由供體分離而得到的單個核細胞(MNC)在體外用多種細胞因子共同培養一段時間獲得的一群異質細胞，其主要效應細胞是CD3+CD56+雙陽性細胞，具有較強的對腫瘤細胞的殺傷作用。
圖1顯示實施例1-7制備的復方分離介質的密度；圖2顯示實施例1-7制備的復方分離介質的滲透壓；圖3顯示本發明所述復方分離介質用離心管分離人臍帶血的細胞分層；圖4顯示實施例1-7制備的復方分離介質分離人臍帶血的淋巴細胞回收率；圖5顯示實施例1-7制備的復方分離介質分離人臍帶血的淋巴細胞純度；圖6顯示實施例4-5制備的復方分離介質分離人外周血的淋巴細胞回收率；圖7顯示實施例4-5制備的復方分離介質分離人外周血的淋巴細胞純度；圖8顯示實施例4配制的分離介質分離人臍帶血中的淋巴細胞的增殖曲線；圖9顯示實施例4配制的分離介質分離人臍帶血中的淋巴細胞對A549細胞在效靶比為10 1條件下的殺傷率。
具體實施例方式本發明公開了一種復方淋巴細胞分離介質及其應用，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的復方淋巴細胞分離介質及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。為了使本領域的技術人員更好地理解本發明的技術方案，下面結合具體實施例對本發明作進一步的詳細說明。實施例1、配方A分離介質的配制
在具備局部百級層流凈化條件的環境中，在20°C下，經過無菌技術培訓的本領域技術人員使用常規方法分別將符合藥用標準的、質量比為1 IDextran 70、羥乙基淀粉 (200/0. 5)與一定量的泛影酸鈉充分溶解于滅菌注射用水，形成澄清透明的無色或微黃色水溶液，三種物質的質量分數分別為2. 25%,2. 25%,9. 0%，再經過0. 22 μ m濾膜過濾至一支無菌、無內毒素的容器內。在20°C條件下，該混合水溶液的主要特征參數包括(1)密度為1. 074g/cm3 (見圖 1，參照方法<1>) ； (2)滲透壓為生理滲透壓(見圖2，285m0sm/kg至310m0sm/kg之間)(參照方法<2 ； (3)pH在6. 0至9. 0之間；(4)黏度為3. 0-5. Ocp (參照方法<4 ；此外，該混合水溶液的特征還包括( 無菌(參照方法<5>) ； (6)內毒素
<0. 5EU/ml (參照方法 <6 。本實施例中所引用的參照6種方法適用于下面所有實施例中相應的描述，所引用的參照方法包括<1>采用U型震蕩管法測定密度，參見美國藥典USP<841>Specific Gravity MethodII ；<2>采用冰點降低法測定滲透壓，參見《中華人民共和國藥典》2010年版附錄IX G “滲透壓摩爾濃度測定法”；<3>采用電位法測定pH值，參見《中華人民共和國藥典》2010年版附錄VIH“pH值測定法”；<4>采用落球法測定動力粘度；<5>參見《中華人民共和國藥典》2010年版附錄XI H “無菌檢查法”；<6>采用鱟試劑法測定細菌內毒素，參見《中華人民共和國藥典》2010年版附錄X III D “細菌內毒素檢查法”；<7>細胞計數板法測定細胞數量，使用25X16規格的細胞計數板，由本領域技術人員按照標準流程進行操作。實施例2、配方B分離介質的配制在具備局部百級層流凈化條件的環境中，在20°C下，經過無菌技術培訓的本領域技術人員使用常規方法分別將符合藥用標準的、質量比為2 lWDextran 70、羥乙基淀粉(200/0. 5)與一定量的泛影酸鈉充分溶解于滅菌注射用水，形成澄清透明的無色或微黃色水溶液，三種物質的質量分數分別為3. 0%、1. 5%、9. 0%，再經過0. 22 μ m濾膜過濾至一支無菌、無內毒素的容器內。在20°C條件下，該混合水溶液的主要特征參數包括(1)密度為1. 074g/cm3 (見圖 1，參照方法<1>) ； (2)滲透壓為生理滲透壓(見圖2，285m0sm/kg至310m0sm/kg之間)(參照方法<2>) ； (3) pH在6. 0至9. 0之間(見圖3，參照方法<3>) ； (4)黏度為3. 0-5. Ocp (參照方法<4>)；此外，該混合水溶液的特征還包括( 無菌(參照方法<5>) ； (6)內毒素
