專利名稱：磷酸三酯酶突變體及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術，具體涉及一種磷酸三酯酶突變體及其制備方法和應用。
背景技術：
磷酸三酯酶(Phosphotriesterase, EC 3. I. 8. I)可以水解廣譜的有機磷化合物，后者被廣泛的用于農業殺蟲劑和化學戰神經毒劑，磷酸三酯酶能夠催化斷裂有機磷化合物的磷酯鍵而使其脫毒。如下式所示
... gj . ...+ HOZ H2O、oh
R2、ZR2
R1/R2:焼基Z:釀.脂肪族.芳香族S味壞基團有機磷化合物對人及家畜具有極強的毒副作用。一些比較常見的有機磷化合物及其毒性見表I。至今有超過100種有機磷殺蟲劑在世界各地廣泛使用，約占殺蟲劑種類的38%。僅在美國每年大約有5萬噸有機磷殺蟲劑用于農業生產，除此每年通過“牛蚤根除計劃”大約產生40萬升蠅毒磷(coumaphos)廢液；而一些歐盟國家生產數百萬升地亞農(diazinon)用于清洗羊毛藥水。由于過量和連續的使用，許多土地和水資源遭到了嚴重的污染，對人類健康構成了巨大威脅(Singh, B. K. Organophosphorus-degrading bacteria ecology and industrial applications. Nat. Rev. Microbiol. 2009,7 (2) :156-164.)。世界上每年大概有三百萬人由于有機磷攝入中毒，其中約二十萬人死亡(Karalliedde，L. , Senanayake, N. , Organophosphorus insecticide poisoning.J. Int.Fed.Cl in.Chem. 1999,11(2) :4_9.)。另一方面，世界上用于軍事儲備的化學戰神經毒劑約為20萬噸，根據國際化學武器條約這些化學武器在2023年前需要全部銷毀。因此磷酸三酯酶在有機磷污染物的降解、除污、生物傳感器、醫藥研發等領域具有廣闊的應用潛力。表I幾種常見的有機磷化合物及其毒性
權利要求
1.一種磷酸三酯酶突變體，其特征在于，所述突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，其中包含以下8個氨基酸突變Phe28Ile、Tyr99Leu、Thrl71Ser、Phe228Leu、Asn269Ser、Val270Gly、Trp271Cys、Gly273Asp。
2.如權利要求I所述的磷酸三酯酶突變體的制備方法，其特征在于由來源于G. kaustophilus HTA426的磷酸三酯酶基因進行分子進化，以構建好的含有磷酸三酯酶基因的表達質粒為模板，運用易錯PCR的方法，經過多輪的突變和篩選，最終獲得磷酸三酯酶突變體；所述磷酸三酯酶野生型的氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。
3.編碼權利要求I所述磷酸三酯酶野生型基因，其特征在于所述磷酸三酯酶野生型基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
4.編碼權利要求I所述磷酸三酯酶突變體基因，其特征在于所述磷酸三酯酶突變體基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
5.如權利要求I所述磷酸三酯酶突變體在降解有機磷毒物中的應用。
6.表達權利要求I所述磷酸三酯酶突變體的大腸桿菌工程菌，其特征在于所述大腸桿菌工程菌命名為pET28a-GkaP(8M)，保藏編號為CGMCC No. 5597。
全文摘要
本發明提供了一種磷酸三酯酶突變體及其制備方法和應用。本發明由來源于嗜熱細菌的Geobacillus kaustophilus HTA426的磷酸三酯酶基因出發，利用易錯PCR的方法，經過多輪的突變和篩選，最終獲得一個磷酸三酯酶活力顯著提高的突變體，在該突變體的氨基酸序列中涉及到的突變為Phe28Ile、Tyr99Leu、Thr171Ser、Phe228Leu、Asn269Ser、Val270Gly、Trp271Cys、Gly273Asp。突變體對于幾種常見的有機磷殺蟲劑的比活力相比野生型得到了顯著提高，在有機磷毒物的生物降解領域具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12R1/19GK102796714SQ20121001519
公開日2012年11月28日 申請日期2012年1月18日 優先權日2012年1月18日
發明者馮雁, 張宇, 安嬌, 楊廣宇 申請人:上海交通大學