專利名稱：轉dbr2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法
技術領域：
本發明涉及的是ー種生物技術領域的提高青蒿素含量的方法，特別是ー種轉DBR2
基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。
背景技術：
青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿屬的一年生草本植物。青蒿素(artemisinin)是從其地上部分分離的ー種含有過氧橋結構的倍半職內酯化合物,是目前世界上公認的最有效的治療瘧疾的藥物，特別是對于腦型瘧疾和抗氯喹瘧疾具有速效和低毒的特點。目前，世界衛生組織推薦的最有效的治療瘧疾的方法就是青蒿素聯合療法(ACTs)。另外，隨著對青蒿素藥理研究的逐步深入，科學家發現青蒿素及其衍生物還具有抗炎、抗血吸蟲、抗腫瘤以及免疫調節的功能。可見青蒿素是ー種極具潛力的天然藥物。目前青蒿素的主要來源是從青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低，不同種植環境和種植品種中其平均含量在青蒿葉片干重的0.01-1 %，使得這種藥物的大規模商業化生產受到了限制。由于青蒿素結構復雜，人工合成難度大，產量低，成本高，不具有可行性。有人嘗試用組織培養和細胞工程的方法來生產青蒿素，然而青蒿素在愈傷組織中含量低于干重的O. I %，在芽中最高也只有干重的O. 16%，而大多數研究在根中沒有檢測到青蒿素。因此利用組織培養及細胞工程來生產青蒿素的可行性也不高。經對現有技術文獻檢索發現，Waleerat Banyai等在《Plant Cell Tissueand Organ Culture))(植物細胞組織器官培養)，2010年103卷255-265頁發表了題為“Overexpression of farnesyl pyrophosphate syntnase(FPS) gene atfectedartemisinin content and growth of Artemisia annua L.，，(“過量表達法ノ匕羞焦磷酸合酶基因能影響青蒿中青蒿素的含量及青蒿的生長”)的論文，報道通過過最表達法尼基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthase, FPS),使轉基因青蒿中青蒿素的含量提高了2. 5-3. 6倍，但仍然只有I. 3%左右。不過，植物基因工程為提高青蒿中青蒿素的含量提供了一條可行的方法。現有技術中青蒿醒Δ 11 (13)還原酶(artemisinic aldehyde Δ 11 (13) doublebond reductase, DBR2)是青蒿素合成途徑中的ー個關鍵酶，是青蒿素代謝工程的重要靶點。采用基因工程手段，用關鍵酶基因DBR2轉化青蒿，將打破青蒿素生物合成的限速瓶頸，獲得青蒿素高產的青蒿植株，為規模化生產青蒿素提供一條新途徑。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供ー種轉DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。本發明涉及的關鍵酶基因克隆、載體構建、遺傳轉化、分子檢測、青蒿素提取及含量測定用于本發明，建立了穩定提高青蒿中青蒿素含量的方法，為利用青蒿大規模生產青蒿素奠定堅實的基礎。本發明是通過以下技術方案實現的
ー種轉DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，包括如下具體步驟(I)采用基因克隆方法獲得青蒿關鍵酶基因DBR2 ；(2)把所述DBR2基因連結于表達調控序列，構建含DBR2基因的植物表達載體；
