專利名稱：人類多能細胞的皮層生成的制作方法
技術領域：
本發明涉及多能人類細胞中皮層生成(皮質生成，corticogenesis)的體外誘導。
背景技術：
大腦皮層(皮質，cortex)是哺乳動物中樞神經系統的綜合和執行中心，構成了超過四分之三的人類大腦(Mountcastle, V. B. The Cerebral Cortex, (HarvardUniversity Press, Cambridge, Mass. 1998)。大腦皮層的疾病是兒童和成人發病和死亡的主要原因，范圍從發育病癥如癲癇癥和自閉癥到生命晚期的神經變性病癥，如阿爾茨海默病。已對嚙齒動物模型的大腦皮層發育、功能、和疾病的基本特征進行了大量研究。然而，靈長類動物，尤其是人類大腦皮層在很多方面中與嚙齒動物不同(Finlay，B. L. etal. Science268, 1578-84(1995))。除了大腦皮層的尺寸相對于神經系統的其他部分顯著增長之外，這些還包括其發育中的干細胞群的尺寸、復雜性、和性質(Rakic，P. Nat RevNeuroscilO，724-35 (2009))，上層多樣性、后生的(later born)神經細胞類型、和深層中靈長類動物特異性神經元類型的存在的增加(Hill, R. S. et al, Nature437, 64-7(2005))。以受控的、確定的方式由胚胎干細胞和誘導的多能干細胞(統稱為多能干細胞，PSC)進行的模型化人類皮層發育的方法具有相當大的潛力，使得能夠功能性研究人類皮層的發育、電路形成、和功能，以及構建皮層疾病體外模型。考慮到大腦皮層中的許多主要疾病都是突觸功能的疾病，該領域的目標是產生極為類似于在體內發現的皮層網絡的體外皮層網絡。
大腦皮層含有兩種主要類型的神經元約80%為興奮性的、谷氨酸能(glutamatergic)投射神經元，其由皮層干細胞和祖細胞產生，而其余20%為在皮層外部產生且在發育期間移行的GABA能(GABAergic)中間神經元(Wonders, C.P et al. Nat Rev Neurosci7, 687-96 (2006))。形成成人皮層的六層的谷氨酸能投射神經元以固定的時間順序形成，首先產生深層神經元而最后產生上層神經元。在小鼠中，該過程花費約6天，而在人類皮層神經形成中持續超過70天(Caviness, V.S. , Jr et al Trends in Neurosciencesl8, 379-83 (1995))。產生后，不同類型的皮層投射神經元在皮層的各層之間形成標準局部微電路(microcircuit) (Douglas, R. J. etal. Annu Rev Neurosci27, 419-51 (2004)),以及形成較長程(longer-range)的內皮層連接和外皮層連接，包括皮層脊髓束投射、丘腦皮層和胼胝體投射(Fame，R. M.，et alTrends in neurosciences34, 41-50(2011);Lopez-Bendito, G et al Nature reviews.Neuroscience4, 276-89(2003))。盡管已顯不小鼠ES細胞能夠通過抑制音猬因子(sonic hedgehog)在神經誘導期間的信號化(信號發出，signalling)而在體外分化為大腦皮層神經元(Bibel, M. etal. Nat Neurosci7, 1003-9(2004);Gaspard, N. et al.Nature455, 351-7(2008);Eiraku, M.et al.Cell Stem Cell3，519-32(2008))，但是為模型化皮層發育做出的努力的共同問題是當深層產生時，已獲得先生的(early-born)神經元，而皮層神經形成的完整程序尚未由在培養物中的多能干細胞進行。對于來自ES細胞的人類皮質生成尤其如此，迄今為止尚未以確定的、有力的、和有效的方式達到(Au，E. et al.Cell stem cell3472_4 (2008))。已經提出這種失敗的一個原因是由ES細胞的定向分化沒有再生成在體內皮層中發現的復雜干細胞 / 祖細胞群(Hansen, D. V. et al. Neuron70, 645-60 (2011))。盡管神經上皮室帶區(室區，ventricular zone)細胞是大腦皮層的初級干細胞群/祖細胞群，但是在小鼠、貂、和人類中也識別了至少兩種次級祖細胞群、底部祖細胞/室下區細胞、以及外室下區(oSVZ)細胞。所有這三組干細胞/祖細胞顯示產生投射神經元(Hansen, D. V. , et al. Nature464, 554-561(2010);ffang, X. , et al. Nature neurosciencel4，555-61 (2011) ;Fietz, S. A. et al. Nat Neuroscil3, 690-9 (2010))，并且已經提出靈長類動物，尤其是人類大腦皮層中oSVZ細胞的數目增加，是人類皮層尺寸增加以及上層神經元類型多樣化的關鍵貢獻因素。盡管之前已經示出了在人類ES細胞的團聚體培養物中產生一些類型的皮層神經元(US20100166720A1;Eiraku, M.，et al. Cell stem cell3, 519—532 (2008);Li, X.J.，et al. Developmentl36, 4055-4063 (2009))，但是并沒有顯示音猬因子的抑制對在單層培養物中人多能干細胞的皮質生成的作用。神經干細胞和祖細胞尚未利用胚狀體中間體(intermediate)從人 ES 細胞分化(W02007142449)。
發明內容
本發明涉及開發一種誘導人多能細胞在體外以高效經受皮層生成的方法。該方法，例如，在皮層神經元，尤其是患者特異性的皮層神經元的產生；青少年和成人發作神經疾病的模型化；以及對這些疾病的治療的開發中可以是有用的。本發明的一個方面提供了一種用于體外誘導人多能細胞皮層生成的方法，包括(i)提供經分離的人多能干細胞群，(ii)在刺激視黃素信號化以及抑制TGFP和BMP信號化的培養條件下培養該群，
以便所述群分化 為皮層干細胞和祖細胞。例如，利用常規技術冷凍，可以將皮層干細胞和祖細胞保持在培養物中、儲存，或將其用于本文所述的治療或其他應用。在一些實施方式中，皮層干細胞和祖細胞可以分化為皮層神經元。該方法可以進一步包括(iii)使得皮層干細胞和祖細胞的群能夠分化為大腦皮層神經元。人多能干細胞是非特異化的、未分化的細胞，其自身能夠復制或自我更新并發育為全部三個原始胚層(即，外胚層、中胚層、和內胚層)的特異化細胞，但是不能夠發育為全部的胚胎和胚胎外組織，包括滋養外胚層(即，非全能的)。人多能干細胞不定向為神經譜系(neural lineage)。人多能細胞包括胚胎干細胞(ES)和非胚胎干細胞，非胚胎干細胞包括胎兒和成人成體干細胞和由非多能細胞來源的干細胞。適合的ES細胞可以獲自培養的hES細胞系，例如Edi2、H9、或hSF-6。在Thomson JA et al Science282:1145-1147(1998);Reubinoff et al. Nat Biotechnoll8:399-404(2000) ; Cowan, C. A. et al. N. Engl. J. Med. 350，1353-1356 (2004)，Gage,F. H. , et al. Ann. Rev. Neurosc1. 18159-192 (1995) ; and Gotl ieb (2002) Annu. Rev.Neurosci25381-407) ; Carpenter et al. Stem Cells. 5 (I) : 79-88 (2003)中描述了適合的人胚胎干細胞的其他實例；還參見可在線獲得的NIH干細胞登記表。在Klimanskaya,1. et al. Lancet365, 1636-1641 (2005);和 Ludwig, T. E. etal. Nat. Biotechnol. 24，185-187(2006)中描述了潛在的臨床級 hESC。在另一種實施方式中，人多能細胞可以是誘導的多能(iPS)細胞，其來源于非多能細胞。下文中詳細描述了 iPS細胞。人多能干細胞可表達以下多能性相關標記物中的一種或多種0ct4、SOX2、堿性磷酸酶、SSEA-3、Nanog, SSEA-4、和Tra-1-60。優選地，人多能干細胞表達0ct4。人多能干細胞不表達神經細胞標記物，如Tujl。可以利用標準技術鑒定細胞表達的標記物(包括多能性相關的標記物)，如PCR、蛋白質印記、免疫細胞化學、和原位雜交。在本方法中使用的人多能細胞群可以通過利用常規技術由多能細胞系培養細胞來獲得(乂&11161'，1.6丨 al Dev. Biol. 275, 403-421 (2004), Cowan, C. A. et al. N. Engl.J. Med. 350，1353-1356 (2004)，Joannides, A. et al. Stem Cells24, 230-235 (2006)Kl imanskaya,1. et al. Lancet365, 1636-1641 (2005) , Ludwig, T. E. et al. Nat.Biotechnol. 24，185-187(2006))。例如，適合用于本方法的人多能細胞可以在培養皿中在飼養細胞層上常規培養，這樣的飼養細胞如在適合的密度(例如IO5至IO6個細胞/60mm培養皿)下或在含有飼養物條件培養基或確定培養基(defined medium)的合適基板上的經照射的小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)。本方法中使用的人多能細胞可以通過酶促或機械方法傳代。適合用于人多能細胞的培養基包括SC培養基(Knockout杜爾貝科改良伊格爾培養基(K0-DMEM)，其用以下各項補充20%的`血清替代物、1%的非必需氨基酸、ImM的L-谷氨酰胺、0.1mM的P -巰基乙醇和4ng/ml至10ng/ml的人bFGF)和ES培養基(DMEM/F12，其用以下各項補充:20% 的 knockout 血清替代物(knockout serum replacement, KSR)、6ng/ml的FGF2 (PeproTech)UmM的L_Gln、100 u m的非必需氨基酸、100 y M的2-巰基乙醇、50U/ml的青霉素和50mg/ml的鏈霉素)。用于誘導體外皮層生成的人多能干細胞的群優選基本上不含一種或多種其他細胞類型。如上文所述，人多能細胞通常在MEF飼養細胞上培養和保持。人多能細胞可以通過任何適合的技術與飼養細胞分離。例如，可以在凝膠上簡單培養該細胞(例如，I小時)，然后將未粘附至凝膠的人多能細胞與粘附至凝膠的MEF分離。如下文所述，這避免了胚狀體的形成。在分離之后，可以在適合的培養基上在單層中培養人多能細胞，例如用IOng/ml的FGF2補充的上述SC和ES培養基。優選地，該培養基含有Rho相關含卷曲螺旋的蛋白激酶(ROCK)抑制劑(例如，IOii M)，以減少人多能細胞解離至單細胞懸液中時的細胞死亡(Olson, M. F. (2008). Curr Opin Cell Biol20:242-8;ffatanabe, K. et al. (2007) NatBiotechnol25:681-6，US2010/0009442)。適合的ROCK抑制劑是本領域公知的，并且包括(+)-4-[I (R)-氨基乙基]-N-(1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-4-基)苯甲酰胺二鹽酸鹽水合物；(IR, 4r) -4- ((R)-1-氨基乙基)-N-(吡啶-4-基)環己烷甲酰胺二鹽酸鹽；和N- (2- (2- ( 二甲基氨基)乙氧基)-4-(1H-吡唑-4-基)苯基)-2，3-二氫苯并[b] [1,4] 二噁烷-2-甲酸胺(均可獲自 Stemgent USA 或 Calbiochem USA)。