<0. 5EU/ml (參照方法 <6 。實施例3、配方C分離介質的配制在具備局部百級層流凈化條件的環境中，在20°C下，經過無菌技術培訓的本領域技術人員使用常規方法分別將符合藥用標準的、質量比為1 lWDextran 70、羥乙基淀粉(200/0. 5)與一定量的泛影酸鈉充分溶解于滅菌注射用水，形成三種物質的質量分數分別為2. 45%,2. 45%、9. 0%的澄清透明的無色或微黃色水溶液，再經過0. 22 μ m濾膜過濾至一支無菌、無內毒素的容器內。
在20°C條件下，該混合水溶液的主要特征參數包括(1)密度為1.075g/cm3 (見圖 1，參照方法<1>) ； (2)滲透壓為生理滲透壓(見圖2，285m0sm/kg至310m0sm/kg之間)(參照方法<2>) ； (3) pH在6. 0至9. 0之間(見圖3，參照方法<3>) ； (4)黏度為3. 0-5. Ocp (參照方法<4>)；
此外，該混合水溶液的特征還包括( 無菌(參照方法<5>) ； (6)內毒素<0. 5EU/ml (參照方法 <6 。
實施例4、配方D分離介質的配制
在具備局部百級層流凈化條件的環境中，在20°C下，經過無菌技術培訓的本領域技術人員使用常規方法分別將符合藥用標準的、質量比約為3 lWDextran 70、羥乙基淀粉(200/0. 5)與一定量的泛影酸鈉充分溶解于滅菌注射用水，形成三種物質的質量分數分別為3. 6 %、1. 3 %、9. 0 %的澄清透明的無色或微黃色水溶液，再經過0. 22 μ m濾膜過濾至一支無菌、無內毒素的容器內。
在20°C條件下，該混合水溶液的主要特征參數包括(1)密度為1. 075g/cm3 (見圖 1，參照方法<1>) ； (2)滲透壓為生理滲透壓(見圖2，285m0sm/kg至310m0sm/kg之間)(參照方法<2>) ； (3) pH在6. 0至9. 0之間(見圖3，參照方法<3>) ； (4)黏度為3. 0-5. Ocp (參照方法<4>)；
此外，該混合水溶液的特征還包括( 無菌(參照方法<5>) ； (6)內毒素<0. 5EU/ml (參照方法 <6 。
實施例5、配方E分離介質的配制
在具備局部百級層流凈化條件的環境中，在20°C下，經過無菌技術培訓的本領域技術人員使用常規方法分別將符合藥用標準的、質量比為1 lWDextran 70、羥乙基淀粉(200/0. 5)與一定量的泛影酸鈉充分溶解于滅菌注射用水，形成三種物質的質量分數分別為2. 85 %、2. 85 %、9. 0 %的澄清透明的無色或微黃色水溶液，再經過0. 22 μ m濾膜過濾至一支無菌、無內毒素的容器內。
在20°C條件下，該混合水溶液的主要特征參數包括(1)密度為1.078g/cm3 (見圖 1，參照方法<1>) ； (2)滲透壓為生理滲透壓(見圖2，285m0sm/kg至310m0sm/kg之間)(參照方法<2>) ； (3) pH在6. 0至9. 0之間(見圖3，參照方法<3>) ； (4)黏度為3. 0-5. Ocp (參照方法<4>)；
此外，該混合水溶液的特征還包括( 無菌(參照方法<5>) ； (6)內毒素<0. 5EU/ml (參照方法 <6 。