(3)將所述含DBR2基因的植物表達載體轉化根瘤農桿菌，獲得含所述DBR2基因植物表達載體的根癌農桿菌菌株；(4)利用所述含DBR2基因植物表達載體的根瘤農桿菌菌株轉化青蒿，獲得經PCR檢測的整合外源目的基因DBR2的轉基因青蒿植株；(5)對所述轉基因青蒿中青蒿素含量進行HPLC-ELSD測定，篩選獲得青蒿素含量提高的轉基因青蒿植株。優選的，在所述步驟(I)中，所述基因克隆方法包括以下步驟提取青蒿基因組 總RNA，將所獲的青蒿基因組總RNA通過反轉錄酶XL反轉錄獲得第一鏈cDNA，根據SEQ IDNO. I所示的DNA序列，設計擴增出完整編碼框的上游引物和下游引物，所述上游引物為SEQID NO. 2所示的DNA序列，所述下游引物為SEQ ID NO. 3所示的DNA序列，并在所述上游和下游引物上分別引入限制性內切酶位點以便構建表達載體，以所述的第一鏈cDNA為模板，經PCR擴增后進行測序。優選的，在所述步驟(2)中，所述構建含DBR2基因的植物表達載體包括以下步驟先構建中間載體PMDT18-DBR2，再用XmaI和SacI酶切中間載體pMDT18_DBR2和表達載體FSN,回收DBR2基因片段和FSN載體大片段，連接轉化，挑取單克隆，提取質粒做PCR檢測和酶切驗證。進ー步優選的，所述構建中間載體pMDT18_DBR2包括以下具體步驟通過高保真酶擴增DBR2基因前后分別引入XmaI和SacI酶切位點的基因全長，通過連接酶連接到PMDT18載體上。優選的，在所述步驟⑷中，所述轉化包括以下步驟外植體的預培養；農桿菌與外植體的共培養；抗性再生植株的篩選。進ー步優選的，所述預培養包括以下步驟青蒿種子用75%こ醇浸泡lmin，再用20% NaClO浸泡20min，無菌水沖洗3_4次，用無菌吸水紙吸干表面水分，接種于無激素的MS固體培養基中，25°C光照培養，即可獲得青蒿無菌苗，待苗長至5cm左右后，剪取無菌苗葉片外植體用于轉化。進ー步優選的，所述共培養包括以下步驟將所述葉片外植體轉到共培養培養基中，滴加含活化好的所述含DBR2基因植物雙元表達載體的根瘤農桿菌工程菌的1/2MS懸液，使外植體與菌液充分接觸，28°C暗培養3天，以滴加在不帶有目的基因的根瘤農桿菌的1/2MS液體培養基懸液的葉片外植體為對照。進ー步優選的，所述篩選包括以下步驟將所述共培養3天的青蒿外植體轉入到發芽篩選培養基上于25°C光照培養，每兩周繼代培養一次，經過2-3次繼代后即可獲得Kan抗性叢生芽，將所述生長良好的抗性叢生芽剪下轉入生根培養基上培養至生根，即可獲得Kan抗性再生青蒿植株。優選的，在所述步驟(4)中，所述PCR檢測包括以下步驟設計合成DBR2基因的引物；進行DNA擴增；紫外線下觀察，若目的條帶為陽性，則該株系即為所述轉基因青蒿植株。優選的，在所述步驟(5)中，所述HPLC-ELSD測定包括以下條件所用色譜柱為C-18反相硅膠柱，流動相選用體積比為70 30的甲醇7K，柱溫30°C，流速I. OmL/min,進樣量20 μ L，蒸發光散射檢測器漂移管溫度40°C，放大系數為7，載氣壓力5bar。本發明的轉DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，采用基因工程方法，將關鍵酶基因DBR2導入青蒿植株中，獲得了青蒿素含量顯著提高的轉基因青蒿株系，轉DBR2基因青蒿中青蒿素的含量最高可達到干重的22. 6mg/g，是非轉化普通青蒿(8mg/g干重)的2. 83倍，該發明對于為青蒿素的規模化生產提供高產、穩定新藥源具有重要意義。
圖I為本發明的青蒿植株中青蒿素的含量檢測結果圖。
具體實施例方式下面對本發明的實施例作詳細說明本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施 例。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如SambiOOk等分子克隆實驗室手冊' (New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例步驟一，青蒿DBR2基因的克隆(I)青蒿基因組總RNA的提取取100-200mg青蒿幼嫩葉片，用液氮速凍后，迅速用研缽研碎，加入盛有ImLTRlzol (TRlzol Reagents, GIBC0BRL, USA)的 I. 5mL Eppendorf 管中，充分振蕩后，于室溫下放置5min,加200 μ L氯仿，用カ振蕩15sec,室溫放置2_3min后，于4°C下12, OOOrmp離心15min ;將上清液(約600 μ L)吸入干凈的I. 