單層是在基板(如培養板的表面)上細胞的單層。人多能細胞的單層培養物使得能夠進行受控的、確定的分化，并且防止形成胚狀體。胚狀體是由干細胞的不可控分化形成的團聚體，該干細胞由各種類型的分化細胞組成，并且該團聚體由必須被進一步純化的神經細胞形成。單層還可以使得培養物長期成像。優選地，如本文所述，人多能干細胞在單層培養物中培養和分化，而不形成胚狀體。在體外皮層生成開始前，可以擴增經分離的人多能干細胞的群。例如，可以在刺激FGF2信號化的條件下在單層中培養人多能干細胞。在一些實施方式中，可以在用FGF2 (例如5至20ng/ml的FGF2，優選10ng/ml)補充的培養基中培養細胞。適合的培養基包括上述的SC和ES培養基，其可以是MEF條件培養基并且用FGF2補充的。可以采用任何哺乳動物FGF2，優選人成纖維細胞生長因子2 (FGF2) (NCBIGeneID: 2247，核酸序列 NM_002006. 3G1: 41352694，氨基酸序列 NP_001997. 4G1: 41352695)。FGF2可以利用常規重組技術產生或從供應商處獲得(例如R&D，Minneapolis, MN, USA)。優選地，在單層培養物中提供用于開始體外皮層生成的人多能干細胞的群。用于人多能細胞單層培養的方法是本領域公知的。優選地，當單層培養物中的人多能細胞為至少85%、至少90%、或至少95%匯合(SP，至少85%的培養器皿表面被細胞覆蓋)時，將誘導皮層生成。如上文所述，皮層生成開始于在刺激視黃素信號化和抑制TGF ^超家族信號化的培養條件下培養人多能 干細胞。TGF P超家族信號化是由SMAD蛋白(例如SMADI_3、SMAD5、和SMAD9)介導的，并且可以通過抑制人多能細胞中的TGF P和BMP信號化來抑制(Chambers, S.M. , et al Nat Biotechnol27, 275-280(2009), Schmierer et al Nat Rev Mol CellBiol. 2007Dec;8(12) : 970-82)。TGF P-SMAD信號化可以通過神經誘導培養基中的TGF 3和BMP信號化抑制劑來抑制。優選地，在神經誘導開始后，持續保持視黃素信號化的刺激以及TGF ^和BMP信號化的抑制，直至人多能細胞群分化為皮層干細胞和干祖細胞。例如，可以在包含一種或多種刺激或促進細胞中視黃素信號化且抑制TGF3和BMP信號化的因子的神經誘導培養基中培養該細胞。神經誘導培養基可以包含刺激人多能干細胞中的視黃素信號化的視黃素。適合的視黃素是本領域公知的并且包括視黃酸、維生素A (全反式視黃醇)、以及視黃醇乙酸酯。例如，該神經誘導培養基可以包含0. 01 ii M至10 ii M的全反式視黃醇，典型地為0. 5 ii M。用于刺激多能細胞中視黃素信號化的技術是本領域公知的(參見，例如W02008071960A2, US20070224650A、US7632679B2、W02008060792A2, W02009058451A2、US20060073587、和 W02005021720)。TGF^超家族信號化可以受到神經誘導培養基中的一種或多種TGFP-SMAD信號化抑制劑的抑制。TGF ^ -SMAD信號化抑制劑可以包括TGF ^信號化抑制劑和BMP信號化抑制劑。神經誘導培養基可以包含TGF ^信號化抑制劑。TGF ^信號化通過SMAD2和SMAD3介導的途徑發生并且可以由TGF-P I肌動蛋白受體樣激酶(ALK)ALK-4、ALK-5、和ALK-7介導(Schmierer et al Nat Rev Mol Cell Biol. 2007Dec;8 (12) :970-82)。TGFP 信號化抑制劑可以抑制SMAD2和SMAD3介導的信號化。 適合的TGF ^信號化抑制劑包括ALK4、ALK5和ALK7受體的抑制劑，如2- (5-苯并[1,3] 二氧雜戊環烯-5-基-2-叔丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶鹽酸鹽(SB-505124 )；4- [4- (1，3-苯并二氧雜環戊烯-5-基)-5- (2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺(SB431542; Tocris Bioscience USA; Stemgent USA)、和 3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-卩比唑-1-硫代酸胺(A83-01; Tocris Bioscience USA; StemgentUSA)。SB431542是一種TGF-P I肌動蛋白受體樣激酶(ALK)的抑制劑。其是選擇性的并且是ALK-4、ALK-5和ALK-7的有效抑制劑，因而阻斷BMP介導的SMAD2/3磷酸化(Laping，N.J. et al. , Mol. Pharmacol. , 62:58-64 (2002))。例如，神經誘導培養基可以包含5 ii M至20 ii M的SB431542，例如約10 U M。用于抑制人多能細胞中TGF P信號化的方法是本領域公知的(參見，例如 US7250294、US7560281、和 W020100638481 !Chambers, S. M.，et al NatBiotechnol27, 275-280(2009))。神經誘導培養基可以包含BMP信號化抑制劑。BMP信號化通過SMAD1、SMAD5、和SMAD8介導的途徑發生并且可以由TGF-P I肌動蛋白受體樣激酶(ALK)ALK-1、ALK_2、ALK_3和 ALK-6 介導(Schmierer et al Nat Rev Mol Cell Biol. 2007Dec; 8 (12) :970-82)。BMP信號化抑制劑可以抑制SMAD1、SMAD5、和SMAD8介導的信號化。適合的信號化抑制劑可以通過人多能干細胞中的SMAD1、SMAD5、和SMAD8 (也稱為SMAD9)介導的途徑抑制信號化。BMP信號化由BMPI型受體ALK1、ALK2、ALK3、和ALK6介導并且適合的BMP信號化抑制劑包括ALK1、ALK2、ALK3、和ALK6受體。
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適合的BMP信號化抑制劑是本領域公知的(Cuny et al (2008) Bioorg Med ChemLettl84388-4392;Yu et al (2008)Nat Medl41363_9)并且包括頭蛋白(noggin)、多索嗎啡(dorsomorphin)、卵泡抑素(follistatin)、抑制素、硬骨素(sclerostin)、脊索發生素(chordin)、CTGF、卵泡抑素、格姆林(gremlin)、和4-(6-(4-(哌嗪-1-基)苯基)卩比唑并[I, 5-a]嘧啶-3-基)喹啉(LDN-193189Stemgent USA)。在一些實施方式中，BMP抑制劑可以是頭蛋白。頭蛋白是一種分泌的同型二聚體糖蛋白，其結合信號化蛋白的轉化生長因子P (TGF-P)超家族成員并使其失活，這樣的信號化蛋白如，骨形態發生蛋白 4 (BMP4) (Groppe et al Nature420, 636-642)。可以使用任何哺乳動物的頭蛋白。例如，人類頭蛋白(NOG) (NCBI GeneID:9241,核酸序列 NM_005450. 4G1:189339247,氨基酸序列 NP_005441.1G1:4885523)或小鼠頭蛋白(Nog) (NCBI18121,核酸序列NM_008711. 2G1:158187522氨基酸序列NP_032737.1G1:7110675)可以利用常規重組技術生產或從供應商(例如R&DSystems, Minneapolis, MN, USA)獲得。例如，神經誘導培養基可以包含250ng/ml至1000ng/ml,例如約500ng/ml的頭蛋白。在一些實施方式中，頭蛋白可以連接至其他部分，例如，可以采用嵌合的頭蛋白分子，如小鼠頭蛋白Fe嵌合體(R&D systems)。
在其他實施方式中，BMP抑制劑可以是多索嗎啡(6-[4-[2-(1_哌啶基)乙氧基]苯基]-3-(4-吡啶基)_吡唑并[1，5-a]嘧啶二鹽酸鹽)。多索嗎啡通過抑制BMP I型受體ALK2、ALK3、和ALK6發揮作用，從而阻斷BMP介導的SMAD1/5/8磷酸化。多索嗎啡抑制胚胎發生所需的BMP信號和鐵代謝(Yu et al Nat Chem Biol4:33_41)。多索嗎啡可以從供應商(例如 Tocris Bioscience USA; Stemgent USA)處獲得。用于抑制多能細胞中BMP信號化的方法是本領域公知的(參見，例如W02008026198A2;Chambers, S. M. , et al Nat Biotechnol27,275-280 (2009))。在一些優選的實施方式中，神經誘導培養基中的一種或多種TGFP-SMAD信號化抑制劑抑制SMAD2/3介導的信號化和SMAD1/5/8介導的信號化。例如，如上文所述，該神經誘導培養基可以包含TGFP信號化抑制劑(如SB431542)和BMP信號化抑制劑(例如頭蛋白)。該神經誘導培養基可以進一步包含胰島素。這可以，例如，改善皮層干細胞和祖細胞以及神經元的存活率。例如，神經誘導培養基可以包含Iu g/ml至IOy g/ml的胰島素，例如約5 u g/mlo如上文所述，優選地，在抑制TGF ^超家族(包括TGF ^和BMP)信號化的條件下培養人多能細胞。這可以通過抑制TGFP和BMP信號化途徑來實現，并且致使人多能細胞中的全部SMAD信號化的抑制，例如由SMADl至SMAD3、SMAD5、和SMAD9介導的信號化。因此，如上文所述，適合的神經誘導培養基可以包含視黃素、TGFP信號化抑制劑、BMP抑制劑、和胰島素。 神經誘導培養基還可以包含標準神經細胞培養試劑。例如，該培養基可以包含基礎神經培養基，如用 N2 補充的 DMEM/F12 (GIBCO) (Bottenstein et all979PNASUSA761514-517; GIBC0)或用 B27 補充的 Neurobasal (Invitrogen) (GIBCO/Invitrogen)。其他適合的基礎神經培養基和補充物是本領域公知的和/或可從商業來源獲得。例如，可以使用NS21補充物(Chen et al Journal of NeuroscienceMethodsl71 (2008) 239 - 247)代替 B27。