實施例6、配方F分離介質的配制
在具備局部百級層流凈化條件的環境中，在20°C下，經過無菌技術培訓的本領域技術人員使用常規方法分別將符合藥用標準的、質量比為1 lWDextran 40、羥乙基淀粉(200/0. 5)與一定量的泛影酸鈉充分溶解于滅菌注射用水，形成三種物質的質量分數分別為2. 45%,2. 45%、9. 0%的澄清透明的無色或微黃色水溶液，再經過0. 22 μ m濾膜過濾至一支無菌、無內毒素的容器內。
在20°C條件下，該混合水溶液的主要特征參數包括(1)密度為1.075g/cm3 (見圖 1，參照方法<1>) ； (2)滲透壓為生理滲透壓(見圖2，285m0sm/kg至310m0sm/kg之間)(參照方法<2>) ； (3) pH在6. 0至9. 0之間(見圖3，參照方法<3>) ； (4)黏度為3. 0-5. Ocp (參照方法<4>)；
此外，該混合水溶液的特征還包括(5)無菌(參照方法<5>) ； (6)內毒素<0. 5EU/ ml (參照方法<6 。
實施例7、配方G分離介質的配制
在具備局部百級層流凈化條件的環境中，在20°C下，經過無菌技術培訓的本領域技術人員使用常規方法分別將符合藥用標準的、質量比為1 lWDextran 70、羥乙基淀粉130/0. 4與一定量的泛影酸鈉充分溶解于滅菌注射用水，形成三種物質的質量分數分別為2. 45%、2. 45%、9. 0%的澄清透明的無色或微黃色水溶液，再經過0. 22 μ m濾膜過濾至一支無菌、無內毒素的容器內。
在20°C條件下，該混合水溶液的主要特征參數包括(1)密度為1.075g/cm3 (見圖 1，參照方法<1>) ； (2)滲透壓為生理滲透壓(見圖2，285m0sm/kg至310m0sm/kg之間)(參照方法<2>) ； (3) pH在6. 0至9. 0之間(見圖3，參照方法<3>) ； (4)黏度為3. 0-5. Ocp (參照方法<4>)；
此外，該混合水溶液的特征還包括( 無菌(參照方法<5>) ； (6)內毒素 < 0. 5EU/ml (參照方法 <6 。
實施例8、分離介質的貯藏
在具備局部百級層流凈化條件的環境中，在20°C條件下，所有配制而成的分離介質樣品均貯藏于密閉的無菌玻璃或塑料容器內，并在錫箔紙包裝遮光的條件下，于常溫 (參照《中華人民共和國藥典》2010年版凡例二十一)進行保存。
實施例9、利用所配制的分離介質分離人臍帶血中的淋巴細胞及分離效果的評價
按照實施例8對所配制的復方淋巴細胞分離介質進行貯藏，將5ml上述淋巴細胞分離介質或作為對照組的Ficoll-Paque Premium 分離介質(美國GE Healthcare公司) 加入到15ml離心管(美國BD公司)，再將5ml利用抗凝劑處理過的RPMI 1640 (美國Life Technologies公司)1 1稀釋后的臍帶血樣本沿管壁小心鋪在淋巴細胞分離介質上；在溫度為20°C和400g的條件下進行離心(美國Thermo Scientific公司)30min，后停止離心，淋巴細胞與單核細胞將在分離介質和血漿的交界面形成比較明顯的云霧狀細胞條帶， 而紅細胞、粒細胞等其它細胞將主要分布在離心管底和分離介質層(見圖3)。利用移液管將血清層吸出并棄置不用，再利用移液管小心將云霧狀細胞條帶吸出，利用無血清培養基對收獲的淋巴細胞進行洗滌和離心，最終獲得純度較高的淋巴細胞懸液，將該淋巴細胞懸液進行CD45和CD14熒光標記抗體(美國BD公司)檢測，利用細胞計數板對收獲的細胞進行計數(參照方法<7>)，計算各分離介質組淋巴細胞回收率和淋巴細胞純度，并分別與 Ficoll-Paque Premium 分離介質的結果進行比較，計算各分離介質組淋巴細胞回收率和淋巴細胞純度占相應的Ficoll-Paque Premium 分離介質結果的比例，作為分離效果的評價指標(見圖4、圖幻，特別說明為每組Ficoll-Paque Premium 分離介質淋巴細胞回收率和淋巴細胞純度所占比例均記為lOO^UOO^。