專利名稱：用動物生產人類成體多向干細胞的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物醫學領域，特別是涉及用動物生產人類成體多向干細胞。
背景技術：
人類成體多向干細胞(adult multilineage stem cells)，是在個體組織中的一類可以自我更新和具有多向分化成多種組織細胞的干細胞，如造血干細胞、間充質干細胞及屬于間充質干細胞的人類繆斯細胞(Muse cells)等。一、個體是由干細胞與非干細胞組成的個體中的器官組織是由干細胞和非干細胞組成的，非干細胞是器官組織中的一類功能細胞，通常不能自我更新，因端粒縮短、DNA突變等原因造成死亡而減少時可由干細胞通過分化來補充；干細胞因細胞分化、DNA突變等原因造成的死亡，也可以通過提高自我更新率來補充。包括大腦神經元細胞在內的所有體細胞，每天平均大約有的細胞會因DNA突變、端粒縮短、細胞中的垃圾累積等等問題而發生死亡掉，但同時也有等量的細胞新生，靠的就是成體干細胞的自我更新和多向分化這兩種功能。二、骨髓是多向成體干細胞的中心小鼠用致死量的放射線照射時，包括骨髓在內的全身所有的器官組織中的成體干細胞都會被射線殺死，但只要移植紅骨髓就可以讓小鼠活下來，這提示紅骨髓中也許有一二種干細胞可以分化成個體所有器官組織中的成體干細胞。福建師大傅文慶教授認為， 骨髓干細胞是成體干細胞中心(后來日本人也意識到這個問題)，可以支援或分化成機體其它所有器官組織的各種各樣的成體干細胞，例如，骨髓間充質干細胞能夠分化成胰腺干細胞、神經干細胞、內皮祖細胞等等。幸運的是，在鼠類、人類骨髓中，美國和日本科學家分別發現兩種接近于全能的多向成體干細胞，稱邁阿密細胞(Miami細胞)和繆斯細胞(Muse細胞)，它們也能分化為具有內臟中胚層、神經外胚層和內胚層特征的細胞。多向干細胞被譽為生命的種子，而紅骨髓則是生命種子的倉庫。紅骨髓會隨著年齡的增K而逐漸減少，當生命種子的源泉枯竭到一定程度時，油盡燈自熄，我們就是這樣衰老死亡的！如果骨髓是人體干細胞中心的理論是正確的話，因骨髓中含有造血干細胞、間充質干細胞和內皮祖細胞，由于內皮祖細胞是由間充質干細胞分化而來的，因此，只要補充遺傳背景與宿主相同的年輕的造血干細胞和間充質干細胞這兩種干細胞就可以使個體發生返老還童。三、成體干細胞端粒縮短是造成個體衰老的首要原因有不少學者認為，個體衰老是由個體組織中的成體干細胞數量減少造成的，而非成體干細胞本身發生增齡性的內在變化。據此認為，只要組織中的干細胞的自我更新率保持在0. 5，即后代有50%左右仍然是干細胞，干細胞的數量就可以保持恒定不變，個體就可以青春永駐。實驗室測定小鼠的造血干細胞的自我更新率高于0. 5，一般在0. 6至0. 7之間。按理說小鼠不應該逐漸地發生衰老的，但實際上小鼠的個體還是發生了持續漸進性的增齡變化-衰老。這說明了什么？只能說明個體衰老是由組織中的成體干細胞本身發生了內在的增齡變化，而非干細胞數量的減少；蔣松柏用能夠促進干細胞自我更新率的藥物喂小鼠，小鼠的單核細胞數比對照組高167% (復旦大學生命科學院實驗報告)，說明小鼠的細胞增殖活性非常旺盛，但是，小鼠最終還是擺脫不了自然的衰老與死亡。據此可以認為， 采用分離出老年人體內的多向干細胞，在體外擴增后再注入老年人體內的療法，不會使機體發生返老還童。成體干細胞經過反復的對稱性與非對稱性分裂，染色體末端稱為端粒的結構會越來越短。已經證明，端粒越短，基因的表達效率就越低，成體干細胞的自我更新潛能和多向分化潛能就越低，因此，成體干細胞端粒縮短是造成個體衰老的首要原因。一般來說，年輕人身體比較健康，可一到老年期，就會變得體弱多病，什么癌癥、糖尿病、心腦血管等等的疾病接踵而來。