在一些實施方式中，可提供視黃素、TGFP信號化抑制劑、BMP抑制劑、和胰島素中的一種或多種作為標準培養基的部分。例如，可以提供視黃酸作為B27培養基補充物的組分。該基礎神經培養基可以根據需要用抗生素如鏈霉素和青霉素、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、和還原劑如巰基乙醇補充。適合的神經誘導培養基可以基于支持神經誘導、神經生成、和神經元分化的標準培養基。3N培養基可以包含含有N2和含有B27培養基的1:1混合物，其中，含N2的培養基包含用N2 (GIBC0)、胰島素、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、2-巰基乙醇、青霉素、和鏈霉素補充的MEM/F12 (GIBC0)，而含B27的培養基包含用B27補充物(GIBC0)、L-谷氨酰胺、青霉素、和鏈霉素補充的neurobasal (Invitrogen)。通常，N2培養基可以包含5 V- g/ml的胰島素、ImM的L-谷氨酰胺、100 U m的非必需氨基酸、IOOii M的2-巰基乙醇、50U/ml的青霉素、和50mg/ml的鏈霉素，而B27培養基可以包含200mM的谷氨酰胺、50U/ml的青霉素、和50mg/ml的鏈霉素。上文描述的3N培養基可以用TGF ^和BMP信號化抑制劑補充，以產生神經誘導培養基。哺乳動物細胞的培養是本領域公知的(參見，例如Basic Cell CultureProtocols, C. Helgason, Humana Press Inc. U. S. (150ct2004)ISBN:1588295451 ；HumanCell Culture Protocols(Methods in Molecular Medicine S.)Humana Press Inc. , U.S. (9Dec2004)ISBN:1588292223 ；Culture of Animal CelIs: A Manual of BasicTechnique,R. Freshney, John ffiley&Sons Inc (2Aug2005)ISBN:0471453293 ；Ho WYet al J Immunol Methods. (2006)310:40-52，Handbook of Stem Cells(ed. R. Lanza)ISBN:0124366430)o培養基和其成分可以從商業來源獲得(例如Gibco，Roche, Sigma, Europabioproducts, R&D Systems)。可以采用標準哺乳動物細胞培養條件，例如37° C，21%的氧、5%的二氧化碳。優選每兩天更換培養基并通過重力使細胞沉降。方便地，在涂覆有細胞外基質組分(如Matrigel )的表面上培養細胞。可以在神經誘導培養基中培養人多能干細胞5天以上、10天以上、或15天以上。例如，可培養細胞至多達15天、至多達20天、或至多達25天，通常為8至11天，以使得人多能細胞能夠轉化為皮層干細胞以及干細胞和祖細胞。在如上文所述的神經誘導培養基中培養人多能細胞誘導該細胞分化為皮層干細胞和祖細胞。例如，在神經誘導培養基中培養之后，群中的85%以上、90%以上、95%以上、或98%以上的人多能干細胞可以已分化為皮層干細胞和祖細胞。優選地，在分化開始的14天內，群中的95%以上的人多能干細胞可以已分化為皮層干細胞和祖細胞。
皮層干細胞和祖細胞是未分化的人多能干細胞的子代或后代，并且相比于原始干細胞具有定向的(committed)皮層表現型和降低的分化潛能。例如，皮層干細胞和祖細胞能夠進一步分化為任意種類或層狀命運(laminar fate)的大腦皮層神經元,例如,大腦皮層第1-6層中任一層的神經元。如本文所述的，由人多能細胞的神經誘導產生的皮層干細胞和祖細胞的群包括可以繁殖并且保留多能性的皮層細胞(皮層干細胞)和具有較多限制潛能的不必能夠自我更新的細胞(祖細胞)。皮層干細胞和祖細胞可以來自培養物中的神經上皮蓮座(玫瑰花形物，rosette).這些神經上皮蓮座在體內可以顯示出皮層神經上皮的一種或多種特征，如頂-底極性(apico-basal polarity);頂部有絲分裂(apical mitoses)和大量的室下有絲分裂(abventricular mitose)。皮層干細胞和祖細胞的群可以包括頂部(apical)皮層干細胞和祖細胞以及底部皮層干細胞和祖細胞。皮層干細胞和祖細胞可以表達Pax6。皮層干細胞和祖細胞也可以表達FoxGl、Emxl、Emx2、和C0UP-TF1中的一種或多種。皮層干細胞和祖細胞的群的子集(S卩，底部細胞)也可以表達Tbr2。皮層干細胞和祖細胞不表達多能性相關的標記物，如0ct4、Sox2、堿性磷酸酶、SSEA-3、Nanog, SSEA-4、和 Tra-1-60。該方法可以包括監測或檢測群中的細胞中的一種或多種皮層干細胞和祖細胞標記物和/或一種或多種多能細胞標記物的表達。這使得當群培養在神經誘導培養基中時，其分化或神經誘導程度能夠確定。通過本方法產生的皮層干細胞和祖細胞可以基本上不含其他細胞類型。例如，在神經誘導培養基中培養之后，細胞群可以含有80%以上、85%以上、90%以上、或95%以上的皮層干細胞和祖細胞。優選地，皮層干細胞和祖細胞的群完全不含其他細胞類型，不需要純化。在如上文所述的神經誘導培養基中培養之后，可以將皮層干細胞和祖細胞的群從神經誘導培養基中分離和/或除去。適合的技術是本領域公知的。在一些實施方式中，可以擴增皮層干細胞和祖細胞的群。用于擴增皮層干細胞和祖細胞的適合的培養條件包括刺激FGF2信號化的條件。例如，可以通過在用成纖維細胞生長因子2 (FGF2)補充的擴增培養基中培養來擴增皮層干細胞和祖細胞的群。例如，該培養基包含 10 至 40ng/ml 的 FGF2,優選 20ng/ml。適合的擴增培養基可以包括上述用FGF2補充的3N培養基。其他適合的培養基對于本領域技術人員而言將是顯而易見的。在皮層干細胞和祖細胞的產生和可選的擴增之后，可以開始皮層干細胞和祖細胞的神經發生以產生大腦皮層神經元的群。可以在促進神經發生的條件下培養皮層干細胞和祖細胞群。例如，可以在擴增培養基中培養該細胞，如不含FGF2的上述3N培養基。皮層干細胞和祖細胞的群可以培養至少40天、至少60天、至少80天、至少100天、或超過100天，或直至神經發生完成或已發生足夠量的神經發生。可以采用標準細胞培養技術。
大腦皮層神經元完全分化為功能化谷氨酸能投射神經元。大腦皮層神經元可以表達選自由 Tbrl、CTIP2、CuxU Satb2、Brn2、reelin、FezfU Fezf2、Sox5、Bhlhb5、Pou3fl、和Otxl組成的組中的一種或多種標記物(參見，例如Molyneaux et al. , Nat RevNeurosc1. 2007Jun;8(6):427-37)。該方法可以包括監測或檢測群中細胞中的一種或多種大腦皮層神經元標記物和/或一種或多種皮層干細胞和祖細胞標記物的表達。大腦皮層神經元可以是任何種類。例如，神經元可以是皮質層6、皮質層5、皮質層4、皮質層3、皮質層2、或皮質層I神經元。可以通過神經元類型標記物的表達來鑒定不同種類的大腦皮層神經元。例如，層I神經元表達絡絲蛋白；層2/層3神經元表達Brn2 ;層2-層4神經元表達Cuxl和Satb2 ；層5神經元表達CTIP2、Pou3fl/SCIP或Otxl ;層5皮質脊髓運動神經元表達CTIP2而不表達Tbrl ；以及層6神經元表達Tbrl和Fezf2。可以通過任何適合的技術來測定神經元類型標記物的表達，包括免疫細胞化學、免疫熒光、和RT-PCR。在皮層干細胞和祖細胞的分化開始后，例如超過80天、90天、或100天，可以逐漸產生不同類型的大腦皮層神經元。在一些實施方式中，深層6神經元在層5皮質脊髓運動神經元之前分化，隨后出現表面層(層2-層4)神經元的分化。可以產生大致相等量的深層和表面層神經兀。可以培養細胞直至產生所需種類的大腦皮層神經元。如上文所述，可以通過檢測神經元種類標記物的表達來監測存在于細胞培養物中的該類神經元。在一些實施方式中，可以通過，例如，向培養基中加入FGF2或從培養基中取出FGF2以減慢特定神經元細胞種類的出現來控制神經發生的速率。方法可以包括從細胞培養物中分離特定種類的神經元的群。例如，可以分離皮質層6、皮質層5、皮質層4、皮質層3、皮質層2、或皮質層I神經元的群。這些神經元在下述的治療或其他應用的范圍中可以是有用的。在一些優選的實施方式中，可以分離皮質層5神經元的群。這些包括在治療或模型化脊髓損傷和運動神經元疾病或篩選這些病癥的治療中特別有用的皮質脊髓運動神經
J Li o由本發明方法產生的皮層神經元，尤其是特定種類或子集的皮層神經元，如皮質脊髓運動神經元，可以基本上不含有其他細胞類型。在一些實施方式中，可以利用本領域技術人員公知的任何技術從細胞培養物中的其他細胞類型和種類中分離關注的皮層神經元，這樣的技術包括基于通過抗體、或磁珠、或突光活化細胞分選(FACS)來識別胞外表位如神經元種類標記物的技術。如所述產生的大腦皮層神經元顯示出功能化的電生理學性質，并形成神經元突觸。例如，通過檢測微興奮性突觸后電位(mEPSP)的存在或突觸囊泡素(synaptophysin)*疫熒光的焦距的存在可以確定大腦皮層神經元的群的興奮性突觸性質。這可以利用標準技術來進行。如上文所述，人多能干細胞可以是誘導的多能干(iPS)細胞。iPS細胞是來 源于非多能的、完全分化的祖細胞的多能細胞。適合的細胞包括成人成纖維細胞和外周血細胞。祖細胞通常通過引入多能基因或蛋白，例如向細胞中引入0ct4、Sox2、和Soxl而被重新編程。可以通過任何適合的技術向經分化的細胞中引入該基因或蛋白，這樣的技術包括病毒或質粒轉染或直接蛋白遞送。也可以向細胞中引入其他基因，例如 Kif 基因，如 Kif-1、Kif-2、Kif_4、和 Kif-5 ；Myc 基因，如 C_myc、L_myc、和N-myc ；nanog ;以及Lin28,以增加誘導效率。在引入多能基因或蛋白之后，可以對該祖細胞進行培養。可以分離和/或純化表達多能性標記物的細胞以產生iPS細胞的群。用于產生 iPS 細胞的技術是本領域公知的。(Yamanaka et al Nature2007;448:313-7;Yamanaka62007Jun7;I(I):39-49. Kim et al Nature. 2008Jul31;454(7204):646-50;TakahashiCell. 2007Nov30;131 (5):861-72. Park et al Nature. 2008Janl0;451(7175):141-6;Kimetal Cell Stem Cell. 2009Jun5;4(6):472-6)。在一些實施方式中，iPS細胞可以來源于獲自個體的健康細胞，S卩，沒有疾病相關的表現型或基因型的細胞。在一些實施方式中，細胞可以獲自具有損傷的或功能障礙的皮層神經元的患者，例如患有神經疾病、頭部外傷、多發性硬化癥、中風、或脊髓損傷的個體。由這些細胞產生的皮層神經元在對該患者的治療中可以是有用的。在一些實施方式中，iPS細胞可以是疾病特異性iPS細胞。