專利名稱：用禽蛋生產人類干細胞的方法
技術領域：
本發明涉及干細胞生物學領域，特別是涉及用禽蛋生產人類干細胞的方法。
技術背景
個體中的器官組織是由干細胞和非干細胞組成的，非干細胞是器官組織中的一類功能細胞，通常不能自我更新，因端粒縮短、DNA突變等原因造成死亡而數量減少時可由干細胞通過分化來補充；干細胞因細胞分化、DNA突變死亡等原因造成數量的減少，也可以通過提高自我更新率來補充。
干細胞，是在人體組織中的一類可以自我更新和具有多向分化成多種組織細胞的細胞，如造血干細胞、間充質干細胞等。個體包括大腦神經元細胞在內的所有體細胞，每天平均大約有的細胞會因DNA突變、端粒縮短、細胞中的垃圾累積等等問題而發生死亡掉，但同時也有等量的細胞新生，靠的就是多能成體干細胞的自我更新和多向分化這兩種功能。
特別是近年來，日本科學家在人類的骨髓和皮膚中發現了一種接近于全能的成體多能干細胞，稱繆斯細胞(Muse細胞)，它們能夠分化成具有內臟中外胚層、神經外中胚層和內胚層特征的細胞。但是，成體多能干細胞在組織中數量很少(一般只占所有組織細胞的百萬分之一)，分裂繁殖很慢，而且隨個體年齡增長其數目會越來越少。
iPS 細胞(induction of pluripotent stem cells, iPS 細胞)是日本科學家山中伸彌通過基因技術把體細胞誘導轉化的一種和胚胎干細胞性狀相似的干細胞。iPS細胞注射到動物的囊胚會分化成組成個體的所有細胞。
一般來說，年輕人身體比較健康，可一到老年期，就會變得體弱多病，什么癌癥、糖尿病、心腦血管等等的疾病接踵而來，以及個體中受損組織的再生障礙。究其原因就是成體多向干細胞本身越來越老、數量越來越少。當成體多能干細胞數量減少到一定程度時，油盡燈熄，我們就是這樣衰老死亡的！因此，向人體內補充年輕的成體多能干細胞，可以提高器官組織因衰老和病理損傷的修復水平，具有祛病延年、甚至達到返老還童的效果。發明內容
本發明的目的是提供用禽蛋生產人類干細胞的方法，以解決此類細胞的大量需求問題。
按此目的提供的用禽蛋生產人類干細胞的方法，材料包括準備好的禽蛋和需要生產的人類干細胞等。其特征是操作時，先在禽蛋的上方將蛋殼開一個小口，用顯微注射管吸取人類干細胞，注射到免疫系統發育成熟之前的任意發育期的禽蛋胚胎中。顯微操作完畢，用一小片狀物體蓋住開口。然后將操作完畢的禽蛋按孵化的標準進行孵化或繼續孵化。
利用禽蛋生產人類干細胞，無需像用哺乳動物胚胎生產人類干細胞那樣需要進行宮內注射，因此具有成本低，成功率高和操作簡單。
具體實施方式
本發明的目的是提供用禽蛋生產人類干細胞的方法，以解決此類細胞的大量需求問題。
按此目的提供的用禽蛋生產人類干細胞的方法，材料包括準備好的禽蛋和人類干細胞等。其特征是操作時，先在禽蛋的上方將蛋殼開一個小口，用顯微注射管吸取人類干細胞，注射到免疫系統發育成熟之前的任意發育期的禽蛋胚胎中，但iPS細胞要注射到囊胚中。使細胞接受者的免疫系統對人的細胞產生耐受，這樣，細胞接受者以后的免疫系統就不會把自體內的人的細胞刪除掉。顯微操作完畢，用一小片狀透明物體蓋住蛋殼的開口，片狀物體可以是消毒的小片蓋玻片、透明的塑料膜等，并用透明膠布將片狀物體與蛋殼接觸處封固，或用融化的石蠟將片狀物體與蛋殼接觸處封固。然后將操作完畢的禽蛋按孵化的標準要求進行孵化或繼續孵化。接下來就是按現成技術從整個胚胎、胎肝或成年個體的骨髓等器官組織中分離人類干細胞。
所述的禽蛋為雞蛋、鴨蛋、鵝蛋或鴕鳥蛋等。