因此，逆轉機體衰老可以讓所有與增齡有關的疾病不攻自破。為此，制造遺傳背景與患者一致、端粒較長的成體多向干細胞是逆轉衰老和治愈頑疾的萬能藥物。四、細胞衰老與細胞分化程序的逆轉把0ct3/4等四個基因轉入體細胞，體細胞會經去分化過程，稱“重編程”，變成誘導多能干細胞(induction ofpluripotent stem cells，iPS 細胞)(山中伸彌等人，2006)。 iPS細胞的性質與胚胎干細胞一樣，具有全能性，可以分化成人體的200多種細胞。培養的 iPS細胞能夠分化成各種成體干細胞，如造血干細胞、間充質干細胞等。重編程原理不同分化類型的細胞，DNA有著不同的甲基化型式，即有著不同的表遺傳，如果要全部回復到一致性，必須要先刪除掉DNA上的所有甲基基團，以此消除不同類型細胞之間的表遺傳差異。然后DNA再全部甲基化，以便以后用于重塑(分化)各種類型的細胞；為了讓一種細胞能夠按照先后順序地塑造出各種不同類型的細胞(即塑造出不同的表遺傳)，使基因能夠按照發育程序的要求進行程序化表達。必須需要一種動力來推動基因程序運作，就像放電影時要由電動機提供動力推動膠帶不斷地向前位移，才能從頭到尾順序地播放節目、或計算機硬盤需要電動機推動硬盤旋轉才能程序化地讀取指令，因此，在細胞重編程過程中，相當于電影放映機或計算機硬盤驅動器中電動機的端粒也得到了有效地延伸，為以后的個體發育過程的基因程序化表達提供推動力，這就是作為生命種子的精子， 其端粒為什么要延伸到151Λ的原因。總之，生物發育的表遺傳程序的編制與指令讀取和計算機、電影機的基本原理是一樣的，只是方式不同而已。
發明內容
本發明的目的是用動物生產人類成體多向干細胞，其特征步驟包括1、把人的體細胞誘導轉化成iPS細胞；2、把iPS細胞植入無免疫力的裸鼠皮下，讓iPS細胞發育成畸胎瘤，然后取出畸胎瘤并從瘤體中分離出間充質干細胞和造血干細胞；3、把經過細胞抑制分化處理的iPS細胞與從畸胎瘤中分離的間充質干細胞和造血干細胞一起注入還沒有建立起免疫耐受性的動物胚胎中。4、動物胎兒出生后向動物胎兒注射一次功能正常的iPS細胞；5、然后從動物血液或骨髓中分離出人的造血干細胞和間充質干細胞。iPS細胞端粒長度可以保持一定水平，是一種可以保持永生化的和胚胎干細胞性質一樣的干細胞，植入動物體內可以源源不斷地分化出年輕的各種成體干細胞，使動物可以源源不斷地為人類生產年輕的各種成體干細胞。因此，本發明具有生產出的人的成體干細胞年齡較低，多向分化潛能，增殖代數和分裂活性較高。而且可以為每個人進行量身定做，使成體干細胞的遺傳背景和細胞接受者的人相同，不會被受者的免疫系統排斥掉，可以在受者體內長期生存和發揮作用。
具體實施例方式下面對本發明做進一步詳細描述。用動物生產人類成體多向干細胞，其特征步驟包括1、把人的體細胞誘導轉化成iPS細胞；2、把iPS細胞分成2份，一份iPS細胞暫時凍存備用，另一份iPS細胞植入無免疫力的裸鼠皮下，讓iPS細胞發育成畸胎瘤，然后取出畸胎瘤并從瘤體中分離出間充質干細胞和造血干細胞，或把iPS細胞培養成胚狀體(embryoid bodies, EBs)集落，然后從胚狀體集落中分離出間充質干細胞和造血干細胞；3、解凍一部分凍存的iPS細胞，然后進行細胞抑制分化處理，然后把經過細胞抑制分化處理的iPS細胞與從畸胎瘤或胚狀體集落中分離的間充質干細胞和造血干細胞一起注入還沒有建立起免疫耐受性的動物胚胎中，所述的動物胚胎可以是豬、羊、或雞等。4、解凍一部分凍存的iPS細胞，在動物胎兒出生后向動物胎兒注射一次功能正常的iPS細胞，飼養長大利用；5、利用，是在動物生存期，每隔一段時間用干細胞動員劑把人的造血干細胞和間充質干細胞從動物骨髓中動員到血液中，或抽取動物的骨髓，然后從血液或骨髓中分離出人的造血干細胞和間充質干細胞，剩下的動物細胞要回輸動物體內。