由地衣芽孢桿菌轉化細胞制備脂酰基轉移酶的制作方法

專利名稱：由地衣芽孢桿菌轉化細胞制備脂酰基轉移酶的制作方法
技術領域：
本發明涉及脂酰基轉移酶(lipid acyltransferase)的制備。具體而言，本發明涉及通過在芽孢桿菌(Bacillus)宿主細胞(優選地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) 宿主細胞)中表達脂酰基轉移酶來制備脂酰基轉移酶的方法。此外，本發明還涉及芽孢桿菌(優選為地衣芽孢桿菌)在表達脂酰基轉移酶上的應用，還涉及在其基因組中包含編碼脂酰基轉移酶的基因的芽孢桿菌宿主細胞(優選地衣芽孢桿菌宿主細胞)。
背景技術：
已知脂酰基轉移酶在食品應用中具有優勢。已經發現脂酰基轉移酶在食物中具有顯著的酰基轉移酶活性。這種活性在食物的制備方法中有驚人的有益應用。例如，WO 2004/064537公開了通過使用脂酰基轉移酶來原位制備乳化劑的方法和與其相關的優點。因此，需要脂酰基轉移酶的商業制備方法。然而，基因通常可能難以在異源宿主中表達，且在宿主細胞中表達脂酰基轉移酶可能會有問題。WO 2004/064537公開了在枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和大腸桿菌 (Escherichia coli)的表達兩種氣單胞菌(Aeromonas)脂酰基轉移酶。然而，其在枯草芽孢桿菌中的表達很低，同時大腸桿菌不是GRAS生物體并因此不適合作為食品工業用酶的宿主。US 6，255，076公開了在芽孢桿菌(Bacillus)宿主細胞中制備多肽的方法。然而， 此種方法需要使用串聯的啟動子，其中每個啟動子序列可操作地連接編碼所述多肽序列的單拷貝核酸序列。因此，本領域中需要一種制備脂酰基轉移酶的改進方法。

發明內容
本發明的各個方面體現在權利要求書和以下詳述中。
本發明的一個方面涉及脂酰基轉移酶的制備方法，所述方法包括以下步驟(i)提供宿主細胞，優選為芽孢桿菌宿主細胞，其中所述芽孢桿菌宿主細胞為除枯草芽孢桿菌之外的一種，優選為地衣芽孢桿菌細胞；(ii)用編碼脂酰基轉移酶的異源核苷酸序列轉化宿主細胞，所述宿主細胞優選為芽孢桿菌宿主細胞，其中所述芽孢桿菌宿主細胞為除枯草芽孢桿菌之外的一種，優選為地衣芽孢桿菌細胞；和(iii)在啟動子序列的控制下在細胞中表達脂酰基轉移酶。另一方面，本發明涉及包含異源脂酰基轉移酶的芽孢桿菌宿主細胞，其中所述芽孢桿菌宿主細胞為除枯草芽孢桿菌之外的一種，優選為地衣芽孢桿菌宿主細胞。另一方面，本發明涉及芽孢桿菌宿主細胞在制備異源脂酰基轉移酶中的應用，其中所述芽孢桿菌宿主細胞為除枯草芽孢桿菌之外的一種，優選為地衣芽孢桿菌宿主細胞。適合地，與在枯草芽孢桿菌中的表達相比，在芽孢桿菌宿主中的表達可以引起表達的增加，其中所述芽孢桿菌宿主為除枯草芽孢桿菌之外的一種，且優選芽孢桿菌宿主為地衣芽孢桿菌。再一方面，本發明涉及包含編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列的表達載體，所述核苷酸序列可操作地連接一個或多個調控序列，使得所述調控序列能夠在適合的宿主或宿主細胞中表達編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列，優選在芽孢桿菌宿主(或細胞)，其中所述芽孢桿菌宿主(或細胞)為除枯草芽孢桿菌之外的一種，優選在地衣芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌細胞。適合地，所述脂酰基轉移酶可以是重組的脂酰基轉移酶。
具體實施例方式根據本發明的第一方面，本發明提供了脂酰基轉移酶的制備方法，所述方法包括以下步驟(i)提供宿主細胞，優選為芽孢桿菌宿主細胞，其中所述芽孢桿菌宿主細胞為除枯草芽孢桿菌之外的一種，優選為地衣芽孢桿菌細胞；(ii)用編碼脂酰基轉移酶的異源核苷酸序列轉化宿主細胞，優選為芽孢桿菌宿主細胞，其中所述芽孢桿菌宿主細胞為除枯草芽孢桿菌之外的一種，優選為地衣芽孢桿菌細胞；和(iii)在啟動子序列的控制下在細胞中表達脂酰基轉移酶。此外，可以使編碼信號肽的核苷酸序列可操作地連接編碼脂酰基轉移酶的所述異源核苷酸序列。適合地，本發明的方法還包括分離/回收脂酰基轉移酶的附加步驟。另一方面，本發明涉及包含異源脂酰基轉移酶的地衣芽孢桿菌宿主細胞。適合地，所述脂酰基轉移酶可以是重組的脂酰基轉移酶。適合地，在本發明的宿主細胞、載體、方法和/或用途中所用的啟動子序列可以與宿主細胞同源。“與宿主細胞同源”是指來源于宿主生物體；即，所述啟動子序列是在宿主生物體中自然發現的。適合地，所述啟動子序列可以選自由編碼以下啟動子的核苷酸序列組成的組α -淀粉酶啟動子、蛋白酶啟動子、枯草桿菌蛋白酶啟動子、谷氨酸特異性蛋白酶啟動子和果聚糖蔗糖酶啟動子。適合地，所述啟動子序列可以是編碼以下啟動子的核苷酸序列LAT(如來自地衣芽孢桿菌的α-淀粉酶啟動子，也稱作AmyL)、AprL(如枯草桿菌蛋白酶Carlsberg啟動子)、EndoGluC (如來自地衣芽孢桿菌的谷氨酸特異性啟動子)、 AmyQ (如來自解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) α-淀粉酶啟動子的α-淀粉酶啟動子)和SacB(如枯草芽孢桿菌的果聚糖蔗糖酶啟動子)。在本發明的一個實施方案中，所述啟動子序列為α -淀粉酶啟動子的-35至_10 序列，優選為地衣芽孢桿菌α-淀粉酶啟動子的-35至-10序列。所述“_35至-10序列” 描述了相對于轉錄起點的位置。“_35”和“-10”均為框(即多個核苷酸)，每個框包含6個核苷酸，且這些框被17個核苷酸分開。這17個核苷酸通常被稱為“間隔子”。圖55對此進行了說明，其中下劃線處為-35框和-10框。為了避免混淆，本文所用的“_35至-10序列” 是指從-35框的起始至-10框的終止的序列，即包括-35框、長度為17個核苷酸的間隔子和-10框。在一些方面，用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列可以包含GD&c基序和/或GANDY基序。優選地，將所述脂酰基轉移酶表征為具有酰基轉移酶活性并包含氨基酸序列基序 GDSX的酶，其中X是以下氨基酸殘基中的一種或多種L、A、V、I、F、Y、H、Q、Τ、N、M或S。適合地，優選用于本發明載體、宿主細胞、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列可以從以下一個或多個屬的生物體中獲得氣單孢菌屬、鏈霉菌屬(Streptomyces)、酵母菌屬(Saccharomyces)、乳球菌屬(Lactococcus)、分支桿菌屬(Mycobacterium)、鏈球菌屬(Streptococcus) > If lif M (Lactobacillus)、脫亞硫酸菌屬(Desulfitobacterium)、芽孢桿菌屬、彎曲菌屬(Campylobacter)、弧菌科 (Vibrionaceae)、木桿菌屬(XyIeIIa)、硫化葉菌屬(Sulfolobus)、曲霉屬(Aspergillus)、 裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、李斯特菌屬(Listeria)、奈瑟菌屬(Neisseria)、中慢生根瘤菌屬(Mesorhizobium)、雷爾氏菌屬(Ralstonia)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)禾口念珠菌屬(Candida)。優選地，所述脂酰基轉移酶是可以獲得的，且優選從氣單孢菌屬的生物體中獲得。在本發明的一些方面，用于本發明載體、宿主細胞、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列所編碼的脂酰基轉移酶在對應于SEQ ID No. 35所示的嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)脂酰基轉移酶的氨基酸序列中的N-80位置上包含天冬