對試驗結果選用恰當的統計學方法(t檢驗)進行分析可知，配方A、B、C、D的淋巴細胞純度與Ficoll-Paque Premium 對照組無顯著性差異，配方A、D、E、G的淋巴細胞回收率指標與Ficoll-Paque Premium 對照組有相當的效果。實施例10、利用所配制的分離介質分離人外周血中的淋巴細胞及分離效果的評價按照實施例8對所配制的復方淋巴細胞分離介質進行貯藏，將5ml上述淋巴細胞分離介質或作為對照組的Ficoll-Paque Premium 分離介質(美國GE Healthcare公司) 加入到15ml離心管(美國BD公司)，再將5ml利用抗凝劑處理過的RPMI 1640 (美國Life Technologies公司)1 1稀釋后的新鮮人外周血樣本沿管壁小心鋪在淋巴細胞分離介質上；在溫度為20°C和400g的條件下進行離心(美國Thermo Scientific公司)30min， 后停止離心，淋巴細胞與單核細胞將在分離介質和血漿的交界面形成比較明顯的云霧狀細胞條帶，而紅細胞、粒細胞等其它細胞將主要分布在離心管底和分離介質層。利用移液管將血清層吸出并棄置不用，再利用移液管小心將云霧狀細胞條帶吸出，利用無血清培養基對收獲的淋巴細胞進行洗滌和離心，最終獲得純度較高的淋巴細胞懸液，將該淋巴細胞懸液進行CD45和CD14熒光標記抗體(美國BD公司)檢測，利用細胞計數板對收獲的細胞進行計數(參照方法<7>)，計算各分離介質組淋巴細胞回收率和淋巴細胞純度，并分別與 Ficoll-Paque Premium 分離介質的結果進行比較，計算各分離介質組淋巴細胞回收率和淋巴細胞純度占相應的Ficoll-Paque Premium 分離介質結果的比例，作為分離效果的評價指標(見圖6、圖7)，特別說明為每組Ficoll-Paque Premium 分離介質淋巴細胞回收率和淋巴細胞純度所占比例均記為100%、100%。由試驗結果可知，配方D在淋巴細胞純度和淋巴細胞回收率兩項指標中均與Ficoll-Paque Premium 對照組有相當的效果，配方E的淋巴細胞回收率指標優于Ficoll-Paque Premium 對照組。實施例11、利用所配制的分離介質分離人臍帶血而得的淋巴細胞的體外培養與觀
察將分離收獲的淋巴細胞接種于6孔板(美國CELLSTAR公司)上，通過典型的CIK 細胞培養流程進行培養，培養持續14至觀天。期間，利用細胞計數板對生長期間的細胞進行計數(臺盼藍排除法)并繪制增殖曲線(見圖8)；利用顯微鏡進行形態學觀察，并拍照存檔；對達到預設培養時間的細胞產品進行CD3和CD56，及PI熒光標記抗體(美國BD公司) 檢測，同時對A549細胞進行殺瘤活性測試，⑶3+⑶56+雙陽性細胞群比例和效靶比為10 1 條件下的殺傷率(見圖9)作為培養的評價指標。由試驗結果可知，配方D分離而得的淋巴細胞，在經過典型的CIK細胞培養后，在增殖、形態學(細胞形態、增殖團出現時間與大小)、 表面標記物(⑶3+CD56+雙陽性細胞比例)及殺瘤活性測試四項指標中均與Ficoll-Paque Premium 對照組有相當的效果，是一種安全、有效的產品。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種用于單個核細胞分離的組合物，由分子量大于40kD的右旋糖酐、藥學上可接受的羥乙基淀粉與泛影酸鈉或泛影葡胺組成。