綿羊胚胎大約在45天至75天之間產建立起免疫耐受性的誘導，因此，iPS細胞、 間充質干細胞和造血干細胞在綿羊的胎齡為45天至60天之間進行宮內移植為佳。其它品種的動物可根據實際情況確定時期。從胚狀體集落中分離出的間充質干細胞和造血干細胞的細胞生物學年齡比較幼稚，注入動物胚胎后會歸巢到胎肝部位，并逐漸發育成熟，使動物能夠對各種生物學年齡的人間充質干細胞和造血干細胞產生耐受性，因為不同生物學年齡的細胞會有不同的基因發生表達。綿羊體內的微環境比較適于人細胞生存，因此，人的細胞比例較大，據報道，綿羊-人細胞嵌合體的綿羊，含有15%的人細胞。畸胎瘤中不但含有各種干細胞，而且還含有各種瘤體起源的非干細胞，干細胞是被各種非干細胞包裹在瘤體中的，很少能釋放到血液循環中。本發明的動物，在胚胎產生免疫耐受期時沒有接觸過除了人的iPS細胞、間充質干細胞和造血干細胞以外的人體細胞， 當人的iPS細胞、間充質干細胞和造血干細胞分化出各種人的體細胞時，這些人的體細胞就會很快被動物的免疫系統刪除掉，只留下人的iPS細胞、間充質干細胞和造血干細胞，因此，干細胞不會被非干細胞包裹住，干細胞就可以不受約束地釋放到血液循環中，并隨著血液循環達到骨髓組織中定居。而所述的iPS細胞進行細胞抑制分化處理就是防止iPS細胞在胚胎中分化出其它類型的細胞，以此避免胚胎對除了 iPS細胞、造血干細胞和間充質干細胞以外的由iPS細胞分化的其它類型的細胞產生免疫耐受。細胞抑制分化處理的方法可以把iPS細胞用大劑量輻射照射，或進行細胞脫核處理，目的就是使細胞不會進行分化，但細胞還活著。當然，也可能會有一部分動物，iPS細胞在動物體內會產生畸胎瘤，由于畸胎瘤是一種良性腫瘤，一般不會要動物的命，而且畸胎瘤中的造血干細胞和間充質干細胞也有一部分會釋放到血液循環中。畸胎瘤中含有各種成體干細胞和iPS細胞，因此，從畸胎瘤中可以分離出多種成體干細胞用于干細胞移植療法，但是，科學家擔心殘余的少量iPS細胞有致瘤性，于是，今年美國斯坦福大學的科學家采用一種抗體成功地刪除掉其中殘余的iPS細胞。我認為這種做法是多余的，因為iPS細胞是胚胎產生免疫耐受期之前的細胞，有一些抗原沒有經過免疫識別耐受，因此，即使遺傳背景與宿主相同，宿主體內的免疫系統也會把它當做異物排斥掉。《參考消息》報2011. 5. 16日第七版題為“人工干細胞動物實驗失敗”，說英國科學家把 iPS移植到小鼠體內遭到排斥，造成這種后果我曾經(燕京醫學通訊，1998 ；66 =1058,1060, 本文是內部刊物，要索取本文請到燕京函授醫學院，地址北京市海淀區復興路21號(公主墳西北側衛國中學內))說過，轉化(年輕化)的干細胞可能會表達胚胎免疫系統沒有識別和耐受的胚性抗原，會引發免疫排斥，如iPS細胞會表達0ct3/4基因，而該基因在成體細胞中則沒有表達；今年5月13日在《自然》雜志的一篇文章報道“重編程細胞同源移植也會排斥”，美國加州大學圣地亞哥分校的研究者把小鼠體細胞重編程的iPS細胞分化的成體細胞移植到細胞來源的小鼠體內，本來以為遺傳背景相同不會發生排斥，可小鼠卻快速排斥移植來的細胞。研究者發現由iPS細胞分化的成體細胞高表達兩種基因，而這兩種基因在正常小鼠體細胞內沒有表達。因此，雖然從動物的血液和骨髓中分離的人成體干細胞中可能會污染少量的iPS細胞，但無需凈化也可以放心使用。導致上述“重編程細胞同源移植也會排斥”的原因有(1) iPS細胞剛分化的細胞還沒有成熟，即過于幼稚，還在表達胚胎免疫耐受前的基因，只要讓細胞培養增殖幾次，細胞就會成熟到不會表達胚性基因，成體的免疫系統就不會排斥它了。