疾病特異性iPS細胞可以來源于來自個體的疾病相關的細胞，即，具有與疾病相關的表現型或基因型的細胞，例如神經疾病，如偶發性或家族性阿爾茨海默病、家族性或偶發性癲癇、自閉癥、精神分裂癥、和腦癱。用于產生iPS細胞的疾病相關的細胞可以獲自患有神經疾病或易患神經疾病或處于患神經疾病風險中的個體。神經疾病包括與損傷的或功能障礙的皮層神經元相關的疾病，如偶發性和家族性阿爾茨海默病、家族性和偶發性癲癇、自閉癥、精神分裂癥和腦癱。在一些優選的實施方式中，神經疾病為青少年或成人發作的神經退行性疾病。如本文所述，疾病特異性iPS細胞可以分化以產生皮層神經元的群，其在神經疾病的模型中是有用的。尤其是，由如本文所述的疾病特異性iPS細胞產生的皮層神經元在短時間范圍(即，數周或數月)內可以顯示出疾病病狀(病理，pathology)。這有利于篩選治療分子。在一些優選的實施方式中，人多能干細胞是唐氏綜合癥iPS細胞(DS-iPS細胞)。DS-1PS細胞是來源于獲自患有唐氏綜合癥的個體的細胞的iPS細胞(Park，1. H.，et alCelll34, 877-886(2008))。唐氏綜合癥/21三體綜合癥是人心智障礙的共有的基因原因(Wiseman, F. K et alHum Mol Genetl8,R75-83(2009))o患有唐氏綜合癥的個體具有非常高的阿爾茨海默病發病率，這是由于在第21號染色體上存在淀粉樣前體蛋白(APP)基因(Rumble，B.，et al. NEngl J Med320, 1446-1452(1989);Selkoe, D. J. Biol Chem271, 18295-18298(1996))。如本文所述在DS-1PS細胞中進行皮層生成的體外誘導將導致產生帶有第21號染色體的額外復制的大腦皮層神經元。這些大腦皮質神經元在細胞培養物中顯示出AD病狀。例如，源于DS-1PS的皮質神經元產生高水平的淀粉樣前體蛋白(APP)的A P 42片段，形成胞內和胞外淀粉樣斑，并顯示出程序化細胞死亡速率的增加。產生具有AD病狀的皮層神經元的方法可以包括如上文所述體外誘導DS-1PS細胞群的皮層生成，從而產生具有AD病狀的皮層神經元的群。來源于DS-iPS的皮層神經元可以在從DS-iPS細胞或來源于其的儲存皮層干細胞分化開始后的1、2、3、4個月以上之內顯示出AD病狀。產生后，可以培養和保持具有AD病狀的皮層神經元，例如用于篩選。保持具有AD病狀的皮層神經元的方法可以包括如上文所述，對來源于DS-1PS的皮層神經元的群進行培養。培養神經元的方法是本領域公知的。該方法可以進一步包括測量或檢測所述細胞中的一種或多種AD病狀。AD病狀包括增加的AP 42的表達水平；增加的AB42與AB40 (無毒形式)之比；增加的神經元中的AB42水平；增加的胞外培養基中的Ab42水平；增加的AB42低聚體形成；增加的超磷酸化Tau的水平；增加的胞內鈣水平；增加的胞內或胞外淀粉樣斑的形成；以及增加的程序化細胞死亡的速率。例如，這在下文中更詳細描述的篩選方法可以是有用的。患有唐氏綜合癥的個體可以表現出提早老化。如本文所述，在DS-iPS細胞中皮層生成的體外誘導致使產生在研究衰老和年齡相關認知能力衰退中有用的大腦皮層神經元。產生具有年齡相關病狀的皮層神經元的方法可包括如上所述，體外誘導DS-iPS群的皮層生成，從而產生具有年齡相關病狀的皮層神經元的群。來源于DS-1PS的皮層神經元可以在從DS-iPS細胞或來源于其的儲存皮層干細胞分化開始后1、2、3、4個月以上之內表現出與年齡相關的病狀。產生后，可以培養和保持具有年齡相關病狀的皮層神經元，例如用于篩選。保持具有年齡相關病狀的皮層神經元的方法可以包括如上文所述，對來源于DS-1PS的皮層神經元的群進行培養。年齡相關病狀可以包括減緩的生長、增加的程序化細胞死亡速率、降低的突觸活性、和降低的興奮活性。本發明的其他方面提供了通過上述的體外皮層生成方法產生的經分離的大腦皮層神經元或經分離的皮層干細胞和祖細胞，以及通過上述的體外皮層生成方法產生的經分離的大腦皮層神經元或經分離的皮層干細胞和祖細胞的群。經分離的大腦皮層神經元的群可以包含80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、或99%以上的具有功能性興奮性質的谷氨酸能投射神經元。該群可以包含低于1%的中間神經元，優選無中間神經元，或通過免疫細胞學檢測不到的中間神經元。經分離的皮層干細胞和祖細胞的群可以包含80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、或99%以上的皮層干細胞和祖細胞。通過本文所述的方法產生的皮層干細胞和祖細胞為背側端腦細胞(dorsaltelencephalic cell)(即，它們對皮層組織是特異性的)。通過本文所述地方法產生的皮層干細胞和祖細胞的群不含有后腦或脊髓干細胞和祖細胞。在一些優選的實施方式中，神經元或干細胞和祖細胞由來源于具有功能障礙(例如，損傷或患病)的大腦皮層的iPS細胞`產生。這些皮層干細胞和祖細胞或神經元可以用于對患者進行治療。例如，可以給予皮層細胞以替換具有功能障礙的大腦皮層的個體(即，具有患病的或功能障礙的皮層神經元的個體)中的損傷皮層神經元。本發明的其他方面提供了由本文所述的方法產生的皮層干細胞和祖細胞或皮層神經元的群，用于對人體或動物體進行治療的方法，例如用于對具有功能障礙的大腦皮層的患者進行治療，以及通過本文所述方法產生的皮層干細胞和祖細胞或皮層神經元的群在制備用于治療功能障礙的大腦皮層的藥物中的應用。具有功能障礙的大腦皮層的個體可以患有與損傷的或功能障礙的皮層神經元相關的疾病，如偶發性和家族性阿爾茨海默病、家族性和偶發性癲癇、自閉癥、精神分裂癥、運動神經元疾病、腦癱、多發性硬化癥、或中風，或可以患有大腦或脊髓經受的損傷或外傷。例如，如上文所述產生的皮質脊髓運動神經元(層5)可以用于治療脊髓損傷。優選地，用于對個體進行治療的皮層干細胞和祖細胞或皮層神經元的的群由來源于獲自該個體的細胞的iPS細胞產生。優選地，用于治療應用的本文所述的皮層干細胞和祖細胞或皮層神經元是臨床級細胞。可以基因操作給予個體的皮層干細胞和祖細胞或皮層神經元的群以產生治療分子，例如，藥物或生長因子(Behrstock S et al, Gene Ther2006年3月;13 (5):379-88, Klein SM et al, Hum Gene Ther2005Apr;16 (4):509-21)D藥物組合物、藥物、藥品、或其他組合物可以包含皮層干細胞和祖細胞或皮層神經元的群，以及藥用賦形劑、載體、緩沖劑、防腐劑、穩定劑、抗氧劑、或本領域技術人員公知的其他物質。載體或其他物質的準確性質將取決于給予途徑。藥物組合物可以通過將皮層干細胞和祖細胞或皮層神經元的群與藥用賦形劑、運載體、或載體，以及可選的一種或多種其他成分混合而產生。該組合物可以給予患者，例如，用于治療(可以包括預防性治療)上述的功能障礙的皮層組織。液體藥物組合物通常包括液態載體，如水、石油、動物或植物油、礦物油或合成油。可以包括生理鹽水溶液、組織或細胞培養基、葡萄糖或其他糖類溶液或二醇類如乙二醇、丙
二醇、或聚乙二醇。該組合物可以是腸胃外用含水溶液的形式，其是無熱原的并且具有適合的pH、等張性、和穩定性。相關技術領域的技術人員能夠利用，例如，等張載體如氯化鈉、林格氏注射液、或乳酸化林格氏注射液來制備適合的溶液。可以利用人造腦脊流體來制備組合物。可以通過本領域公知的任何技術將細胞灌注到患者體內(例如，Lindval I, 0. (1998) Mov. Disord. 13, Suppl. 1:83-7 ; Freed, C. R. , et al. , (1997)Ce 11 Transplant,6，201-202;Kordower,et al. , (1995)New England Journalof Medicine,332, 1118-1124;Freed, C. R. , (1992)New England Journal ofMedicine, 327, 1549-1555, Le Blanc et al, Lancet2004Mayl;363(9419):1439-41)。根據本發明的組合物的給予優選為“預防有效量”或“治療有效量”(即使可以認為預防是治療也是如此)，這足以對該個體表現出益處。實際給予的量以及給予的速度和時程將取決于待治療疾病的性質和嚴重程度。治療的藥方，例如，對劑量的確定等，在全科醫生和其他醫生的職責范圍內。可以單獨地或與其他治療結合同時或順次地給予組合物，這取決于待治療的病癥。在其他的優選實施方式中，神經元、皮層干細胞和祖細胞、或它們的群來源于疾病特異性iPS細胞，例如，DS-1PS細胞。神經元或干細胞和祖細胞或它們的群可以顯示出神經退行性疾病的病狀，如胞內或胞外蛋白團聚或增加的凋亡。例如，來源于DS-1PS細胞的神經元或干細胞和祖細胞可以表現出AD病狀。表現出神經退行性疾病病狀的細胞在篩選在治療方法的開發中可以有用的活性化合物中可以是有用的。本發明的其他方面涉及上文所述的產生的大腦皮層神經元在篩選具有治療活性的化合物的方法中的應用，該化合物在治療疾病，如神經退行性疾病中可以是有用的。篩選在治療神經疾病中有用的化合物的方法可以包括使通過上文所述的方法產生的經分離的 大腦皮層神經元與測試化合物接觸，以及測定該測試化合物對所述神經元的影響。例如，可以測定測試化合物對神經元細胞死亡/存活、生長、增殖、條件、團聚、電活性、突觸活性、和/或基因表達的影響。在一些實施方式中，篩選在神經退行性疾病的治療中有用的化合物的方法可以包括，在存在和不存在測試化合物下，測定神經毒素對通過上述方法產生的經分離的大腦皮層神經元的影響。