5mL Eppendorf管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫下放置IOmin后，于4°C下12，OOOrmp離心IOmin ;棄上清,加ImL 75%こ醇清洗，振蕩后，于4で下7，500rmp離心5min ;室溫干燥10_15min后溶于適量(30-40 μ L)RNAase-free水中；用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質量，然后在分光光度計上測定RNA含量。(2)青蒿DBR2基因的克隆將所獲的青蒿基因組總RNA通過反轉錄酶XL(AMV)反轉錄獲得第一鏈cDNA，根據所述青蒿DBR2基因的編碼序列(SEQ ID NO. I所示的DNA序列)，設計擴增出完整編碼框的上游引物(SEQ ID NO. 2所示的DNA序列)和下游引物(SEQ ID NO. 3所示的DNA序列)，并在上游和下游引物上分別引入限制性內切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構建表達載體。以所述的第一鏈cDNA為模板，經PCR擴增后進行測序。DNA序列測定由上海英駿生物技術服務有限公司測序完成。測序結果表明，所克隆的序列與GenBank中所報道的青高DBR2基因的編碼序列(SEQ ID NO. I所不的DNA序列)一致。本實施例采用基因克隆方法從青蒿中獲得序列正確的青蒿素生物合成關鍵酶基因DBR2，為通過轉DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量提供了ー個重要關鍵酶基因。步驟ニ，含DBR2基因的植物雙元表達載體的構建(I)中間載體pMDT18-DBR2的構建
選用pMDT18載體(Takara，Dalian)為基本元件，構建中間載體pMDT18_DBR2。具體地，通過高保真酶擴增DBR2基因前后分別引入XmaI和SacI酶切位點的基因全長，通過連接酶連接到PMDT18載體上，由上海英駿生物技術服務有限公司測序確認基因的正確性。(2)含DBR2基因的植物表達載體的構建以所述的FSN (FSN表達載體為在pCAMBIA2300表達載體上改造獲得并保存)為表達載體，將上述DBR2基因連入其對應的酶切位點位置。具體地，XmaI和SacI雙酶切中間載體pMDT18-dbr2和表達載體FSN。回收DBR2基因片段和FSN載體大片段，連接轉化，挑取單克隆，提取質粒做PCR檢測和酶切驗證。本實施例將青蒿素生物合成途徑關鍵 酶基因DBR2可操作性地連接于表達調控序列，形成含DBR2基因的植物表達載體，該表達載體可用于通過代謝工程策略來提高青蒿中
青蒿素的含量。步驟三，含DBR2基因雙元植物表達載體根瘤農桿菌工程菌的獲得將上述含DBR2基因的植物雙元表達載體轉入根瘤農桿菌(如EHA105，為市場有公開出售的生物材料，可以從澳大利亞CAMBIA公司購得，菌株編號為Gambar I)，并進行PCR驗證。步驟四，根瘤農桿菌介導DBR2基因轉化青蒿(I)外植體的預培養青蒿種子用75%こ醇浸泡lmin，再用20% NaClO浸泡20min，無菌水沖洗3_4次，用無菌吸水紙吸干表面水分，接種于無激素的MS(Murashige and Skoog, 1962)固體培養基中，25°C、16h/8h (light/dark)光照培養，即可獲得青蒿無菌苗。待苗長至5cm左右后，剪取無菌苗葉片外植體用于轉化。(2)農桿菌與外植體的共培養將所述的葉片外植體，轉到共培養培養基(1/2MS+AS 100ymol/L)中，滴加含活化好的所述含DBR2基因植物雙元表達載體的根瘤農桿菌工程菌的1/2MS懸液，使外植體與菌液充分接觸，28°C暗培養3天。以滴加在不帶有目的基因的根瘤農桿菌的1/2MS液體培養基懸液的葉片外植體為對照。(3)抗性再生植株的篩選將所述的共培養3天的青蒿外植體轉入到發芽篩選培養基(MS+6-BA O. 5mg/L+NAA O. 05mg/L+Kan 50mg/L+Cb 500mg/L)上于 25°C、16h/8h(light/dark)光照培養，甸兩周繼代培養一次，經過2-3次繼代后即可獲得Kan抗性叢生芽。將生長良好的抗性叢生芽剪下轉入生根培養基(1/2MS+Cb 125mg/L)上培養至生根，從而獲得Kan抗性再生青蒿植株。步驟五，轉基因青蒿植株的PCR檢測根據目的基因所在表達盒p35s-dbr2_nos序列p35s和dbr2分別設計正向引物和反向引物對目的基因進行檢測。結果表明，利用所設計的PCR特異引物，能擴增出458bp的特異DNA片段。