氨酸殘基。此外或備選地，用于本發明載體、宿主細胞、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列編碼的脂酰基轉移酶包含SEQ ID No. 16所示的氨基酸序列，或與其具有75%或更高同源性的氨基酸序列。適合地，編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列所編碼的脂酰基轉移酶可以包含SEQ ID No. 16所示的氨基酸序列。本文所用的術語“異源的”是指源自分離的遺傳資源或物種的序列。異源序列是非宿主序列、修飾的序列、來自不同宿主細胞株的序列、或來自宿主細胞的不同染色體位置的同源序列。“同源”序列是指在同一遺傳資源或物種中發現的序列，即其天然存在于宿主細胞的相關物種中。
本文所用的術語“重組的脂酰基轉移酶”是指已經通過遺傳重組的方式制備的脂酰基轉移酶。例如，將編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列插入克隆載體，得到以存在異源脂酰基轉移酶為特征的地衣芽孢桿菌細胞。宿主細胞在本發明的一個實施方案中，用于本發明方法和/或應用中的宿主細胞是地衣芽孢桿菌宿主細胞。已經發現與其它生物體如枯草芽孢桿菌相比，使用地衣芽孢桿菌宿主細胞可使脂酰基轉移酶的表達增加。已經將來自于殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)的脂酰基轉移酶插入到多個常規表達載體中，所述表達載體經設計可分別在枯草芽孢桿菌、多型漢遜酵母 (Hansenula polymorpha)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)禾口塔賓曲霉 (Aspergillus tubigensis)中有最佳的表達。然而，在多型漢遜酵母、粟酒裂殖酵母和塔賓曲霉中僅檢測到極低的水平。這些表達水平低于1 μ g/ml,因此不可能選擇出產生足量蛋白以起始商業生產的細胞(結果未顯示)。相反，地衣芽孢桿菌能夠產生對商業生產的可行性具有吸引力的蛋白水平。具體而言，已經發現在aprE啟動子的控制下時，地衣芽孢桿菌中的表達比在枯草芽孢桿菌中的表達高約100倍，或在A4啟動子的控制下并與纖維素融合時，比在變鉛青鏈霉菌(S. Iividans)中的表達高約100倍(結果未顯示在本文中)。在另一實施方案中，宿主細胞可以為除枯草芽孢桿菌之外的任何芽孢桿菌細胞。優選地，所述芽孢桿菌宿主細胞可以是以下物種中的一種地衣芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌(B. alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌(B. circulars)、克勞氏芽孢桿菌 (B. clausii)、凝結芽孢桿菌(B. coagulans)、堅強芽孢桿菌(B. firmus)、B. lautus、緩慢芽孢桿菌(B. Ientus)、巨大芽孢桿菌(B. megaterium)、短小芽孢桿菌(B.pumilus)或嗜熱脂肪芽抱桿菌(S. stearothermophiIus)。本發明涉及的術語“宿主細胞”所包括具有以下特征的任何細胞包含本文所定義的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列或如上所述的表達載體，且用于具有如本文所定義的特異性質的脂酰基轉移酶的重組制備。因此，本發明的其它實施方案提供了宿主細胞，其包含(如經轉化或轉染)本發明的核苷酸序列，或包含表達具有如本文所定義的特異性質的多肽的核苷酸序列。適合地，在一些實施方案中，宿主細胞可以是蛋白酶缺陷型或無蛋白酶型細胞株和/或α-淀粉酶缺陷型或無α-淀粉酶型細胞株。調控序列在一些應用中，用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的脂酰基轉移酶序列可操作地連接能夠通過如所選宿主細胞(如地衣芽孢桿菌細胞)表達核苷酸序列的調控序列。例如，本發明涵蓋包含可操作地連接此調控序列的本發明核苷酸序列的載體，即所述載體是表達載體。術語“可操作地連接”是指并列放置(juxtaposition)，其中所述組件的關系允許它們能以其希望的方式發揮功能。“可操作地連接”編碼序列的調控序列以這樣的方式連接，即能在與控制序列相容的條件下實現編碼序列的表達。術語“調控序列”包括啟動子和增強子以及其它表達調控信號。所用的術語“啟動子”為本領域的一般含義，如RNA聚合酶結合位點。編碼具有如本文所定義的特定性質的酶的核苷酸序列的增強表達也可以通過選擇調控區(如啟動子、分泌引導子和終止子區)來實現，所述終止子區本質上不是編碼所述酶的核苷酸序列的調控區。適合地，本發明的核苷酸序列至少可以可操作地連接啟動子。適合地，編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列可以可操作地連接編碼終止子序列的核苷酸序列。用于本發明載體、宿主細胞、方法和/或應用中任一項的適合的終止子序列的實例包括α -淀粉酶終止子序列(如，CGGGACTTACCGAAAGAAACCATCAATGATGGTTTCTTTTTTGTT CATAAA-SEQ ID No. 64)、堿性蛋白酶終止子序列(如，CAAGACTAAAGACCGTTCGCCCGTTTTTGCA ATAAGCGGGCGAATCTTACATAAAAATA-SEQ ID No. 65)、谷氨酸特異性終止子序列(如，ACGGCCG TTAGATGTGACAGCCCGTTCCAAAAGGAAGCGGGCTGTCTTCGTGTATTATTGT-SEQ ID No. 66)、果聚糖酶終止子序列(如，TCTTTTAAAGGAAAGGCTGGAATGCCCGGCATTCCAGCCACATGATCATCGTTT-SEQ ID No. 67)和枯草桿菌蛋白酶 E 終止子序列(如，GCTGACAAATAAAAAGAAGCAGGTATGGAGGAACCTGC TTCTTTTTACTATTATTG)。適合地，編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列可以可操作地連接α-淀粉酶終止子，如地衣芽孢桿菌α -淀粉酶終止子。啟動子根據本發明所用的啟動子序列與編碼脂酰基轉移酶的序列可以是異源的或同源的。所述啟動子序列可以是能夠指導脂酰基轉移酶在所選宿主細胞中表達的任何啟動子序列。適合地，所述啟動子序列可以與芽孢桿菌(如地衣芽孢桿菌)同源。優選地，所述啟動子序列與所選宿主細胞是同源的。用于本發明的適合的啟動子序列包括地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因的啟動子、 地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶基因的啟動子、枯草芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶基因的啟動子、地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶基因(枯草桿菌蛋白酶Carlsberg基因)的啟動子、地衣芽孢桿菌谷氨酸特異性蛋白酶基因的啟動子、解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因的啟動子、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶的啟動子和具有α -淀粉酶基因的“_35”區序列TTGACA和“_10” 區序列TATAAT的“共有”啟動子(即-35至-10啟動子)。適合在本發明方法中指導核酸序列轉錄的啟動子的其它實例包括緩慢芽孢桿菌堿性蛋白酶基因(aprH)的啟動子、枯草芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyE)的啟動子、嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽糖淀粉酶基因(amyM)的啟動子、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)的啟動子、枯草芽孢桿菌XylA和XylB基因的啟動子、和/或蘇云金芽胞桿菌擬步行甲亞種 (Bacillus thuringiensis subsp· tenebrionis)CryIIIA 基因的啟動子。在優選實施方案中，所述啟動子序列為α-淀粉酶啟動子(如地衣芽孢桿菌 α-淀粉酶啟動子)。優選地，所述啟動子序列包含地衣芽孢桿菌α-淀粉酶啟動子的-35 至"10序列(參見圖53和圖55)。信號月太