減少或改善神經毒素對神經元的影響的測試化合物在治療神經退行性疾病或開發治療方法中可以是有用的。神經毒素可以包括與神經退行性疾病相關的易團聚蛋白(aggregation proneprotein),如 AB42。如本文所述產生的大腦皮層神經元，例如，在毒性測試中也可以是有用的。在一些實施方式中，測定化合物的神經毒性的方法可以包括，使該化合物與通過上文所述的方法產生的經分離的大腦皮層神經元接觸，以及測定該測試化合物對所述神經元的影響。可以將改變，例如 增加或減少神經元細胞死亡/存活、生長、增殖、條件、團聚、電活性、突觸活性、和/或基因表達的化合物確定為神經毒素。優選地，神經元或干細胞和祖細胞來源于疾病特異性iPS細胞，例如，來源于獲自患有與損傷的或功能障礙的皮層神經神經元相關疾病的個體細胞的iPS細胞，這樣的疾病，如偶發性和家族性阿爾茨海默病、家族性和偶發性癲癇、自閉癥、精神分裂癥、和腦癱。來源于疾病特異性iPS細胞的神經元或干細胞和祖細胞可以顯示出神經疾病病狀，如異常的突觸活性或電活性、胞內或胞外蛋白團聚、異常的基因表達、或增加的細胞死亡。可以測定該測試化合物對神經疾病病狀的影響。減少或抑制該病狀的化合物可以確定為在神經疾病的治療或針對神經疾病的治療方法的開發中是潛在有用的。神經病狀，如阿爾茨海默病病狀可以在分化開始后的1、2、3、4、5、或6周以上之內進行測量。可以在超過1、2、3、4、5、或6周以上測量這些病狀以確定測試化合物的影響。在一些優選的實施方式中，篩選用于治療阿爾茨海默病的化合物的方法可以包括，使通過上述方法由DS-1PS細胞產生的經分離的大腦皮層神經元與測試化合物接觸，以及測定該測試化合物對所述神經元的影響。例如，可以測定該測試化合物對一種或多種阿爾茨海默病病狀的影響，如A 3 42的表達水平、AB42與AB40 (無毒形式)之比；神經元中的AB42水平；胞外培養基中的Ab42水平；AB42低聚物的形成；超磷酸化Tau的水平；胞內鈣水平；胞內和胞外淀粉樣斑的形成；以及程序化細胞死亡的速率。相對于沒有用測試化合物處理的對照細胞，任何的這些病狀的減少都可以指示該測試化合物顯示出抗AD活性以及在治療阿爾茨海默病和/或開發AD治療方法中可以是有用的。可以利用標準技術來測定阿爾茨海默病病狀，如AB42與AB40(無毒形式)之比；神經元中的AB42水平；胞外培養基中的AB42水平；AB42低聚物形成；超磷酸化Tau的水平；胞內鈣水平42的表達水平；胞內和胞外淀粉樣斑的形成；和/或程序化細胞死亡的速率。例如，可以通過用硫黃素T類似物BTAl24進行活細胞染色來測定淀粉樣斑的發展。本文所述的方法可以包括確定減少或改善皮層神經元中的一種或多種神經疾病病狀的步驟。減少神經疾病病狀的化合物是用于治療神經疾病或用于設計這樣的化合物的候選化合物。在確定減少或改善皮層神經元中的一種或多種神經疾病病狀的化合物之后，該方法可以進一步包括改變該化合物以使其藥學性質最優化。這可以通過上文所述的模型化技術進行。可以利用一次或多次次級篩選來評價利用一次或多次初級篩選確定為能夠減少或改善皮層神經元中的一種或多種神經疾病病狀的測試化合物。次級篩選可以包括，例如，在動物模型中的生物功能或活性的體外和/或體內測試。例如，可以測定測試化合物在疾病的動物模型中減少或改善與神經疾病相關的一種或多種癥狀或病狀的能力。在對減少或改善皮層神經元中的一種或多種神經疾病病狀的測試化合物進行確定之后，可以分離和/或純化該化合物或可替換地，其可以利用重組表達或化學合成的常規技術來合成。此外，可以制備其和/或其可以用于制備，即生產或配制諸如藥物、藥物組合物、或藥品的組合物。可以將這些給予個體以治療神經疾病。根據本公開，本發明的各種進一步的方面和實施方式對于本領域技術人員而言將是顯而易見的。本說明書中提到的所有文檔和數據庫都以其全部結合于本文作為參考。本文中提到的細胞標記物都為本領域公知的，并且所有的細節可容易地從公共數據庫獲得，如在線NCBI數據庫。用于檢測這些標記物的表達的抗體可以通過常規技術來產生以及從可商業來源獲得(例如Abeam Ltd, Cambridge UK)。應認為本文中使用的“和/或”具體公開了兩個具體特征或組分包括或不包括另一個中的每一個。例如，應認為“A和/或B”具體公開了(i) A、(ii) B、和(iii) A和B，就像它們中的每一個在本文中單獨給出一樣。除非上下文中明確指出，否則對上述特征的描述和限定不應限于本發明的任何特定方面或實施方式，而是等同地適用于所描述的所有方面和實施方式。
現在通過實例的方式并且參照以下附圖和表格來說明本發明的某些方面和實施方式。圖1示出了室帶區干細胞和祖細胞表達的轉染因子Foxgl的定量RT-PCR，其證實了皮層干細胞的誘導在5天后開始，并在20天后出現峰值，而表達Tbr-2的細胞在差不多一周后出現。誤差條，s. e. m.。圖2示出了表達0ct4的hES細胞在15天的神經誘導期內以高效分化為表達Pax6的神經干細胞。星號表示在第0天不存在可檢測的表達Pax6的細胞，并且在第15天不存在表達0ct4的細胞。誤差條，s. e. m. , n=3個在第15天表達Pax6的細胞的樣品。圖3示出了定量的皮層誘導效率，如在存在或不存在視黃素下，在兩個hESC細胞系和四個hiPSC細胞系中通過表達Pax6的細胞的百分比(利用DAPI檢測的核的百分比)估算的。值是每一個細胞系的三種培養物的平均值。誤差條，s.e.m.。圖4示出了在皮層蓮座中發現的Tbr2+Ki67+細胞的定量比例分析一來源于不同的hESC和hiPSC系的蓮座中15%至20%的細胞表達Tbr2+。Tbr2+群的約40%為Ki67+循環(cycling)祖細胞。圖5示出了在皮層蓮座中發現的Tbr2+細胞的定量比例一來源于不同的hESC和hiPSC系的蓮座中15%至20%的細胞表達Tbr2+。
圖6示出了培養物中從hESC的神經元分化的時程到第35天時，培養物中約70%的細胞為表達Tujl的神經元。在每一時間點從n=3個培養物計數。誤差條，s.e.m.。圖7示出了表達0ct4的hES細胞(A、C、E)在15天的間隔內分化為表達Pax6的皮層干細胞和祖細胞(B、D、F)。標尺，IOOii m。圖8示出了來源于hES的皮層干細胞和祖細胞形成增殖細胞(Ki67)的極化神經上皮蓮座，在該增殖細胞(Ki67)中在中心腔(i中的星號；j中的白色箭頭指示頂部有絲分裂)附近發生了許多有絲分裂(磷酸化組蛋白H3)，該中心腔由神經上皮細胞的頂部表面形成(⑶133，j)。通常也發現有腦室有絲分裂(j中的黃色箭頭)。圖9示出了蓮座中增殖的Ki67陽性細胞的子集表達SVZ特異性轉錄因子Tbr2(白色箭頭，k)。然而，大多數表達Tbr2的細胞都是新生的表達雙腎上腺皮質激素(Dcx)的神經元(白色箭頭，I)。標尺j、m :100 u m ；k> I 50 u m0圖10示出了從人ES細胞的皮層神經發生的順序再現了正常的發育。深層和上層神經元以時間順序由hESC產生，在第2/3層神經元(Brn2)之前產生第5層和第6層神經元(Tbrl和CTIP2)。N=3個培養物 ，對每一種標記物進行評分。誤差條，s. e. m.。圖1la示出了基于小鼠的數據，成人皮層的各層中皮層投射神經元種類的圖，具有在每一種所示的神經元中表達的轉染因子。CPN，扣帶(callosal)投射神經元。圖1lb示出了由hESC先生和后生的皮質神經元的分化。第6層的皮質丘腦投射神經元(表達Tbrl/CTIP2的神經元，g、i)和第5層的皮質脊髓運動神經元(CTIP2陽性，Tbrl陰性神經元，h，i)中的白色箭頭)都存在。j)至k)示出了來自hESC的上層后生皮質神經元的分化。這些神經元表達Cuxl、Satb2、和Brn2。標尺g_l:50iim。圖12示出了由人ES細胞和iPS細胞系產生的不同種類的皮層投射神經元的相對比例。從所有的系產生大致相等比例的深層和上層神經元。圖13至圖17示出了從hESC體外產生功能化人皮層興奮性神經元，再現了體內發育。圖13示出了由hES細胞有效產生大量具有豐富神經突(b)的神經元(表達Tujl，a)。幾乎所有的神經元都是谷氨酸能的，如通過細胞體和神經突中存在囊泡膜谷氨酸轉運體所證實的(白色箭頭，C)。標尺50iim (a)>25 u m (b)> 10 u m (C)。圖14示出了人類來源于ES的皮質神經元體外成熟以發出自發性動作電位(d，n=3神經元)。成熟皮層神經元在電流注入后保持動作電位的運行，如對于來源于培養物中的hES的皮層神經元所觀察到的(e，n=21神經元)。通過存在頻繁的mEPSP證明了這些神經元也形成功能化突觸(f，n=12神經元)。圖15示出了來源于多能干細胞的皮層神經元顯示出分化以獲得成熟電生理學性質。圖15A和圖15B示出了來源于PSC的皮層神經元中的電壓門控性鈉和鉀通道。響應于從-80mV至+40的保持電位的一步去極化的家族的電流是疊加的。在圖15A中，通過施加TTX完全阻斷快速活化并使鈉內向電流失活。在圖15B中，4-AP阻斷外向K電流的快速活化瞬時部分。圖15C示出了來源于PSC的皮層神經元隨時間成熟的電生理學性質，如通過響應于一步電流注入發出改變動作電位例證的。圖1 和圖15E示出了來源于hESC和hiPSC的皮層神經元響應于一步電流注入產生有效的規則峰形行為(regular-spiking behaviour)。圖16示出了在記錄來源于hESC (Dl)或hiPSC (D2)的皮層神經元的全細胞中的mEPSC檢測。在每一種情況下，AMPA受體拮抗劑CNQX阻斷mEPSC的出現。圖17示出了來自來源于hESC (n=20個事件；El)和hiPSC (n=20個事件；E2)的皮層神經元的平均mEPSC。在每一種情況下，mEPSC具有AMPA介導的迅速發作(箭頭)和緩慢衰減(箭頭)的特征。圖18至圖31示出了唐氏綜合癥iPS細胞向功能化皮層投射神經元的定向分化。圖18示出了在15天的間隔內，極化的神經上皮蓮座(D-F)中的表達0ct4的DS-1PS細胞(A-C)向表達Pax6的皮層干細胞和祖細胞的分化。染色體組型證實了該DS-1PS細胞包含47條染色體(C)。標尺50iim (a-e)，IOOiim⑴。圖19示出了 DS-1PS產生全部皮層的神經元深層(Tbrl，g)和上層(Cuxl，Brn2，Satb2, h, i)。圖20示出了產生了大致相等數量的深層和上層神經元(j)。對于每一種細胞特異性標記物，n=3個培養物；誤差條，s. e. m。標尺50 u m。圖21示出了來源于DS-1PS的皮層神經元在體外功能性成熟，發出自發動作電位(A)并在電流注入后發放動作電位的序列(B)。圖22示出了通過來源于對照健康(Ctrl)和DS (DS) iPS細胞的皮層神經元分泌A 3 40肽(對于每一個細胞系，n=3個培養物)。每48小時收集細胞培養基以通過夾心ELISA來測量AP 40肽濃度。每48小時全部更換細胞培養基，因此AP 40的水平反映了 48小時期間內的分泌和累積。綠色箭頭指示在這些培養物中明顯的神經元分化的開始。星號表示在某一時間點，對照和DS神 經元之間AP 40濃度的明顯差異(p〈0. 025)。圖23示出了在培養90天后，在來源于hES和DS_iPS的皮層神經元中的淀粉樣物質的利用硫黃素類似物BTA-1的活細胞染色。在DS-1PS神經元培養物中明確觀察到BTA-1陽性團聚體(b中的箭頭)。H9 :來源于H9hES細胞的皮層神經元；DS，來源于DSl-1PS4的皮層神經元。標尺100li m。圖24示出了在對照(H9)和唐氏綜合癥(DS)皮層神經元的60天培養物中在48小時內細胞培養懸液中AP 42累積的斑點印跡(a)和定量(b)。圖25示出了在DS-1PS皮層神經元培養物中觀察到的大量細胞死亡(活化的半胱天冬酶3)，其中的大多數在具有胞內BTAl陽性淀粉樣團聚體中發現(I中的箭頭)。凋亡細胞的定量發現，來源于DS的皮層神經元中的發生率顯著較高(每一種細胞類型n=3個培養物)。誤差條，s.e.m。標尺50iim。圖26示出了在來自于DS-1PS細胞的皮層干細胞培養物中沒有發現APP的病原性A P 42片段(e)，在來自hESC的培養皮層神經元中極少，而培養60至90天時在來源于DS-1PS細胞的皮層神經元的培養物中發現了大量的A ￠42胞內和胞外沉積物。標尺e-g，100 u m ;h，50 u m0圖27示出了 DS-1PS皮層神經元的90天培養物的Z-堆疊的3D效果圖中在皮層神經突附近發現的胞外淀粉樣斑(箭頭)。標尺25 pm。圖28示出了來自H9和DS細胞的皮層神經元培養物中的淀粉樣團聚體的定量。在每一種細胞類型的三個培養物中對大于神經元細胞體平均直徑的聚集體進行計數。誤差條，s. e. m.。圖29示出了分化70天時DS皮層神經元產生了大量的可溶性胞外A P 40和A3 42肽，相對于DS成纖維細胞和來源于hES的皮層神經元的年齡匹配的培養物。分泌的A3 4O:A0 42之比為4. 6:1。用DAPT抑制Y -分泌酶4天降低了 AP 40和AP 42的產生，A3 4O:A0 42之比變為7. 5:1。更長期的21天Y -分泌酶的抑制使兩種AP肽的產生降低到不可檢測的水平。圖30示出了來自DS成纖維細胞培養物、來源于hES的皮層神經元和DS皮層神經元的全細胞提取物的不溶性和不溶性AP肽的定量，證明了在該不溶性部分中僅有可檢測的AP并且主要是AP 42。Y -分泌酶抑制沒有顯著改變培養物中存在的不溶性AP 42的量。圖31示出了本文所述的分化過程的示意圖雙SMAD抑制的組合，與視黃素的組合，使PSC分化為可以用FGF2擴增/保持的皮層干細胞和祖細胞。除去FGF2使得發生神經發生，在與體內發生的皮層細胞類型生成的相同發育過程后產生皮層干細胞。所有層的皮層投射由PSC產生并形成功能性興奮的谷氨酸鈉能突觸的網絡。