而以非轉化青蒿基因組DNA為模板吋，沒有擴增出任何片段。本實施例將所述的植物表達載體轉化根瘤農桿菌，獲得用于轉化青蒿的含DBR2基因植物表達載體的根瘤農桿菌菌株，利用所構建的根瘤農桿菌菌株轉化青蒿，獲得經PCR檢測的轉基因青蒿植株。轉基因青蒿植株的獲得為篩選獲得較高青蒿素含量的青蒿株系提供了直接素材。步驟六，利用HPLC-ELSD測定轉基因青蒿中青蒿素含量(l)HPLC-ELSD條件及系統適用性以及標準溶液的配制HPLC :采用 water alliance 2695 系統，色譜柱為 C-18 反相娃膠柱(SymmetryShield TM C18, 5 μ m, 250X4. 6mm, Waters),流動相為甲醇水，甲醇水的體積比為70 30，柱溫30°C，流速I. OmL/min,進樣量10 μ L，靈敏度(AUFS =1.0)，理論塔板數按青蒿素峰計算不低于2000。ELSD :采用water alliance 2420系統，蒸發光散射檢測器漂移管溫度40°C，放大系數(gain)為7,載氣壓力5bar ；精密稱取青蒿素標準品(Sigma公司)2. Omg用ImL甲醇完全溶解,得到2mg/mL青蒿素標準品溶液，保存于_20°C備用。 本實施例中流動相為甲醇水，比例為70% 30%時，青蒿素的保留時間為5. lmin，峰型良好。理論塔板數按青蒿素計算不低于2000。(2)標準曲線的制作將所述對照品溶液在相應色譜條件下分別進樣2 μ L，4 μ L，6 μ L，8 μ L，10 μ L記錄圖譜及色譜參數，分別以峰面積(Y)對標準品含量(X，μ g)進行回歸分析。通過研究，本實施例中青蒿素在4-20 μ g范圍內呈現良好的Iog-Iog線性關系。青蒿素對照品的Iog-Iog線性回歸方程為 Y = 5. 404e+0000X+l. 858e+0000, R2 = O. 999184。(3)樣品的制備和青蒿素含量的測定青蒿素的提取過程基于Van Nieuwerburgh et al. (2006)中報道的方法取少量新鮮的青蒿葉片(l_2g鮮重)，于50ml試管中將其浸沒在IOml氯仿中搖蕩I分鐘，將浸出液倒入新的試管中使氯仿揮發完全，取3ml無水こ醇充分溶解提取物，經O. 22 μ m過濾濾頭過濾后用于HPLC檢測。同吋，氯仿提取后的葉片收集放入60°C烘箱進行烘干，稱重(計算青蒿葉片的干重)；采用HPLC-ELSD測定青蒿素含量，樣品進樣體積為20 μ L，根據峰面積代入線形回歸方程計算出樣品中的青蒿素含量(mg)，再除以樣品的青蒿葉干重(g)，從而計算出青蒿植株中青蒿素的含量。在實施例中轉DBR2基因顯著提高青蒿中青蒿素含量。轉DBR2基因青高中青蒿素的含量最高可達到干重的22. 6mg/g(如圖I所示)，是非轉化普通青蒿(8mg/g干重)的
2.83 倍。本實施例采用HPLC-ELSD法測定了轉基因青蒿中青蒿素含量，采用轉化DBR2基因的代謝工程策略獲得了青蒿素高產的青蒿植株，為規模化生產青蒿素提供了ー種理想方法。
權利要求
1.ー種轉DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，包括如下具體步驟 (1)采用基因克隆方法獲得青蒿關鍵酶基因DBR2； (2)把所述DBR2基因連結于表達調控序列，構建含DBR2基因的植物表達載體； (3)將所述含DBR2基因的植物表達載體轉化根瘤農桿菌，獲得含所述DBR2基因植物表達載體的根癌農桿菌菌株； (4)利用所述含DBR2基因植物表達載體的根瘤農桿菌菌株轉化青蒿，獲得經PCR檢測的整合外源目的基因DBR2的轉基因青蒿植株； (5)對所述轉基因青蒿中青蒿素含量進行HPLC-ELSD測定，篩選獲得青蒿素含量提高的轉基因青蒿植株。
2.根據權利要求I所述的轉DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，在所述步驟(I)中，所述基因克隆方法包括以下步驟提取青蒿基因組總RNA，將所獲的青蒿基因組總RNA通過反轉錄酶XL反轉錄獲得第一鏈cDNA，根據SEQ ID NO. I所示的DNA序列，設計擴增出完整編碼框的上游引物和下游引物，所述上游引物為SEQ ID NO. 2所示的DNA序列，所述下游引物為SEQ ID NO. 3所示的DNA序列，并在所述上游和下游引物上分別引入限制性內切酶位點以便構建表達載體，以所述的第一鏈cDNA為模板，經PCR擴增后進行測序。