根據所用的序列和/或載體，宿主細胞通過表達編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列所產生的脂酰基轉移酶可以被分泌出或包含在細胞內。信號序列可以用于指導編碼序列分泌通過特定的細胞膜。所述信號序列對脂酰基轉移酶編碼序列來說可以是天然的或外源的。例如，所述信號肽編碼序列可以是從芽孢桿菌物種，優選是從地衣芽孢桿菌獲得的淀粉酶或蛋白酶基因。可以由一種或多種以下基因獲得適合的信號肽編碼序列麥芽糖α-淀粉酶基因、枯草桿菌蛋白酶基因、內酰胺酶基因、中性蛋白酶基因、PrsA基因和/或酰基轉移酶基因。優選地，所述信號肽為地衣芽孢桿菌α -淀粉酶的信號肽、氣單孢菌酰基轉移酶的信號肽(如，mkkwfvcllglialtvqa-SEQ ID No. 21)、枯草芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的信號肽(如，mrskklwi si If alt liftmafsnmsaqa-SEQ ID No. 22)或地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的信號肽(如，mmrkksfwfgmltafmlvftmefsdsasa-SEQ ID No. 23)。適合地，所述信號肽可以為地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的信號肽。然而，可以使用能夠指導所表達的脂酰基轉移酶進入所選芽孢桿菌宿主細胞(優選為地衣芽孢桿菌宿主細胞)的分泌途徑的任何信號肽編碼序列。在本發明的一些實施方案中，編碼信號肽的核苷酸序列可以可操作地連接編碼所選脂酰基轉移酶的核苷酸序列。所選脂酰基轉移酶可以在本文所定義的宿主細胞中作為融合蛋白表達。表達載體術語“表達載體”是指能夠在體內或體外表達的構建體。優選地，所述表達載體被引入到生物體如地衣芽孢桿菌宿主的基因組中。術語“引入”優選涵蓋穩定的引入到基因組中。如本文所定義的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列可以存在于載體中，在該載體中所述核苷酸序列可操作地連接調控序列，使得所述調控序列能夠通過適合的宿主生物體 (如地衣芽孢桿菌)表達所述核苷酸序列，即所述載體是表達載體。本發明的載體可以被轉化到上述的適合的宿主細胞中，以表達具有如本文所定義的脂酰基轉移酶活性的多肽。通常根據其將被引入的宿主細胞來選擇載體(如質粒、粘粒、病毒或噬菌體載體、 基因組插入物)。本發明可以涵蓋具有等同功能且本領域已知或可知的其它形式的表達載體。—旦轉化到所選擇的宿主細胞中，載體可以不依賴宿主細胞的基因組而復制并發揮功能，或可以自行整合進入基因組。所述載體可以包含一種或多種選擇性標記基因，如提供抗生素抗性的基因，如氨芐青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性或四環素抗性的基因。或者，可以通過共轉化完成選擇(如W091/17243中所述)。載體可以在體外使用，例如，用于制備RNA或用于轉染或轉化宿主細胞。因此，在另一實施方案中，本發明提供用于本發明載體、宿主細胞、其它方法和/ 或應用中任一項的本發明的核苷酸序列或編碼具有如本文所定義的特定性質的多肽的核苷酸序列的制備方法，所述方法是通過將核苷酸序列引入可復制載體，將所述載體引入相
8容的宿主細胞，并使宿主細胞在可以進行載體復制的條件下生長。所述載體可以進一步包含能使該載體在所述宿主細胞中復制的核苷酸序列。所述序列的實例為質粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMBl和pIJ702的復制起點。脂酰基轉移酶用于本發明方法、載體和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列可以編碼天然的脂酰基轉移酶或脂酰基轉移酶變體。例如，用于本發明的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列可以是W02004/064537、 W02004/064987、W02005/066347或W02006/008508中所述的一種。這些文獻通過引用并入本文。本文所用的術語“脂酰基轉移酶”優選地是指具有脂酰基轉移酶活性的酶(通常被歸類為E. C. 2. 3. 1. X，如2. 3. 1. 43)，其中所述酶能夠將酰基基團從脂質轉移到一個或多個受體(acceptor)物質，如以下的一種或多種固醇(sterol)、留烷醇(stanol)、碳水化合物、蛋白、蛋白亞基、糖醇(如抗壞血酸和/或甘油)，優選甘油和/或固醇，如膽固醇。優選地，用于本發明載體、宿主細胞、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列編碼能夠將酰基基團從磷脂(如本文所定義)轉移到糖醇(如抗壞血酸和 /或甘油，最優選為甘油)的脂酰基轉移酶。對于一些方面，本發明的“酰基受體”可以是包含羥基基團(-0H)的任何化合物， 例如多價的醇，包括甘油、固醇、留烷醇、碳水化合物；羥酸，包括果酸、檸檬酸、酒石酸、乳酸和抗壞血酸；蛋白或其亞基，如氨基酸、蛋白水解產物和肽(部分水解的蛋白)；和其混合物和衍生物。優選地，根據本發明的“酰基受體”不是水。優選地，根據本發明的“酰基受體” 是糖醇如多元醇，最優選為甘油。出于本發明的目的，抗壞血酸也被認為是糖醇。優選地，所述酰基受體不為甘油單酯。優選地，所述酰基受體不為甘油二酯。一方面，用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列所編碼的脂酰基轉移酶可以且能夠將酰基基團從脂質轉移到甘油，此外能夠將酰基基團從脂質轉移到以下的一種或多種物質碳水化合物、蛋白、蛋白亞基、固醇和 /或留烷醇，優選其能夠轉移到糖醇(如抗壞血酸和/或甘油，最優選為固醇(如膽固醇)) 和/或植物固醇/留烷醇。優選地，脂酰基作用的脂質底物是以下脂質中的一種或多種磷脂，如卵磷脂，如磷脂酰膽堿。所述脂質底物在本文中可以被稱為“脂酰基供體”。本文所用的術語卵磷脂涵蓋磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸和磷脂酰甘油。對于一些方面，用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列優選編碼不能或基本上不能作用于甘油三酯和/或ι-甘油單酯和 /或2-甘油單酯的脂酰基轉移酶。對于一些方面，用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列編碼不表現出三酰基甘油(triacylglycerol)脂肪酶活性 (E. C. 3. 1. 1. 3)或不表現出顯著的三酰基甘油脂肪酶活性(E. C. 3. 1. 1. 3)的脂酰基轉移酶。
水解甘油三酯的能力(E. C. 3. 1. 1. 3活性)可以由根據Food Chemical Codex (3rdEd. ,1981,pp 492-493)(修改為葵花油、pH 5. 5以替代橄欖油、pH 6. 5)測定的脂肪酶活性來測定。脂肪酶活性以LUS(葵花的脂肪酶單位)來測定，其中將ILUS定義為在以上試驗條件下每分鐘可以從葵花油中釋放1 μ mol脂肪酸的酶量。或者，也可以使用如W09845453中定義的LUT試驗。此文獻通過引用并入本文。用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列可以編碼基本上不能作用于甘油三酯的脂酰基轉移酶，所述脂酰基轉移酶的LUS/mg可以小于1000，如小于500、如小于300、優選為小于200、更優選為小于100、更優選為小于50、更優選為小于20、更優選為小于10，如小于5、小于2、更優選為小于lLUS/mg。優選地，LUT/mg活性小于500，如小于300、優選為小于200、更優選為小于100、更優選為小于50、更優選為小于20、更優選為小于10，如小于5、小于2、更優選為小于lLUT/mg。用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列可以編碼基本上不能作用于甘油單酯的脂酰基轉移酶，所述脂酰基轉移酶可以在LUS試驗中使用單油酸酯(M77651-油酰-rac-甘油99% )以替代葵花油來測定。