2.根據權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述右旋糖酐為Dextran70或 Dextran 40。
3.根據權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述羥乙基淀粉為羥乙基淀粉200/0.5 或羥乙基淀粉130/0. 4。
4.根據權利要求2或3所述的組合物，其特征在于，右旋糖酐、羥乙基淀粉質量比為 1 1、2 1 或 3 1。
5.根據權利要求1-4任一項所述的組合物，其特征在于，所述單個核細胞為單核細胞或淋巴細胞。
6.一種復方淋巴細胞分離介質，其特征在于，含有分子量大于40kD的右旋糖酐、藥學上可接受的羥乙基淀粉與泛影酸鈉或泛影葡胺，該分離介質為生理溶液，其密度在1. 060g/ cm3 和 1. 090g/cm3 之間，滲透壓在 ^0m0smol/kg 和 310m0smol/kg 之間，pH 在 6 和 9 之間， 黏度為 3. 0-5. Ocp。
7.根據權利要求6所述的復方淋巴細胞分離介質，其特征在于，含有0-6%(w/w)的右旋糖酐70、0-10% (w/w)的泛影酸鈉、0-6% (w/w)的羥乙基淀粉200/0. 5。
8.根據權利要求7所述的復方淋巴細胞分離介質，其特征在于，含有1-3%(w/w)的右旋糖酐70、5-10% (w/w)的泛影酸鈉、1-3% (w/w)的羥乙基淀粉Q00/0. 5)。
9.根據權利要求6所述的復方淋巴細胞分離介質，其特征在于，還含有0-0.9% (w/w) 的 NaCl。
10.根據權利要求6-9任一項所述的復方淋巴細胞分離介質，其特征在于，其為無菌狀態。
11.根據權利要求6-9任一項所述的復方淋巴細胞分離介質，其特征在于，其內毒素含量< 0.5EU/ml。
12.—種分離樣品細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟步驟1 將O-SOml權利要求6-11任一項所述淋巴細胞分離介質加入離心管；步驟2 再將利用抗凝劑處理過的平衡鹽溶液或無血清培養基稀釋后的樣品鋪在淋巴細胞分離介質上，在溫度為4°C -30°C進行離心。
13.根據權利要求12所述的方法，其特征在于，步驟1為15ml離心管中裝入3_5ml分離介質，或50ml離心管中裝入20-30ml分離介質。
14.根據權利要求12所述的方法，其特征在于，步驟2所述稀釋的稀釋比例為 1:2-2: 1，優選為 1 1-1 1.5。
15.根據權利要求12所述的方法，其特征在于，步驟2所述離心的溫度為20-25°C，在 100-800g的條件下進行離心；優選的離心條件為300-500g，離心時間為15_30min。
16.根據權利要求12所述的方法，其特征在于，所述樣品選自外周血、臍帶血或骨髓。
全文摘要
本發明公開了一種用于單個核細胞分離的組合物及復方淋巴細胞分離介質。本發明所述復方淋巴細胞分離介質配方中的全部原料均符合靜注級原料藥標準，原料安全性高，回收的淋巴細胞純度及淋巴細胞回收率與常規分離介質對照組無顯著性差異；經分離得到的淋巴細胞，在增殖、形態學、表面標記物及殺瘤活性測試四項指標中均與對照組有相當的效果，具有良好的臨床應用前景。
文檔編號C12N5/078GK102533650SQ201110456878
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月30日 優先權日2011年12月30日
發明者丁銀巧, 樊曉翔, 趙侃, 高錦, 高長青 申請人:北京京蒙高科干細胞技術有限公司, 北京市星奧同創科技有限責任公司