3.根據權利要求I所述的轉DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，在所述步驟(2)中，所述構建含DBR2基因的植物表達載體包括以下步驟先構建中間載體PMDT18-DBR2,再用XmaI和SacI酶切中間載體pMDT18_DBR2和表達載體FSN，回收DBR2基因片段和FSN載體大片段，連接轉化，挑取單克隆，提取質粒做PCR檢測和酶切驗證。
4.根據權利要求3所述的轉DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，所述構建中間載體PMDT18-DBR2包括以下具體步驟通過高保真酶擴增DBR2基因前后分別弓I入XmaI和SacI酶切位點的基因全長，通過連接酶連接到pMDT18載體上。
5.根據權利要求I所述的轉DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，在所述步驟(4)中，所述轉化包括以下步驟外植體的預培養；農桿菌與外植體的共培養；抗性再生植株的篩選。
6.根據權利要求5所述的轉DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，所述預培養包括以下步驟青蒿種子用75%こ醇浸泡Imin,再用20% NaClO浸泡20min,無菌水沖洗3-4次，用無菌吸水紙吸干表面水分，接種于無激素的MS固體培養基中，25°C光照培養，即可獲得青蒿無菌苗，待苗長至5cm左右后，剪取無菌苗葉片外植體用于轉化。
7.根據權利要求5所述的轉DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，所述共培養包括以下步驟將所述葉片外植體轉到共培養培養基中，滴加含活化好的所述含DBR2基因植物雙元表達載體的根瘤農桿菌工程菌的1/2MS懸液，使外植體與菌液充分接觸，28°C暗培養3天，以滴加在不帶有目的基因的根瘤農桿菌的1/2MS液體培養基懸液的葉片外植體為對照。
8.根據權利要求5所述的轉DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，所述篩選包括以下步驟將所述共培養3天的青蒿外植體轉入到發芽篩選培養基上于25°C光照培養，每兩周繼代培養一次，經過2-3次繼代后即可獲得Kan抗性叢生芽，將所述生長良好的抗性叢生芽剪下轉入生根培養基上培養至生根，即可獲得Kan抗性再生青蒿植株。
9.根據權利要求I所述的轉DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，在所述步驟(4)中，所述PCR檢測包括以下步驟設計合成DBR2基因的引物；進行DNA擴增；紫外線下觀察，若目的條帶為陽性，則該株系即為所述轉基因青蒿植株。
10.根據權利要求I所述的轉DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，在所述步驟(5)中，所述HPLC-ELSD測定包括以下條件所用色譜柱為C-18反相硅膠柱，流動相選用體積比為70 30的甲醇7K，柱溫30°C，流速I. OmL/min,進樣量20 μ L，蒸發光散射檢測器漂移管溫度40°C，放大系數為7，載氣壓力5bar。
全文摘要
本發明是一種生物技術領域的轉DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。本發明從青蒿中克隆青蒿醛Δ11(13)還原酶DBR2的基因，構建含DBR2基因的植物表達載體，用根癌農桿菌介導，將DBR2基因轉入青蒿并再生出植株，PCR檢測外源目的基因DBR2的整合情況，高效液相色譜法及蒸發光散射檢測器測定(HPLC-ELSD)轉基因青蒿中青蒿素的含量，篩選獲得青蒿素含量提高的轉基因青蒿植株。本發明獲得的轉基因青蒿中青蒿素的含量顯著提高，最高達到非轉化對照植株的2.83倍，從而提供了一種提高青蒿中青蒿素含量的方法，為利用轉基因青蒿大規模生產青蒿素打下了基礎。
文檔編號C12N15/84GK102676578SQ20121001422
公開日2012年9月19日 申請日期2012年1月17日 優先權日2012年1月17日
發明者吳韶龑, 唐克軒, 沈乾, 王濤, 陸續, 陳韻斐 申請人:上海交通大學