將IMGHU定義為在所述試驗條件下每分鐘可以從甘油單酯中釋放1 μ mol脂肪酸的酶量。用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列可以編碼基本上不能作用于甘油三酯的脂酰基轉移酶，所述脂酰基轉移酶具有的MGHU/mg可以小于5000，如小于1000、如小于500、如小于300、優選為小于200、更優選為小于100、更優選為小于50、更優選為小于20、更優選為小于10 (如小于5、小于2)、更優選為小于 lMGHU/mg。適合地，用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列編碼可以表現出一種或多種以下磷脂酶活性的脂酰基轉移酶磷脂酶A2活性(E. C. 3. 1. 1. 4)和/或磷脂酶Al活性(E. C. 3. 1. 1. 32)。所述脂酰基轉移酶也可以具有磷脂酶B活性(E. C 3. 1. 1. 5)。適合地，對于一些方面，所述脂酰基轉移酶可以能夠將酰基基團從磷脂轉移到糖醇(優選為甘油和/或抗壞血酸)。對于一些方面，優選地用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列編碼能夠將酰基基團從磷脂轉移到固醇和/或留烷醇以至少形成固醇酯和/或留烷醇酯的脂酰基轉移酶。所述脂酰基轉移酶可以能夠將酰基基團從脂質轉移到多元醇(如甘油)和/或固醇(如膽固醇或植物固醇)和/或留烷醇。因此，在一個實施方案中，本發明的“酰基受體”可以為甘油和/或膽固醇或植物固醇和/或留烷醇。優選地，所述脂酰基轉移酶可以使用以下標準進行表征所述酶具有可以被定義為酯轉移活性的酰基轉移酶活性，通過此活性將脂酰基供體的原初酯鍵的酰基部分轉移到酰基受體(優選為甘油或膽固醇)以形成新的酯；和所述酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是以下氨基酸殘基中的一種或多種L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M 或 S。優選地，⑶SX基序的X為L或Y。更優選地，⑶SX基序的X為L。因此，優選本發明的酶包含氨基酸序列基序GDSL。
GDSX基序由四個保守的氨基酸構成。優選地，該基序中的絲氨酸為所述脂酰基轉移酶的催化性絲氨酸。適合地，⑶SX基序的絲氨酸的位置對應于Brumlik和Buckley (Journal of Bacteriology Apr. 1996，Vol. 178，No. 7，ρ 2060-2064)中教導的嗜水氣單胞菌脂酰基轉移酶的kr-16。為了測定蛋白是否具有本發明的⑶SX基序，優選使用W02004/064537或W02004/064987(均通過引用并入本文)中教導的方法，將序列與pfam數據庫的隱馬爾可夫模型序型(hidden markov model profile) (HMM 序型)進行比較。優選地，所述脂酰基轉移酶可以使用Pfam00657共有序列進行比對(完整的解釋可參見 W02004/064537 或 W02004/064987)。優選地，與pfam00657結構域家族的隱馬爾可夫模型序型(HMM序型)的陽性匹配表示存在本發明的GDSL或GDSX結構域。優選地，當與Pfam00657共有序列進行比對時，用于本發明方法和/或應用的脂酰基轉移酶可以具有至少一個、優選為大于一個、更優選為大于兩個的下述部分(block)⑶GANDY、HPT0適合地，所述脂酰基轉移酶可以具有⑶部分和GANDY部分。或者，所述酶可以具有GD&c部分和HPT部分。優選地，所述酶至少包含GD&c部分。更多細節請參見 W02004/064537 或 W02004/064987。優選地，GANDY基序的殘基選自GANDY、GGNDA, GGNDL,最優選為GANDY。優選地，當與Pfam00657共有序列進行比對時，與嗜水氣單胞菌多肽參考序列(SEQ ID No. 1)相比，用于本發明方法和/或應用的酶具有以下氨基酸殘基中的至少一個、優選大于兩個、優選大于三個、優選大于四個、優選大于五個、優選大于六個、優選大于七個、優選大于八個、優選大于九個、優選大于十個、優選大于十一個、優選大于十二個、優選大于十三個、優選大于十四個28hid、29hid、30hid、31hid、32gly、33Asp、34kr、35hid、130hid、131Gly、132Hid、133Asn、134Asp、135hid、309His。Pfam00657⑶SX結構域是區分有此結構域的蛋白和其它酶的獨特標志。表3中顯示了 pfam00657共有序列(SEQ ID No. 2)。其源自于對第6版數據庫pfam家族00657 (在本文中也可以稱為pfam00657. 6)的鑒定。所述共有序列可以通過使用較新版pfam數據庫來升級(如參見W02004/064537或 W02004/064987)。在一個實施方案中，用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列編碼可以使用以下標準進行表征的脂酰基轉移酶(i)所述酶具有可以被稱為酯轉移活性的酰基轉移酶活性，通過此活性將脂酰基供體的原初酯鍵的酰基部分轉移到酰基受體(優選為甘油或膽固醇)以形成新的酯，優選分別為甘油單酯或膽固醇酯；(ii)所述酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是以下氨基酸殘基中的一種或多種丄、八、￥、1、卩、丫、!1、0、1\1]\1或3;(iii)所述酶包含 His-309 或在圖 2 和 4 中(SEQ ID No. 1 或 SEQ ID No. 3)所示的嗜水氣單胞菌脂酰基轉移酶中His-309的對應位置上包含組氨酸殘基。優選地，所述⑶SX基序的氨基酸殘基為L。在SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1中，起始的18個氨基酸殘基形成信號序列。全長序列(即包含信號序列的蛋白)中的His-309等同于蛋白的成熟部分(即不含信號序列的序列)中的His491。在一個實施方案中，用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列所編碼的脂酰基轉移酶包含以下催化三聯體Ser-34、Asp-306和His-309，或在圖4 (SEQ ID No. 3)或圖2(SEQ ID No. 1)中所示的嗜水氣單胞菌脂酰基轉移酶中kr-34、Asp-306和His-309的對應位置上分別包含絲氨酸殘基、天冬氨酸殘基和組氨酸殘基。如上所述，在SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1所示的序列中，起始的18個氨基酸殘基形成信號序列。全長序列(即包含信號序列的蛋白)中的kr-34、Asp-306和His-309等同于蛋白的成熟部分(即不含信號序列的序列)中的Ser-16、Asp-288和HiSj91。在圖3 (SEQ ID No. 2)所示的pfam00657共有序列中，活性位點殘基為Ser_7、Asp-345和His-348。在一個實施方案中，用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列編碼可以使用以下標準進行表征的脂酰基轉移酶所述酶具有可以被稱為酯轉移活性的酰基轉移酶活性，通過此活性將第一脂酰基供體的原初酯鍵的酰基部分轉移到酰基受體以形成新的酯；和所述酶至少包含Gly-32、Asp-33、kr-34、Asp-134 和 His-309，或在 SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1所示的嗜水氣單胞菌脂酰基轉移酶中Gly-32、Asp-33、kr-34、Asp-306和His-309的對應位置上分別包含甘氨酸殘基、天冬氨酸殘基、絲氨酸殘基、天冬氨酸殘基和組氨酸殘基。適合地，用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列可以是以下核苷酸序列中的一種