具體實施例方式實驗方法人多能干細胞培養
人ES細胞研究得到了英國干細胞庫(UK Stem Cell Bank)和干細胞應用(Useof Stem Cell Lines)指導委員會的批準，并且根據人類干細胞應用實踐的UK代碼(UKCode of Practice for the Use of Human Stem Cell Lines)來進行。hES (H9, WiCellResearch Institute,和 Edi2,來自 Jenny Nichols 的饋贈,Cambridge Centre for StemCell Research)和 hiPS 細胞系(DSl_iPS4, Harvard Stem Cell Institute22)的培養根據標準方法13在經絲裂霉素處理的小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)上進行。簡言之，將細胞保持在hESC培養基中(除非另外指出，所有組分均來自Invitrogen):含有20%的KSR的DMEM/F12、6ng/ml 的 FGF2 (PeproTech)UmM 的 L-Gln, 100 u m 的非必需氨基酸、100 y M 的 2-巰基乙醇、50U/ml的青霉素、和50mg/ml的鏈霉素。定向分化為大腦皮層在用胰酶(Accutase)(Innovative Cell Technologies)解離為單個細胞之后通過在涂覆有凝膠的盤上在用10ng/ml的FGF2和10 y M的ROCK抑制劑(Calbiochem)補充的hESC培養基中進行I小時預鋪板，將hESC或iPSC與MEF分離。收獲未粘附的多能干細胞并鋪板于在含有10ng/ml的FGF2的MEF條件hESC培養基中的涂覆有Matrigel (BD)的12孔板上。在細胞培養物達到95%匯合后，通過將培養基更換支持神經誘導、神經發生、和神經元分化的培養基(稱為3N培養基)來引發神經誘導，該3N培養基為含有N2的培養基和含有B27的培養基的1:1的混合物。N2培養基DMEM/F12、N2(GIBC0)、5ii g/ml的胰島素、ImM的L-谷氨酰胺、100 u m的非必需氨基酸、100 y M的2-巰基乙醇、50U/ml的青霉素、和50mg/ml 的鏈霉素；B27 培養基Neurobasal (Invitrogen)，含有維生素 A 的 B27 (GIBC0)、200mM的谷氨酰胺、50U/ml的青霉素和50mg/ml的鏈霉素。3N培養基用500ng/ml的小鼠頭蛋白CF嵌合體(1 &0578七61118)、和IOiim的SB431542 (Tocris)補充以抑制神經誘導期間的TGFP信號化。將細胞在該培養基中保持8-11天，在該時間段期間通過具有特征神經上皮細胞形態的細胞的外形來監測神經誘導的效率。通過用分散酶解離并在包含20ng/ml的FGF的3N培養基中在涂覆有聚鳥氨酸和層粘連蛋白的塑料板上再次鋪板來收獲神經上皮細胞。再過2天后，除去FGF2以促進分化。用胰酶將培養物再傳代一次，以50，000個細胞/cm2在3N培養基中的涂覆有聚鳥氨酸和層粘連蛋白的塑料板上再次鋪板并且保持至多達90天，每隔一天更換培養基。免疫細胞化學和定暈在PBS中的4%的多聚甲醛中固定培養物并且進行免疫熒光染色和共焦顯微法。本研究使用的抗體Tbrl (Abeam)、Tbr2 (Millipore)、CTIP2 (Abeam)、普羅明/CD133(Abeam)、憐酸化組蛋白 H3 (Abeam)、Pax6 (Chemicon)、0ct4 (Abeam)、Ki67 (BD)、雙腎上腺皮質激素(Santa Cruz)、￠-微管蛋白 III (Chemicon)、￠-微管蛋白 III (Covance)>vGlutl (Synaptic Systems)、Cuxl (Santa Cruz)、Brn2 (Santa Cruz)、Satb2 (Abeam)、裂解的半胱天冬酶 3 (Cell Signaling)、A P 42 的 C 端(Chemicon)。用于一抗檢測的二抗為物種特異性的，Alexa染料復合物(Invitrogen)。為了定量化表達特異性皮層神經元標記物的細胞的數目，用胰酶將細胞培養物解離為單個細胞并以100，000個細胞/ml的密度重懸浮。用Cytos`pin離心機(ThermoScientific)將20，000個細胞鋪板于涂覆有聚賴氨酸的玻璃載片上，并固定和染色以用于共焦顯微法。為了神經元細胞培養物中淀粉樣物質的活細胞染色，在清洗和成像前的20分鐘加入DMSO中的BTA-1 (Sigma)以使其終濃度為100nM。例用Student t檢驗來進行細胞計數的統計學比較。例用標準固定和染色技術來進行突觸蛋白的超分辨率顯微成像，用Deltavision OMX 系統(Applied Precision)可觀察到。利用來自DS和H9皮層神經元的65天培養物的10 U I的細胞培養物上清液的斑點印記法來進行胞外AP 42的定量分析。在進行印記前過濾上清液以除去細胞碎片(0. 22um的過濾器)。用特異于A3 42的C端(Chemicon)的多隆抗體來檢測AP 42。斑點印記在ImageJ (NIH)中定量化。AP肽檢測和定量化通過來自DS、iPS對照、和H9hES皮層神經元培養物的50 U I細胞培養物上清液的夾心ELISA (Invitrogen)來進行分泌的AP 40和AP 42的定量。為了可溶于水的和不溶于水的AP肽的定量，制備來自皮層培養物的全細胞提取物的可溶于水且可溶于甲酸的部分并通過ELISA (Invitrogen)測量每一種肽的水平。通過從分化進行的第50天,每48小時通過加入DAPT (Calbiochem)在DS皮層培養物中進行Y-分泌酶的抑制。定量RT-PCR在每個時間點(第5天、第10天、第15天、第20天、和第25天)在ES和DS_iPS培養物(Trizol，Sigma)的三個培養物中分離總RNA。將總RNA逆轉錄并用于定量RT-PCR，其中具有特異于Foxgl和Tbr2的引物的定量RT-PCR利用Applied Biosystems7000系統進行。電牛理學在室溫下在含有125mM 的 NaCl、25mM 的 NaHCO3U. 25mM 的 NaH2P04、3mM 的 KCl、2mM的CaCl2UmM的MgCl2、25mM的葡萄糖、3mM的丙酮酸(以mM計)的人造腦脊流體中用95%的
02、5%的CO2鼓泡來進行全細胞電流鉗記錄。用含有135mM的葡萄糖酸鉀、7mM的NaClUOmM的Ifepes、2mM的Na2ATP、0. 3mM的Na2GTP、2mM的MgCl2 (以mM計)的胞內溶液填充硼硅玻璃電極(電阻為6-10MQ )。利用具有紅外DIC光學鏡片的BW50WI顯微鏡(Olympus)觀察細胞。用Multiclamp700A放大器(Molecular Devices)進行記錄。在4kHz下過濾信號,在20kHz下以16比特位的分辨率取樣，并利用Matlab (Mathfforks)分析。人皮層神經元的切片培養利用Leica VT1000S振動切片機將胚胎小鼠大腦(第16天的胚胎)的冠狀切片制備為厚度為250 u m的切片。在可滲透性膜上培養大腦切片，將其插入到Costar Transwell板中，在膜的下方加入N2B27 (3N)培養基。將早期(分化的第35天)的人ESC和iPSC來源的皮層神經元解離為單個細胞并鋪板于小鼠大腦切片上，基本如所述的23。將培養物保持14天，然后固定并用Tbrl (識別小鼠和人)抗體和人特異性NCAM抗體進行免疫染色。結果我們研究了許多不同的方法，通過這些方法我們可以首先在單層培養物中利用限定的培養基和已知的信號途徑將hES細胞定向分化為大腦皮層的神經干細胞和祖細胞。通過它們對轉錄因子Foxgl、Pax6、0txl/2、和Tbr2的表達來鑒定皮層干細胞/祖細胞，不表達通常在腹側端腦(ventral telencephalon)或更尾部中表達的基因(Nkx2.1、DlxUP HoxB4)。如下文所述，皮層誘導的最終論證依賴于來自于由人ES細胞和iPS細胞分化的神經干/組細胞的神經元輸出。視黃素調節小鼠大腦皮層中從神經干細胞向神經發生擴增的轉變，以及谷氨酸能神經元從小鼠ES細胞的衍化的增加。在缺少視黃素下，發現從hES細胞的神經誘導效率非常低。我們發現將視黃素信號化與抑制TGFP信號化的組合促進hESC向大腦皮層干細胞和祖細胞的神經誘導定向分化。利用這種方法，在神經誘導開始14天后，在培養物中的幾乎所有的細胞(>95%)均為表達Pax6的神經干細胞。通過這種方法獲得的神經干細胞培養物表達高水平的FoxglmRNA，隨后表達TbrfmRNA(圖1)。我們測試了從人胚胎干細胞的皮層分化對視黃素的依賴是否推及其他多能干細胞系(ES和iPS)。我們利用本文描述的方法，在存在或不存在視黃素下將兩種人ESC細胞系和四種iPSC細胞系分化為神經干細胞。兩種hESC系來源于兩種不同的系統(institution) (H9和Edi2)，而四種iPSC系來源于兩個不同的組。在不存在視黃素下，通過雙SMAD抑制從hES和hiPS細胞的皮層神經誘導是無效的，如通過Pax6表達所估算的(圖3)。觀察到表達Pax6的細胞的斑，占每一種培養物中的細胞的約25% (圖3)，但大多數細胞是Pax6陰性的。相比之下，包含視黃素(視黃醇乙酸酯和全反式視黃醇)會引起所有的系強力的、有效的分化為皮層神經干細胞/祖細胞，幾乎所有細胞都表達Pax6 (圖3)和Otxl/2。對于所有的hES和hiPS都是這樣，與起源或衍生方法無關。除了皮層干細胞和祖細胞特有的轉染因子組合(Pax6、Foxgl、0txl/2和波形蛋白)的表達之外，本文中報道的皮層神經蓮座細胞(vrosette cell)顯示出為體內皮層神經上皮特征的特征。來源于人ESC的神經干細胞在神經誘導之后形成蓮座結構(Rovelet-Lecrux, A.，et al. Nat Genet38, 24-26(2006);Quon,D.,etal.Nature352，239-241 (1991))。該皮層蓮座具有顯著的頂-底極性，將CD133/普羅明、鐵傳遞蛋白受體、和aPKC定位于每一個細胞的最頂部(腔)(圖8j)。此外，許多有絲分裂位于每一個蓮座的頂部/腔面，如在體內發生的。