就像胎肝細胞會表達甲胎蛋白，成熟的肝細胞不會表達甲胎蛋白一樣；( 用于重編程的體細胞本身已經發生了突變，誘導轉化成的iPS細胞同樣攜帶突變的基因，再分化成的成體細胞還是攜帶突變的基因，個體的免疫系統當然會把它當做異物排斥掉，這和通常個體的免疫系統刪除突變的體細胞的動機是一樣的。已有的生產干細胞的方法(l)iPS細胞在適當的培養液下也可以分化成各種成體干細胞，但是，在體外培養的條件下每3個細胞分裂一次就有1次突變發生，并且其突變具有累積效應，因此，經過若干代增殖后，一群細胞中的大部分細胞都是突變的，不但沒有實用價值，而且還有副作用；( 今年日本科學家把人的iPS細胞注入無免疫力的裸鼠皮下，待畸胎瘤長到直徑2厘米時取出，從瘤體中提取間充質干細胞獲得成功，但是，無免疫力的裸鼠不會把突變的細胞刪除掉，因此，時間長了，同樣存在著突變累積效應，而且生產量又比較小；C3)把成體干細胞注入還沒有建立起免疫耐受性的早期動物胚胎中，待動物出生后就可以生產人的成體干細胞，現在已經在綿羊體內成功地擴增了人的造血干細胞。
6但是，由于擴增的造血干細胞是取自成年人或老年人的，有著成年人或老年人的年齡烙印， 又在動物體內分裂增殖，端粒會進一步地縮短，還是沒有實用價值。高等動物的免疫系統除了能夠消滅外來病原體外，還能刪除掉自身突變的細胞株。因此，在本發明的動物體內的人iPS細胞、間充質干細胞和造血干細胞如果有發生突變的細胞株，就會被動物的免疫系統刪除掉，以此可以防止突變細胞的累積。本發明的各種技術是現成的，這里無需詳細贅述，請查看相關文獻。
權利要求
1.用動物生產人類成體多向干細胞，其特征步驟包括1、把人的體細胞誘導轉化成 iPS細胞；2、把iPS細胞分成2份，一份iPS細胞暫時凍存備用，另一份iPS細胞植入無免疫力的裸鼠皮下，讓iPS細胞發育成畸胎瘤，然后取出畸胎瘤并從瘤體中分離出間充質干細胞和造血干細胞，或把iPS細胞培養成胚狀體集落，然后從胚狀體集落中分離出間充質干細胞和造血干細胞；3解凍一部分凍存的iPS細胞，然后進行細胞抑制分化處理，然后把經過細胞抑制分化處理的iPS細胞與從畸胎瘤或胚狀體集落中分離的間充質干細胞和造血干細胞一起注入還沒有建立起免疫耐受性的動物胚胎中；4、解凍一部分凍存的iPS細胞， 在動物胎兒出生后向動物胎兒注射一次功能正常的iPS細胞，飼養長大利用；5、利用，是在動物生存期，每隔一段時間用干細胞動員劑把人的造血干細胞和間充質干細胞從動物骨髓中動員到血液中，或抽取動物的骨髓，然后從血液或骨髓中分離出人的造血干細胞和間充質干細胞，剩下的動物細胞要回輸動物體內。
2.根據權利要求1所述的用動物生產人類成體多向干細胞，其特征是所述的動物胚胎是豬、羊、或雞。
全文摘要
用動物生產人類成體多向干細胞，步驟包括把人的體細胞誘導轉化成iPS細胞，然后把進行抑制分化處理的iPS細胞與間充質干細胞和造血干細胞一起注入還沒有建立起免疫耐受性的動物胚胎中，出生后再注射功能正常的iPS細胞，以后就可以在成年動物中源源不斷提取人的干細胞。本發明具有生產出的人的成體干細胞年齡較低，多向分化潛能，增殖代數和分裂活性較高，而且可以為每個人進行量身定做。一般來說，年輕人身體比較健康，可一到老年期，就會變得體弱多病，什么癌癥、糖尿病、心腦血管等等的疾病接踵而來。因此，逆轉機體衰老可以讓所有與增齡有關的疾病不攻自破。為此，制造遺傳背景與患者一致、端粒較長的成體多向干細胞是逆轉衰老和治愈頑疾的萬能藥物。
文檔編號C12N5/0775GK102391986SQ20111035412
公開日2012年3月28日 申請日期2011年10月24日 優先權日2011年10月24日
發明者黃必錄 申請人:黃必錄