0129](a)SEQIDNo.36所示的核苷酉堯序列參見圖29)、0130](b) SEQIDNo.38所示的核苷酉堯序列參見圖31)、0131](c) SEQIDNo.39所示的核苷酉堯序列參見圖32)、0132](d) SEQIDNo.42所示的核苷酉堯序列參見圖35)、0133](e) SEQIDNo.44所示的核苷酉堯序列參見圖37)、0134](f) SEQIDNo.46所示的核苷酉堯序列參見圖39)、0135](g) SEQIDNo.48所示的核苷酉堯序列參見圖41)、0136](h)SEQIDNo.49所示的核苷酉堯序列參見圖57)、0137](i)SEQIDNo.50所示的核苷酉堯序列參見圖58)、0138](j)SEQIDNo.51所示的核苷酉堯序列參見圖59)、0139](k)SEQIDNo.52所示的核苷酉堯序列參見圖60)、0140](I)SEQIDNo.53所示的核苷酉堯序列參見圖61)、0141](m) SEQIDNo.討所示的核苷酉堯序列參見圖62)、0142](η)SEQIDNo.陽所示的核苷酉堯序列參見圖6；3)、0143](ο)SEQIDNo.56所示的核苷酉堯序列參見圖64)、0144](P) SEQIDNo.57所示的核苷酉堯序列參見圖65)、0145](q) SEQIDNo.58所示的核苷酉堯序列參見圖66)、0146](r)SEQIDNo.59所示的核苷酉堯序列參見圖67)、
(s) SEQ ID No. 60所示的核苷酸序列(參見圖68)、(t) SEQ ID No. 61所示的核苷酸序列(參見圖69)、(u) SEQ ID No. 62所示的核苷酸序列(參見圖70)、(V)SEQ ID No. 63所示的核苷酸序列(參見圖71)或(w)與 SEQ ID No. 36、SEQ ID No. 38、SEQ ID No. 39、SEQ ID No. 42、SEQ ID No. 44、SEQ ID No. 46,SEQ ID No. 48、SEQ ID No. 49、SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 5USEQ ID No. 52、SEQ ID No. 53,SEQ ID No. 54、SEQ ID No. 55、SEQ ID No. 56、SEQ ID No. 57、SEQ ID No. 58、SEQ ID No. 59、SEQ ID No. 60、SEQ ID No. 61、SEQ ID No. 62 或 SEQ ID No. 63 中所示的任一序列具有70%或更高，優選為75%或更高同一性的核苷酸序列。適合地，所述核苷酸序列可以與SEQ ID No. 36、SEQ ID No. 38、SEQ ID No. 39、SEQID No. 42,SEQ ID No. 44,SEQ ID No. 46,SEQ ID No. 48,SEQ ID No. 49,SEQ ID No. 50,SEQID No. 5USEQ ID No. 52,SEQ ID No. 53,SEQ ID No. 54,SEQ ID No. 55,SEQ ID No. 56,SEQID No. 57、SEQ ID No. 58、SEQ ID No. 59、SEQ ID No. 60、SEQ ID No. 61、SEQ ID No. 62 或SEQ ID No. 63中所示的任一序列具有80%或更高，優選為85%或更高，更優選為90%或更高，且更優選為95%或更高同一性。在一個實施方案中，用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列為與SEQ ID No. 49、SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 51、SEQ IDNo. 62和SEQ ID No. 63中所示的任一序列具有70%或更高，優選為75%或更高同一性的核苷酸序列。適合地，所述核苷酸序列可以與SEQ ID No. 49、SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 51、SEQ ID No. 62和SEQ ID No. 63中所示的任一序列具有80%或更高，優選為85%或更高，更優選為90 %或更高，且更優選為95 %或更高同一性。在一個實施方案中，用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列為與SEQ ID No. 49中所示的序列具有70%或更高，75%或更高，80%或更高，優選為85%或更高，更優選為90%或更高，且更優選為95%或更高同一性的核苷酸序列。適合地，用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列可以編碼包含一種或多種以下氨基酸序列的脂酰基轉移酶(i)SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列、(ii)SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列、(iii)SEQ ID No. 5所示的氨基酸序列、(iv) SEQ ID No. 6所示的氨基酸序列、(v) SEQ ID No. 7所示的氨基酸序列、(vi)SEQ ID No. 8所示的氨基酸序列、(vii)SEQ ID No. 9所示的氨基酸序列、(viii)SEQ ID No. 10所示的氨基酸序列、(ix) SEQ ID No. 11所示的氨基酸序列、(X)SEQ ID No. 12所示的氨基酸序列、(xi)SEQ ID No. 13所示的氨基酸序列、(xii)SEQ ID No. 14所示的氨基酸序列、
(xiii)SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列、(xiv)SEQ ID No. 15所示的氨基酸序列或與SEQ ID No. USEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ IDNo. 7、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 12、SEQ IDNo. 13,SEQ ID No. 14或SEQ ID No. 15 中所示的任一序列具有75%、80%、85%、90%、95%、
98%或更高同一性的氨基酸序列。適合地，用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列所編碼的脂酰基轉移酶可以包含如SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 4或SEQ IDNo. 1或SEQ ID No. 15所示的氨基酸序列，或包含與SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列或SEQID No. 4所示的氨基酸序列或SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列或SEQ ID No. 15所示的氨基酸序列具有75%或更高、優選為80%或更高、優選為85%或更高、優選為90%或更高、優選為95%或更高的同一性的氨基酸序列。適合地，用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列所編碼的脂酰基轉移酶可以包含與SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ IDNo. 5,SEQ ID No. 6,SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 10,SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 12,SEQ ID No. 13,SEQ ID No. 14,SEQ ID No. 1 或 SEQ ID No. 15 中所示的任一序列具有80%或更高、優選為85%或更高、更優選為90%或更高、且更優選為95%或更高的同一性的氨基酸序列。