最后，如在體內發生的，它們使中間體(通過ASPM和CEP135蛋白局域化觀察到的)位于每一個細胞的最頂端，通常延伸到每一個蓮座的中心腔內(圖8j)。這與培養物中存在頂部和底部皮層干細胞和祖細胞是一致的。大多數從神經上皮蓮座的腔轉移的有絲分裂細胞表達Pax6。神經上皮的標志特征是細胞間期的核遷移(IKNM)，在這期間每一個干細胞/祖細胞的核在細胞周期的期間移動在G2期間經受定向核遷移和在頂部表面的有絲分裂之前，Gl細胞的核在頂部表面開始并朝向底部表面遷移，經受S期遠離腦室/頂部表面。大多數M期的核的定位于每一個蓮座的中心，位于頂部表面處，提供了 IKNM在蓮座中發生的指示。為了證實，我們利用皮層蓮座中的細胞移動的延時成像觀察核的移動和有絲分裂。與磷酸化組蛋白H3染色一致，大多數有絲分裂發生在頂部/腔表面處，較少量朝向蓮座的外圍發生。在所有的頂部有絲分裂之前都有G2期，在該G2期中核從腦室部位(abventricular position)移動,通常從蓮座的腔移動幾個核直徑的距離。G2期頂部定向移動通常在幾小時的期間內發生。IKNM和蓮座的極化的存在以及頂部和底部有絲分裂的存在表明，皮層蓮座通過形成圓形上皮盤(circular epithelial disc)來模擬線性體內皮層神經上皮。在大腦皮層體內發育中，皮層干細胞的主要群形成極化的、假復層神經上皮，而祖細胞的次級群則在室下區內部和外部被發現，分別稱為SVZ和oSVZ (Hansen，D. V et al. Nature464, 554-561 (2010) ;Fietz et al NatNeurosci 13, 690-9(2010) ) 來源于本文報道的方法的神經干細胞含有至少兩個并 且有可能三個干細胞和祖細胞的群蓮座中的大多數細胞，其為Pax6+/0tx+/Ki67+，具有放射過程的頂-底極化細胞，并且其經受IKNM和頂部有絲分裂；第二細胞群，其經受腦室或底部有絲分裂；以及第三Tbr2+/Ki67+細胞群。Tbr2陽性增殖細胞的小細胞群(圖8i)的存在與外部室下區(OSVZ)祖細胞是一致的。盡管約一半的表達Tbr2的細胞是表達Ki67的循環祖細胞(圖4)，但另一半是新生的雙皮質素陽性神經元，如在前文在人皮層體內發育中所描述的(Hansen et al(2010)supra)。Tbr2/Ki67+細胞群在第25天的每一個蓮座中占平均15%的細胞(圖5)，并且很大程度上促進從干細胞/組細胞群的神經元輸出。受到從培養基除去FGF2的刺激的皮層神經發生，在來自hES和hiPS的神經元誘導之后持續發生兩個月(圖6)。這與在人類中約70天的神經發生是一致的，相比之下，小鼠中皮層神經發生期間為 6 天(Takahasi et alj Neuroscil6, 6183-96 (1996))。來源于PSC的皮層干細胞和祖細胞僅產生谷氨酸能投射神經元，而不產生可檢測的GABA能中間神經元。神經發生的初始波包括深層、表達Tbrl的層的投射神經元，這證實了蓮座的皮層同一性。在該過程中，蓮座開始相對晚地產生星形膠質細胞，該星形膠質細胞在約70天時出現。盡管在皮層誘導條件下不產生GABA能中間神經元，但早期皮層蓮座相對于區域同一性而言是可塑的用刺猬(hedgehog)信號化激動劑泊樸嗎啡(purapomorphine)處理,腹側化(ventralise)蓮座致使產生GAD67+GABA能中間神經元。為了進一步評價來源于PSC的皮層神經元的分化，我們使用皮層切片培養物分析(Polleux et al Sci STKE2002，PL9 (2002))來分析其在小鼠大腦皮層中的遷移、末期分化、和去向的能力。將解離的PSC來源神經元鋪板于發育中的小鼠大腦的皮層切片(14. 5天胚胎)上并培養14天。人PSC來源的皮層神經元在小鼠皮層中大量存活并且延伸了豐富的神經突。明顯地，在發育中的小鼠皮層中的大部分放射狀取向的人神經元，與腦室表面垂直，子集在邊緣區中切向對齊。最后，當在小鼠皮層中培養時，人PSC來源的神經元保持其層同一性，具有許多例如，表達層6的轉錄因子Tbrl。所有哺乳動物中皮層神經發生的關鍵特征是皮層干細胞和祖細胞的多能性以及其能夠以固定的時間順序產生不同層狀命運的興奮性谷氨酸能神經元(Mountcastle etal supra)。從hES細胞的人皮層生成再現了體內皮層生成每一個皮層的人皮層投射神經元以正確的時間順序和高效率 由hES細胞產生。在該培養系統在后期還產生了星形膠質細胞。成人皮層的谷氨酸能投射神經元以固定的時間順序產生，首先產生深層神經元而最后產生上層神經元。在嚙齒動物中，不同層狀命運和投射類型的皮層谷氨酸能神經元可以通過其表達不同的轉錄因子的組合來定義(圖11a) Tbrl+/CTIP2-(低量存在或不存在)層6/皮層丘腦投射神經元；CTIP2+/Tbrl-層5/皮層下投射神經元；Cuxl+/Brn2+層2-層4神經元；以及Satb2+層2-層4胼胝體神經元。我們使用了這些因子在神經元中的表達來研究在70天的間隔內皮層投射神經元亞型從PSC分化的時程，從除去FGF2開始。深層6神經元(Tbrl+)首先出現，接著是表達CTIP2的第5層和第6層神經元。上層Brn2/Cuxl胼胝體投射(層2-層4)神經元隨后分化，在第25-30天之間開始，表達Satb2出現較晚，在第65天至第80天出現(圖10-圖12)。從四種不同的hiPSC系觀察到投射神經元產生的相同時間順序。如上文所述的轉錄因子的組合用于定量化在培養物中70天后不同皮層投射神經元的比例。重要的是，該系統中存在大致相等數量的深層和表層神經元(圖10-圖12)，相比之下，之前報道的來自小鼠ES細胞的上層神經元的產生減少并且人ESC來源的團聚體培養中的上層神經元產生最少。而且，由hESC和四種不同hiPS系產生的不同投射神經元亞型的比例明顯是相似的(圖10-圖12)。在該培養系統中，如在體內發生的，在所有皮層形成之后，在后期產生星形膠質細胞。因此，如本文所述的由hES的人皮層生成再現了體內皮層生成每一皮層的人皮層投射神經元以正確的時間順序和高效率由極化的神經上皮產生。當在促進神經發生的條件下進行培養時，hES來源的皮層干細胞和祖細胞排他地產生谷氨酸能投射神經元，而不產生可檢測的中間神經元(圖13)。在培養大約90天后，如通過微小興奮性突觸后電流和突觸素(synaptophysin)免疫熒光聚焦的存在表明的，在hES來源的皮層神經元培養物中可檢測到功能性突觸(圖14)。因此，這些神經元在數周內在體外自發地發出活動電位并產生成熟放電的性質(firing property)。我們證實了 PSC來源的皮層投射神經元分化為功能性神經元(圖15A、圖15B)。來自單獨一種細胞的全細胞膜片鉗記錄(總n=54神經元)表明存在電壓門控性鈉電流，其被河豚毒素(TTX)阻斷，以及電壓門控性鉀電流，其為被4-氨基吡啶(4-AP)阻斷的順時部分。因此，來自hESC和hiPSC的PSC來源的皮層神經元最終適當地分化為易興奮的細胞。皮層投射神經元最終在新生嚙齒動物皮層中在數天至數周內分化為發育成熟的放電性質。類似的過程在嚙齒動物皮層神經元的原代培養物中發生。隨著hESC和hiPSC來源的皮層神經元體外老化，其發出突發的活動電位的能力響應于隨時間增加的電流注入(圖15C):年輕的(第28天)神經元通常發出單個活動電位，而年老的(第49天)神經元在電流注入后多發出至多達5個活動電位。到第65天時，當用電流注入步驟刺激時，許多神經元(n=32)強有力地發出一系列動作電位。在hES和hiPS來源的皮層神經元中均觀察到該成熟過程(圖15D、圖15E)，并且類似于在體內發生的成熟過程。突觸發生是神經網絡形成中的關鍵步驟。利用超級分辨率(結構照明)顯微鏡以使得突觸前和突觸后蛋白定位可見來檢測PSC來源的皮層投射神經元中的物理突觸的形成。將突觸定義為在樹突上發現的直徑為100納米的區域(通過MAP2染色來檢測)，其中特異于突觸前和突觸后對應物的蛋白是平行的。兩種不同的突觸前和突觸后蛋白對用于鑒定突觸PSD95，與一種主要的突觸囊泡蛋白突觸素一起富含于興奮性谷氨酸能突觸后密度，其為；以及與突觸前蛋白Muncl3-1 —起的Homerl，其是一種廣泛描述的突觸后密度蛋白。PSD95在IOOnm尺寸范圍內的焦距在由hESC和hiPSC產生的神經元的樹突表面上是豐富的。并列但不重疊的是，在早至第28天時，突觸前蛋白(突觸素，Muncl3-1)和突觸后蛋白(PSD95,Homerl)的約IOOnm的焦距在hESC和hiPSC來源的皮層神經元培養物中也是豐富的。最后，為了測試所觀察到的物理突觸是否是功能性的，我們使用了全細胞膜片鉗記錄來檢測第45天至第100天的培養物(總n=48神經元)中的微小興奮性突觸后電流(mEPSC)。在由所有hESC和hiPSC系產生的培養物中，經常檢測到振幅為5-10pA的mEPSC (圖16)。mEPSC被AMPA受體阻滯劑CNQX所阻斷(圖16)，并且具有AMPA受體介導的突觸電流的特征動力學，其快速產生并且之后緩慢地衰減(圖17)。我們得出以下結論，人PSC來源的皮層神經元在培養物中形成了功能性谷氨酸能突觸的網絡。為了描述該方法用于產生患者特異性皮層神經元并模型化神經疾病(如阿爾茨海默病)的潛力，我們使用該方法使疾病特異性人誘導的多能干細胞(iPS)定向分化為皮層神經元。唐氏綜合癥/三體綜合征21是心智障礙的共同遺傳原因，其中新生兒中的發病率為約 l/700-800(Wiseman，F. K et al Hum Mol Genetl8, R75-83 (2009))。患有唐氏綜合癥的個體具有非常高的阿爾茨海默病的發病率，這是由于在第21號染色體上存在淀粉樣前體蛋白(APP)基因(Selkoe, D. J. Biol Chem271, 18295-18298(1996) )。APP 基因在人體中的復制導致常染色體顯性早期發作性癡呆，并且帶有增加的APP基因劑量的小鼠發展淀粉樣斑和阿爾茨海默型癡呆的神經病狀性特點。我們采用本文描述的方法使人健康對照細胞和人唐氏綜合癥iPS細胞(DSl-1PS422)分化為皮層神經元(圖18至圖21)。對照細胞和唐氏綜合癥hiPS (在本文中被稱為DS-1PS)細胞以高效率產生皮層干細胞和祖細胞，再次發育為極化的神經上皮蓮座(圖18)。每一層的皮層神經元以正確的時間順序并在相同的時間標度上從DS-1PS和從hES細胞分化(圖19和圖20)。對于hES來源的皮層神經元，這些神經元為谷氨酸能的和電活性的(圖21)。阿爾茨海默病體內發展的關鍵步驟是通過大腦皮層中的谷氨酸能神經元，由APP的產生的短的38-42個氨基酸的AP肽增加(Mountcastlel998supra),該過程可以在患有唐氏綜合癥的人群中在其十幾歲和二十幾歲時發生(Rovelet-Lecrux, A. , et al. NatGenet38, 24-26(2006))。我們監測了來源于對照細胞和DS iPS細胞的皮層神經元分泌A MO和A M2肽(圖22)。神經元產生的AP 40通常比AP 42要多得多。然而，認為AP 42是阿爾茨海默病中的主要致病A P肽，因為其自我團聚以形成可溶性和不可溶性低聚體以及不可溶性原纖維和斑，其也可以含有A P 40。對于神經元分化發生數天內的對照神經元和DS皮層神經元，A3 40肽的分泌最初成為在低水平下可檢測(圖22)。然而，DS皮層神經元的AP 40的產生在隨后10天內以指數增加至高水平，而對照神經元的A￠40的產生保持一貫的低水平(圖22)。在神經元分化的早期沒有檢測到對照神經元或DS皮層神經元的致病性A P 42肽的分泌。在DS皮層神經元隨時間產生的A P 40增加的情況下，我們通過用硫磺素T類似物BTAl24使淀粉樣物質的胞內和胞外團聚體活染色分析了培養物中DS-1PS來源的皮層神經元的淀粉樣斑的發展(圖23)。在皮層分化開始后的三個月的期間內，DS-1PS皮層神經元產生BTAl標記的淀粉樣物質的胞內和胞外團聚體。相比之下，在相同的時期內，在hES來源的皮層神經元培養物中很少觀察到BTAl陽性神經元或胞外團聚體。AP 42肽形成抑制阿爾茨海默病早期階段中突觸功能的可溶性和不可溶性低聚物。DS-1PS皮層神經元以非常高的水平產生A ￠42肽并且累積在細胞培養基中(圖24)。我們發現，許多具有可檢測的胞內淀粉樣團聚體的DS-1PS神經元經受了程序性細胞死亡，正如通過活化的半胱天冬酶3染色所檢測的(圖25)。