所述的人類干細胞為繆斯細胞(Muse cells)、間充質干細胞、造血干細胞、神經干細胞、iPS細胞等。間充質干細胞、造血干細胞、神經干細胞是屬于成體多能干細胞，在動物胚胎中能夠擴增。而iPS細胞是屬于囊胚內的胚胎干細胞。
所述的人類干細胞是從人的成體組織中分離的人類成體多能干細胞，或分離自人的iPS細胞所分化出的人類成體多能干細胞或直接用人類體細胞誘導的iPS細胞。
iPS細胞在胚胎發育過程會分化成各種成體細胞，包括成體多能干細胞，與動物細胞組成嵌合體胚胎。為了提高人類細胞在動物胚胎組織中的比例，可以事先對囊胚用輻射等方法進行致弱處理。一般來說，人于動物嵌合體的胚胎無法在出生后成活，但提取人類成體多能干細胞只要未出生的胚胎就可以了。
用iPS細胞生產成體多能干細胞的方法包括(1)往培養液添加特定的分化誘導因子使iPS細胞直接分化成某種成體多向干細胞，然后把成體多能干細胞分離出來；(2)把 iPS細胞注免疫缺陷的動物體內產生畸胎瘤，然后從畸胎瘤中分離出各種成體多能干細胞； (3) iPS細胞在一定的培養條件下會產生胚狀體(embryoid bodies,EBs)集落，然后從胚狀體集落中分離出各種成體多能干細胞。
上述由iPS細胞分化的成體多能干細胞年齡較小，注射到老年人體內能夠讓老年人衰老個體中的器官組織恢復活力，有返老還童的效果。但是，由于細胞過于幼稚，是屬于胚胎產生免疫耐受期之前的成體多向干細胞(或者說是成體多能干細胞的前體細胞)，有一些抗原沒有經過免疫識別耐受，因此，即使遺傳背景與宿主相同，宿主體內的免疫系統也會把它當做異物排斥掉。造成這種后果我曾經(燕京醫學通訊，1998;66:1058、1060，本文是內部刊物，要索取本文請到燕京函授醫學院，地址北京市海淀區復興路21號(公主墳西北側衛國中學內))說過，轉化(幼稚化)的干細胞可能會表達胚胎免疫系統沒有識別和耐受的胚性抗原，會引發免疫排斥。如今年5月13日在《自然》雜志的一篇文章報道“重編程細胞同源移植也會排斥”，美國加州大學圣地亞哥分校的研究者把小鼠體細胞重編程的 iPS細胞分化的成體細胞移植到細胞來源的小鼠體內，本來以為遺傳背景相同不會發生排斥，可小鼠卻快速排斥移植來的細胞。研究者發現，由iPS細胞分化的成體細胞高表達兩種基因，而這兩種基因在正常小鼠體細胞內沒有表達；此外，用于重編程的體細胞本身已經發生了突變，誘導轉化成的iPS細胞同樣攜帶突變的基因，再分化成的成體細胞還是攜帶突變的基因，以及在細胞培養的分化增殖過程DNA受到損傷(每3個細胞分裂一次就有1次突變發生，并且其突變具有累積效應)，個體的免疫系統當然會把它當做異物刪除掉，這和通常個體的免疫系統刪除突變的體細胞的動機是一樣的，是有益的，因為我們不希望把突變的細胞植入人體。《科技日報》1999年X月X日？報道一種能抑制傷口愈合的基因， 一般傷口要5天愈合，通過抑制該基因，傷口 2天就愈合了。該基因的主要功能是促進傷口的免疫反應功能，這是因為傷口的細胞再生時DNA處于頻繁的復制，此時DNA最易突變，該基因的促進免疫作用是有利于傷口再生時所產生的突變的細胞的清除，以此保證體細胞再生時的遺傳純正性。還有，把含有早期成體多向干細胞的卵黃囊移植到免疫缺陷的成年動物之后，幾乎沒有細胞還具有增殖能力，可能是早期的干細胞在成熟的環境下不能發揮作用(Mvller 等人，1994)。因此，對過于幼稚的成體多向干細胞，和卵黃囊一樣無法在成年動物中生存。 