適合地，用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列可以編碼包含一種或多種以下氨基酸序列的脂酰基轉移酶(a) SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1的氨基酸殘基1-100所示的氨基酸序列；(b)SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1的氨基酸殘基101-200所示的氨基酸序列；(C)SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1的氨基酸殘基201-300所示的氨基酸序列；或(d)與以上(a)至(c)中所定義的氨基酸序列中任一序列具有75%或更高、優選為85%或更高、更優選為90%或更高、且更優選為95%或更高的同一性的氨基酸序列。適合地，用于本發明方法和/或應用中的脂酰基轉移酶可以包含一種或多種以下氨基酸序列(a) SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1的氨基酸殘基觀_39所示的氨基酸序列；(b) SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1的氨基酸殘基77_88所示的氨基酸序列；(c)SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1的氨基酸殘基1沈_136所示的氨基酸序列；(d)SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1的氨基酸殘基163-175所示的氨基酸序列；(e) SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1的氨基酸殘基304-311所示的氨基酸序列；或(f)與以上(a)至(e)中所定義的氨基酸序列中任一序列具有75%或更高、優選為85%或更高、更優選為90%或更高、且更優選為95%或更高的同一性的氨基酸序列。一方面，用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列所編碼的脂酰基轉移酶可以是如EP 1275711中教導的來自于近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis)的脂酰基轉移酶。因此，一方面，用于本發明方法和應用中的脂酰基轉移酶可以為包含SEQ ID No. 17或SEQ ID No. 18所教導的一種氨基酸序列的脂酰基轉移酶。
優選地，用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列所編碼的脂酰基轉移酶可以是包含SEQ ID No. 16所示的氨基酸序列的脂酰基轉移酶，或者是包含與SEQ ID No. 16具有75%或更高、優選為85%或更高、更優選為90%或更高、更優選為95%或更高、更優選為98%或更高、或更優選為99%或更高的同一性的氨基酸序列的脂酰基轉移酶。所述酶可以被認為酶的變體。一方面，用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列所編碼的脂酰基轉移酶可以為卵磷脂膽固醇酰基轉移酶(LCAT)或其變體(如由分子進化產生的變體)。適合的LCAT為本領域已知的，且可以獲得來自一種或多種如下的生物體，如哺乳類、大鼠、小鼠、雞、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)、植物(包括擬南芥(Arabidopsis)和水稻(Oryza sativa))、線蟲、真菌和酵母。在一個實施方案中，用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列所編碼的脂酰基轉移酶可以是可獲得的，優選從帶有PPetl2aAhydr0和pPetl2aA&ilm0的大腸桿菌株TOP 10獲得的脂酰基轉移酶，所述大腸桿菌株 TOP 10 由 Danisco A/S of Langebrogade 1, DK-IOOlCopenhagen K, Denmark根據國際承認用于專利程序的微生物保藏布達佩斯條約保藏在National Collectionof Industrial, Marine and Food Bacteria(NCIMB)23 St. Machar Street, AberdeenScotland，GB，保藏日為2003年12月22日，保藏號分別為NCIMB 41204和NCIMB41205。用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列可以編碼磷脂甘油酰基轉移酶。磷脂甘油酰基轉移酶包括分離自氣單孢菌，優選為嗜水氣單胞菌或殺鮭氣單胞菌，最優選為殺鮭氣單胞菌或其變體的那些磷脂甘油酰基轉移酶。用于本發明的最優選的脂酰基轉移酶可以由SEQ ID No. 1、3、4、15和16所編碼。本領域技術人員可以理解，優選酰基轉移酶的信號肽已經在轉移酶的表達過程中被切割。SEQID No. 1、3、4、15和16的信號肽為氨基酸1-18。因此，最優選的區域為SEQ ID No. 1和SEQID No. 3 (嗜水氣單胞菌)中的氨基酸 19-3；35，和 SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 15 和 SEQ IDNo. 16(殺鮭氣單胞菌)中的氨基酸19-336。當用于測定氨基酸序列的同一性或同源性時，優選使用成熟序列進行本文所述的比對。因此，用于測定同源性(同一性)的最優選的區域為SEQ ID No.l和3(嗜水氣單胞菌)中的氨基酸19-335 JPSEQ ID No. 4、15和16 (殺鮭氣單胞菌)中的氨基酸19-336。SEQ ID 34和35分別是來自嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌的脂酰基轉移酶的成熟蛋白序列。用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列所編碼的脂酰基轉移酶也可以分離自喜熱裂孢菌(Thermobifida)，優選為褐色喜熱裂孢菌(T. fusca)，最優選其由SEQ ID No. 28編碼。用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列所編碼的核苷酸序列也可以分離自鏈霉菌屬，優選為阿維鏈霉菌(S. avermitis)，最優選其由SEQ ID No. 32編碼。用于本發明的來自鏈霉菌的其它可能的酶包括由SEQ IDNo. 5、6、9、10、11、12、13、14、31 和 33 所編碼的那些酶。用于本發明的酶也可以分離自棒狀桿菌屬(Corynebacterium)，優選為C. efficiens，最優選其由SEQ ID No.四編碼。適合地，用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列所編碼的脂酰基轉移酶可以包含SEQ ID No. 37、38、40、41、43、45或47所示的任一氨基酸序列，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID No. 36、39、42、44、46或48所示的任一核苷酸序列所編碼，或由與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的核苷酸序列所編碼。在一個實施方案中，用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列選自由以下組成的組a)包含SEQ ID No. 36所示的核苷酸序列的核酸；b)由于遺傳密碼簡并性而與SEQ ID No. 36的核苷酸序列相關的核酸；和c)包含與SEQ ID No. 36所示的核苷酸序列具有至少70%同一性的核苷酸序列的核酸。在一個實施方案中，用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列所編碼的脂酰基轉移酶包含SEQ ID No. 37所示的氨基酸序列或與其具有至少60%同一性的氨基酸序列。在另一實施方案中，用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列所編碼的脂酰基轉移酶可以包含SEQ ID No.37、38、40、41、43、45或47所示的任一氨基酸序列，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID No. 39、42、44、46或48所示的任一核苷酸序列所編碼，或由與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的核苷酸序列所編碼。