免疫熒光和共焦顯微鏡證明，大量含AP 42的團聚體存在于DS-1PS皮層神經元內側和外側，并且在神經突附近常有胞外AP 42陽性團聚體(圖26和圖27)，這表明由DS皮層神經元產生的AP 42隨時間增加。相比之下，AP 42以低得多的水平產生(約低10倍)并且在hES來源的皮層神經元中少得多地發現含AP 42的團聚體(圖28)。阿爾茨海默病中AP 42產生的增加和斑的形成與大腦皮層中神經元細胞死亡有關。從年老的70天DS和對照hES皮層神經元培養物分泌的可溶性胞內和不溶性蛋白部分的提取和分析證實了老年DS神經元在48小時期間內分泌相當大量的AP 40和AP 42，而hES皮層神經元產生少量的AP 40而沒有可檢測到的AP 42 (圖29)。顯然，DS皮層神經元培養物中的AP 40與A3 42之比為4. 6:1，這反映了 DS皮層神經元不僅產生較多的AP肽，而且還改變所產生的A340與AP42的相對量，如在偶發性阿爾茨海默病體內發生的。AP肽的高水平分泌特異于DS神經元，如由DS成纖維細胞產生AP肽是幾乎不可檢測的(圖29)。在體內，A3 42肽形成可溶性和不溶性低聚物，其抑制阿爾茨海默病早期中的突觸功能(Palop et al NatNeurosci 13812-818 (2010))。除了對分泌的可溶性A P 40和A P 42肽進行ELISA檢測之外，DS皮層神經元的細胞培養基中也存在可溶性A ^低聚物。相比于分泌的可溶性A &肽,可溶性胞內A &肽水平低于在DS和對照hES來源的皮層神經元中檢測的水平(圖30)。然而，在DS皮層神經元培養物中發現了不溶性A P 40和A 3 42，而在健康皮層神經元培養物中卻未發現(圖30)。DS培養物中的大多數不溶性A 3為A 3 42，而A P 40的豐度僅為A P 42的四分之一(圖30)，觀察到的分泌的AP比率。最后，我們討論了 DS-1PS皮層神經元產生和分泌的A P 40和A P 42肽是否會由于Y -分泌酶復合物的抑制而減少，Y-分泌酶為處理APP以產生AP肽的兩種必需蛋白酶復合物之一。4天的短期Y -分泌酶抑制使A P 40和A P 42產生減少了幾乎一半，而長期處理(21天)使兩種
肽的分泌降低至低于可檢測水平(圖29)。然而，Y-分泌酶的抑制并沒有使DS皮層神經元培養物中的不可溶性A ￠42的量減少(圖30)，這很可能是因為缺少去除皮層神經元培養物中的淀粉樣物質的清除機制。
總之，我們已開發了一種方法，通過該方法可以使人多能干細胞定向分化為大腦皮層神經元，再現體內發育過程。該方法由多個獨特的步驟組成使人PSC定向分化以形成皮層干細胞和祖細胞的復合群；皮層神經發生的延伸期；晚期的星形膠質細胞形成；神經元最終分化以獲得成熟電生理學性質；以及突觸發生和網絡形成。相比于之前報道的小鼠ESC的定向分化，在本系統中重現了皮層投射的多樣性，具有大致相等的在培養的數月內產生的深層(先產生)和上層(后產生)神經元比例。本方法的關鍵步驟是人PSC高效分化為皮層神經干細胞/祖細胞蓮座，以及在該系統中頂部和底部祖細胞的產生。我們已發現，抑制音猬因子不能促進皮層誘導，并且視黃素是在本文使用的神經誘導條件下進行從人PSC的有效皮層誘導所需的。這一發現與小鼠大腦皮層中從神經干細胞擴增轉化為神經發生的視黃素調控以及從小鼠ES細胞衍生谷氨酸能神經元的視黃素依賴性是一致的。當在體外以克隆密度生長時，原代小鼠皮層干細胞/祖細胞產生投射神經元，雖然相比于體內它們產生較少的上層/后產生的神經元。除去可以用于擴增蓮座細胞的促有絲分裂FGF2，促進該系統中神經發生的開始。系統中每一層的投射神經元產生的時間順序都是固定的深層6神經元首先出現，而層2/3神經元是最后產生的神經元，隨后產生星形膠質細胞。在小鼠中，皮層神經發生在6天的間隔內發生，相比之下，人類皮層神經發生在體內持續約100天。我們發現，在本系統中投射神經元產生的期間接近于在人胚胎中所觀察到的深層6神經元在神經發生開始的數天內發生，而上層表達Satb2的離皮質神經元直到約60天后才開始出現。通過PSC的定向分化產生全部類型的皮層投射神經元的能力很可能是由于在皮層蓮座中存在頂部和底部祖細胞類型。我們在皮層誘導之后觀察到至少兩種并且有可能是三種不同的細胞群蓮座中的大多數細胞是Pax6+/0tx+/Ki67+，具有放射過程的頂-底極化細胞，其經受IKNM和頂部有絲分裂；第二干細胞/祖細胞的群，其經受底部有絲分裂；以及Tbr2+/Ki67+細胞群。這些群近似于發育中的人皮層中的干細胞/祖細胞的三個群VZ神經上皮細胞、SVZ細胞、和oSVZ細胞。在該系統產生的干細胞/祖細胞的群能夠容易地產生在體內在人皮層中發現的投射神經元類型的多樣性，提供了通過該系統捕獲的人皮層祖細胞類型的復雜性的指示 。從皮層誘導到興奮性突觸和網絡形成來模型化皮層發育的能力將使得人皮層發育的未來功能性研究成為可能，并且可以用于產生特異性皮層細胞類型，如皮質脊髓運動神經元。由于這一方法與人ESC和iPCS等效，因此可以產生患者特異性皮層神經元以用于疾病模型化，并可潛在地用于治療目的。我們已經通過研究唐氏綜合癥iPS細胞來源的皮層神經元中早期發作的阿爾茨海默病的發展證實了該系統用于模型化大腦皮層疾病和成人發作的神經疾病的潛力。A3 42的產生和淀粉樣斑的形成在該系統中在數月的期間內發生，相比之下，在體內通常為數十年。本文所述的DS-1PS來源的神經元用于模型化早期發作的阿爾茨海默病的病狀的應用提供了在體外系統中用于分析APP和其肽產物在皮層突觸功能和神經退化中的正常功能和病理學功能的潛在能力。
權利要求
1.一種用于體外誘導人多能細胞皮層生成的方法，包括 (i)提供經分離的人多能干細胞的群， (ii)在刺激視黃素信號化和抑制TGFP超家族信號化的培養條件下培養所述群， 以便所述群分化為皮層干細胞和祖細胞。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述培養條件抑制TGFP和BMP信號化。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中，在包含視黃素和一種或多種TGFP-SMAD信號化抑制劑的神經誘導培養基中培養所述群。
4.根據權利要求3所述的方法，其中，所述視黃素為視黃酸、全反式視黃醇、或視黃醇乙酸酯。
5.根據權利要求3或4所述的方法，其中，所述一種或多種TGF^ -SMAD信號化抑制劑選自4-[4-(1, 3-苯并二氧雜環戊烯-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺、頭蛋白、和多索嗎啡。
6.根據權利要求5所述的方法，其中，所述神經誘導培養基包含4-[4-(1，3-苯并二氧雜環戊烯-5-基)-5- (2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺和頭蛋白。
7.根據權利要求3至6中任一項所述的方法，其中，所述神經誘導培養基包含胰島素。
8.根據權利要求1至7中任一項所述的方法，其中，培養所述人多能干細胞的群至少15天。
9.根據權利要求1至8中任一項所述的方法，其中，至少95%的所述群分化為皮層干細胞和祖細胞。
10.根據前述權利要求中任一項所述的方法，包括擴增所述皮層干細胞和祖細胞的群。
11.根據前述權利要求中任一項所述的方法，包括儲存所述皮層干細胞和祖細胞的群。
12.根據前述權利要求中任一項所述的方法，包括使得所述皮層干細胞和祖細胞的群分化為大腦皮層神經元。
13.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述人多能干細胞為iPS細胞。
14.根據權利要求13所述的方法，其中，所述iPS細胞來源于獲自具有損傷的或功能障礙的大腦皮層的個體的健康細胞樣品。
15.根據權利要求13所述的方法，其中，所述iPS細胞來源于具有與疾病相關的表現型或基因型的細胞樣品。
16.根據權利要求15所述的方法，其中，所述iPS細胞是來源于唐氏綜合癥細胞樣品的唐氏綜合癥iPS細胞(DS-1PS)。
17.根據權利要求16所述的方法，包括檢測或測定由所述DS-1PS產生的大腦皮層神經元中的一種或多種阿爾茨海默病的病狀或年齡相關的病狀。
18.—種經分離的皮層干細胞以及干細胞和祖細胞或經分離的大腦皮層神經元的群，所述群通過權利要求1至17中任一項所述的方法產生。
19.根據權利要求18所述的群，在治療人體或動物體的方法中應用。
20.根據權利要求18所述的群，在治療具有損傷的或功能障礙的大腦皮層的患者的方法中應用。
21.一種用于治療具有損傷的或功能障礙的大腦皮層的患者的方法，包括 向對其有需要的個體給予權利要求18所述的群。
22.—種權利要求18所述的群在制備用于治療具有損傷的或功能障礙的大腦皮層的患者的藥物中的應用。
23.根據權利要求18所述的群，其中，所述細胞由DS-1PS細胞產生并且顯示出一種或多種阿爾茨海默病或年齡相關的病狀。
24.一種用于篩選在治療神經退行性疾病中有用的化合物的方法，包括 使通過權利要求1至17中任一項所述的方法產生的經分離的大腦皮層神經元與測試化合物接觸，以及 測定所述測試化合物對所述神經元的影響。
25.根據權利要求24所述的方法，其中，所述大腦皮層神經元由DS-1PS細胞產生，并且測定所述測試化合物對一種或多種年齡相關病狀或阿爾茨海默病病狀的影響。
26.根據權利要求25所述的方法，其中，測定所述測試化合物對AP42表達水平，AB42與AB40之比；神經元中的AB42水平；胞外培養基中的Ab42水平；AB42低聚物的形成；超磷酸化Tau的水平；胞內鈣水平；胞內和胞外淀粉樣斑的形成；以及所述經分離的大腦皮層神經元的群的程序性細胞死亡的速率的影響。
全文摘要
本發明涉及通過在刺激視黃素信號化并且抑制TGFβ超家族信號化的條件下培養細胞，用于在人多能細胞如iPS細胞中體外誘導皮層生成的方法。這在產生皮層神經元，尤其是患者特異性皮層神經元；模型化青少年和成人發作的神經疾病；以及治療的開發中可以是有用的。
文檔編號C12N5/0797GK103052707SQ201180037682
公開日2013年4月17日 申請日期2011年7月29日 優先權日2010年7月30日
發明者弗雷德里克·約翰·利夫西, 施熠辰 申請人:劍橋實業有限公司