如果把卵黃囊細胞移植到幼子的肝臟中就能夠生存和增殖，然后再把它移植到成年動物體內，就能夠在骨髓中產生造血功能(Yoder等人，1997)。據此，本發明把用iPS細胞生產的各種成體多向干細胞注入到禽蛋的胚胎中，可以讓幼稚的成體多向干細胞繼續發育成熟(就像胎肝細胞會表達甲胎蛋白，成熟的肝細胞不會表達甲胎蛋白一樣)，以避免將來移植到遺傳背景與成體多能干細胞相同的宿主體內也會遭到免疫排斥。以雞蛋和人類繆斯細胞(Muse cells)為例，繆斯細胞用綠色熒光蛋白標記。操作時，選用的雞蛋胚珠大約發育期為原腸胚，在雞蛋的上方將蛋殼開一個小口，在顯微鏡下， 用顯微注射管吸取人類繆斯細胞，并分別向每個雞蛋胚珠注射50-100個繆斯細胞，繆斯細胞要注射到胚胎的外胚層之上、外胚層與內胚層之間和內胚層之下。顯微注射管的內徑須大于細胞直徑。注意在向雞胚胎注射時盡量避免注入培養液。當然，也可以在雞胚胎發育到 70小時之前的任意發育階段注射繆斯細胞，因為雞的胚胎免疫系統發育成熟的時間大約是在孵化到75小時以后。顯微操作完畢，用一小片狀物體(為了便于觀察，用小片透明蓋玻片)蓋住開口， 片狀物體可以是消毒的蓋玻片、透明的塑料膜等，并用用融化的石蠟等將片狀物體周邊封固，然后將操作完畢的雞蛋按孵化小雞的標準孵化。如孵化小雞那樣，按時觀察小雞胚胎發育情況，并順便觀察繆斯細胞擴增和分布 (觀察綠色熒光蛋白的發布與綠光強度)。
權利要求
1.用禽蛋生產人類干細胞的方法，材料包括禽蛋和人類干細胞，其特征是操作時，先在禽蛋的上方將蛋殼開一個小口，用顯微注射管吸取人類干細胞，注射到免疫系統發育成熟之前的任意發育期的禽蛋胚胎中，但iPS細胞要注射到囊胚中，使細胞接受者的免疫系統對人的細胞產生耐受，這樣，細胞接受者以后的免疫系統就不會把自體內的人的細胞刪除掉，顯微操作完畢，用一小片狀透明物體蓋住蛋殼的開口，片狀物體可以是消毒的小片蓋玻片、透明的塑料膜等，并用透明膠布將片狀物體與蛋殼接觸處封固，或用融化的石蠟將片狀物體與蛋殼接觸處封固，然后將操作完畢的禽蛋按孵化的標準要求進行孵化或繼續孵化，接下來就是按現成技術從整個胚胎、胎肝或成年個體的骨髓等器官組織中分離人類成體多能干細胞。
2.根據權利要求1所述的用禽蛋生產人類干細胞的方法，其特征是所述的禽蛋為雞蛋、鴨蛋、鵝蛋或鴕鳥蛋。
3.根據權利要求1所述的用禽蛋生產人類干細胞的方法，其特征是所述的人類干細胞為繆斯細胞、間充質干細胞、造血干細胞、神經干細胞、iPS細胞。
4.根據權利要求1所述的用禽蛋生產人類干細胞的方法，其特征是所述的需要生產的人類干細胞是從人的成體組織中分離的人類成體多能干細胞，或分離自人的iPS細胞所分化出的人類成體多能干細胞。
全文摘要
本發明涉及干細胞生物學領域，特別涉及用禽蛋生產人類干細胞的方法，操作時，先在禽蛋的上方將蛋殼開一個小口，用顯微注射管吸取人類干細胞，注射到免疫系統發育成熟之前的任意發育期的禽蛋胚胎中。顯微操作完畢，用一小片狀物體蓋住開口。然后將操作完畢的禽蛋按孵化的標準要求進行孵化或繼續孵化。利用禽蛋生產人類成體多向干細胞，無需像用哺乳動物胚胎生產人類干細胞那樣需要進行宮內注射，因此具有成本低，成功率高和操作簡單。
文檔編號C12N5/0775GK102492652SQ20111038415
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月16日 優先權日2011年11月16日
發明者黃必錄 申請人:黃必錄