在另一實施方案中，用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列所編碼的脂酰基轉移酶可以包含SEQ ID No.38、40、41、45或47所示的任一氨基酸序列，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列，以用于本發明。在另一實施方案中，用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列所編碼的脂酰基轉移酶可以包含SEQ ID No.38、40或47所示的任一氨基酸序列，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列，以用于本發明。更優選地，在一個實施方案中，用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列所編碼的脂酰基轉移酶可以包含SEQ ID No. 47所示的氨基酸序列，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同
一性的氨基酸序列。在另一實施方案中，用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列所編碼的脂酰基轉移酶可以包含SEQ ID No. 43或44所示的氨基酸序列，或與其具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列。在另一實施方案中，用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列所編碼的脂酰基轉移酶可以包含SEQ ID No. 41所示的氨基酸序列，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列。在一個實施方案中，用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列選自由以下組成的組a)包含SEQ ID No. 36所示的核苷酸序列的核酸；b)由于遺傳密碼簡并性而與SEQ ID No. 36的核苷酸序列相關的核酸；和c)包含與SEQ ID No. 36所示的核苷酸序列具有至少70%同一性的核苷酸序列的核酸。在一個實施方案中，根據本發明的脂酰基轉移酶可以是可獲得的，優選從鏈霉菌屬株L130或L131獲得的脂酰基轉移酶，所述鏈霉菌屬株L130或L131由Danisco A/S of Langebrogade 1，DK-IOOlCopenhagen K，Denmark 根據國際承認用于專利程序的微生物保藏布達佩斯條約保藏在 National Collection of Industrial, Marine and FoodBacteria (NCIMB) 23St. Machar Street, Aberdeen Scotland, GB，保藏日為 2004 年 6 月 25日，保藏號分別為NCIMB 412 和NCMB 41227。用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的適合的核苷酸序列可以編碼脂酰基轉移酶(SEQ ID No. 16)，或可以編碼脂酰基轉移酶的氨基酸序列(SEQ ID No. 17)。用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的適合核苷酸序列可編碼如下所述的氨基酸序列，該氨基酸序列可使用Align X(使用默認設置的VectorNTI的Clustal W成對比對算法)通過與L131 (SEQ ID No. 37)序列的比對進行鑒定。L131與來自灰色鏈霉菌(S. avermitilis)和褐色喜熱裂孢菌的同源物的比對可以顯示GD&c基序(L131以及灰色鏈霉菌和褐色喜熱裂孢菌中為GDSY)、GANDY框(其為GGNDA或GGNDL)和HPT部分(被認為是保守的催化性組氨酸)的保守性。這三個保守部分突出標記在圖42中。與pfam Pfam00657共有序列(如W004/064987中所述)和/或本文公開的L131序列(SEQ ID No. 37)比對時，可以鑒定出三個保守區，⑶部分、GANDY部分和HTP部分(詳述參見 W004/064987)。與pfam Pfam00657共有序列(如W004/064987中所述)和/或本文公開的L131序列(SEQ ID No. 37)比對時，i)用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列可以編碼具有GD&c基序，更優選為選自GDSL或GDSY基序的GD&c基序的脂酰基轉移酶；和/或ii)用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列可以編碼具有GANDY部分，更優選為包含氨基GGNDx的GANDY部分，更優選為GGNDA或GGNDL的脂酰基轉移酶；和/或iii)用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列可以編碼優選具有HTP部分的脂酰基轉移酶；和優選地，
iv)用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列可以編碼優選具有GD&c或GDSY基序，和包含氨基GGNDx (優選為GGNDA或GGNDL)的GANDY部分，和HTP部分(保守的組氨酸)的脂酰基轉移酶。脂酰基轉移酶變體在優選的實施方案中，用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列所編碼的脂酰基轉移酶為脂酰基轉移酶變體。可以使用對磷脂的活性增加的變體，如對磷脂的水解活性增加和/或轉移酶活性增加的變體，優選為對磷脂的轉移酶活性增加的變體。優選地，通過如上定義的脂酰基轉移酶的一個或多個氨基酸修飾來制備所述脂酰基轉移酶變體。適合地，當用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列所編碼的脂酰基轉移酶為脂酰基轉移酶變體時，在此情況中，所述酶的特征為所述酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是下列氨基酸殘基中的一種或多種L、A、V、I、F、Y、H、Q、Τ、N、M或S，且其中所述酶變體相對于親本序列在第2組、第4組、第6組或第 組限定的一個或多個氨基酸殘基處包含一個或多個氨基酸修飾(如W02005/066347和下文所定義)。例如，脂酰基轉移酶變體可以被表征為所述酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是下列氨基酸殘基中的一種或多種L、A、V、I、F、Y、H、Q、Τ、N、M或S，且其中酶變體相對于親本序列在第2組、第4組、第6組或第7組限定的一個或多個氨基酸殘基處包含一個或多個氨基酸修飾(如W02005/066347和下文所定義)，所述組是通過所述親本序列與本文定義的Ρ10480結構模型在結構上進行比對而鑒定出來的，其優選是通過Ρ10480晶體結構等同物(crystal structure coordinates)與如 W02005/066347 和下文所定義的 1IVN. PDB 和/或1DE0. PDB的結構比對而獲得的。在其它實施方案中，用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列可以編碼脂酰基轉移酶變體，其可以被表征為所述酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是下列氨基酸殘基中的一種或多種L、A、V、I、F、Y、H、Q、Τ、N、M或S，且其中酶變體相對于親本序列在第2組所教導的一個或多個氨基酸殘基處包含一個或多個氨基酸修飾，所述第2組是在將所述親本序列與pfam共有序列(SEQ ID No. 2-圖3)比對時被鑒定出來的，并根據Ρ10480的結構模型進行修飾以確保如W02005/066347和下文所定義的最佳符合交疊(best fit overlap)。適合地，當用于本發明宿主細胞、載體、方法和/或應用中任一項的編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列可以編碼可包含以下氨基酸序列的脂酰基轉移酶變體，其中所述氨基酸序列如 SEQ ID No. 34、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6、SEQ IDNo. 7、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 19、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 12、SEQ IDNo. 13、SEQ ID No. 14、SEQ ID No. USEQ ID No. 15、SEQ ID No. 25、SEQ ID No. 26、SEQ IDNo. 27、SEQ ID No. 28、SEQ ID No. 29、SEQ ID No. 30、SEQ ID No. 32 或 SEQ ID No. 33 所示，并在第2組、第4組、第6組或第7組限定的一個或多個氨基酸殘基處有一個或多個氨基酸修飾(如W02005/066347和下文所定義)，所述組是通過與SEQ ID No. 34的序列比對而鑒定出來的。
或者，編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列可以編碼包含以下氨基酸序列的脂酰基轉移酶變體，其中所述氨基酸序列如SEQ ID No. 34,SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6,SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 19,SEQ ID No. 10,SEQ ID No. IUSEQID No. 12、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 14、SEQ ID No. USEQ ID No. 15、SEQ ID No. 25、SEQID No. 26、SEQ ID No. 27、SEQ ID No. 28、SEQ ID No. 29、SEQ ID No. 30、SEQ ID No. 32 或SEQ ID No. 33所示，并在第2組、第4組、第6組或第7組限定的一個或多個氨基酸殘基處有一個或多個氨基酸修飾(如W02005/066347和下文所定義)，所述組是通過所述親本序列與本文定義的P10480的結構模型在結構上進行比對而鑒定出來的，其優選是通過P10480晶體結構等同物與如W02005/066347和下文所教導的1IVN. PDB和/或1DE0. PDB的結構比對而獲得的。或者，編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列可以編碼包含以下氨基酸序列的脂酰基轉移酶變體，其中所述氨基酸序列如SEQ ID No. 34,SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 19、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 14、SEQ ID No. USEQ ID No. 15、SEQ ID No. 25、SEQ ID No. 26,SEQ ID No. 27,SEQ ID No. 28,SEQ ID No. 29,SEQ ID No. 30,SEQ ID No. 32或SEQ ID No. 33所示，并在第2組所教導的一個或多個氨基酸殘基處有一個或多個氨基酸修飾，所述第2組是在將所述親本序列與pfam共有序列(SEQ ID No. 2)比對時被鑒定出來的，并根據P10480的結構模型進行修飾以確保如W02005/066347和下文所教導的最佳符合交疊。優選地，所述親本酶是包含SEQ ID No. 34和/或SEQ ID No. 15和/或SEQ IDNo. 35所示氨基酸序列或與它們同源的酶。優選地，編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列可以編碼包含以下氨基酸序列的脂酰基轉移酶變體，其中所述氨基酸序列如SEQ ID No. 34或SEQ ID No. 35所示，并在如W02005/066347和下文所定義的第2組、第4組、第6組或第7組限定的一個或多個氨基酸殘基處有一個或多個氨基酸修飾。組的定義第1組氨基酸第1組氨基酸(注意這些是圖53和圖M的IIVN中的氨基酸)Gly8. Asp9. SerlO. LeulU Serl2、Tyrl5、Gly44、Asp45、Thr46、Glu69、Leu70、Gly7U Gly72、Asn73、Asp74、Gly75、Leu76、Glnl06、Ilel07、Argl08、Leul09、ProllO、Tyrll3、Phel21、Phel39、Phel40、Metl41、Tyrl45、Metl51、Aspl54、Hisl57、Glyl55、Ilel56、Pro158從第1組中不包含高度保守的基序，如⑶和催化殘基(標有下劃線的殘基)。為了避免爭議，第1組定義了 IIVN模型活性位點中在甘油的中心碳原子10 A以內的氨基酸殘基。第2組氨基酸第2組氨基酸(注意氨基酸的編號是指P10480成熟序列中的氨基酸)Leu 17、Ly s22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Ly s82、Asn87、Asn88、Trp 111、Val 112、Alall4、Tyrll7、Leull8、Prol56、Glyl59、Glnl60、Asnl61、Prol62、krl63、Alal64、Argl65、Serl66、Glnl67、Lysl68、Vall69、Vall70、Glul71、Alal72、Tyrl79、Hisl80、Asnl81、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289 和 Val290。
第1組和第2組中所選殘基的比較表
權利要求
1.用于制備脂酰基轉移酶的方法，包括以下步驟(i)提供芽孢桿菌(Bacillus)細胞，其中所述芽孢桿菌細胞是除枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)以外的芽孢桿菌細胞；(ii)用SEQID No. 49所示的編碼脂酰基轉移酶的異源核苷酸序列轉化所述芽孢桿菌細胞，其中所述芽孢桿菌細胞是除枯草芽孢桿菌以外的芽孢桿菌細胞；和(iii)在啟動子序列的控制下，在所述細胞中表達脂酰基轉移酶。
2.如權利要求1所述的方法，其中，所述芽孢桿菌細胞是地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)。
3.如權利要求1或2所述的方法，其中，所述啟動子序列與所述編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列不是天然連接。
4.如前述任一項權利要求所述的方法，其中，所述方法還包括分離/回收所述脂酰基轉移酶的步驟。
5.如前述任一項權利要求所述的方法，其中，所述啟動子序列與宿主細胞是同源的。
6.如前述任一項權利要求所述的方法，其中，所述啟動子序列選自以下組成的組: α -淀粉酶啟動子序列、蛋白酶啟動子序列、枯草桿菌蛋白酶啟動子序列、谷氨酸特異性蛋白酶啟動子序列和果聚糖蔗糖酶啟動子序列。
7.可由前述任一項權利要求所述的方法獲得的脂酰基轉移酶。
全文摘要
本發明涉及脂酰基轉移酶的制備方法，步驟包括(i)提供地衣芽孢桿菌細胞；(ii)用編碼脂酰基轉移酶的異源核苷酸序列轉化地衣芽孢桿菌細胞；和(iii)在啟動子序列的控制下在細胞中表達脂酰基轉移酶。此外，本發明還涉及地衣芽孢桿菌在表達脂酰基轉移酶中的應用，包含異源脂酰基轉移酶的地衣芽孢桿菌宿主細胞，和包含編碼脂酰基轉移酶的核苷酸序列的載體，所述核苷酸序列可操作地連接與地衣芽孢桿菌同源的啟動子序列。
文檔編號C12N9/10GK102559627SQ20121003143
公開日2012年7月11日 申請日期2007年1月25日 優先權日2007年1月25日
發明者約恩·達爾高·米克爾森, 里克·赫格·洛倫森, 馬克·科爾克曼 申請人:丹尼斯科有限公司