pEgr-IL18-B7.2雙基因共表達質粒的構建及其在聯合輻射抗腫瘤中的應用
【技術領域】
[00011本發明涉及腫瘤基因治療技術領域，具體涉及一種pEgr-IL18-B7.2雙基因共表達 質粒的構建及聯合輻射抗腫瘤應用。
【背景技術】
[0002]惡性腫瘤在當代是威脅人類健康的主要原因之一。目前，放射治療仍然是臨床治 療腫瘤的主要方法之一。放射治療隨著放射物理學及放射生物學的不斷發展，幾十年來其 療效已經取得到巨大提高。但放療仍然存在其自身的缺點和困難，例如，放療后腫瘤的復發 和轉移，放療對自身正常組織的損傷等，對腫瘤患者的生存造成威脅。惡性腫瘤發生發展機 制十分復雜，是一個多因素、多環節、多階段及多基因的復雜疾病，單一療法療效往往欠佳， 因此腫瘤綜合治療仍然是當今腫瘤防治研究的熱點。近年來隨著分子生物學研究的迅速發 展及"人類基因組計劃"的實施，基因治療越來越受到人們的極大關注。特別是基因療法和 放射治療聯合治療給腫瘤患者重生帶來希望。
[0003]腫瘤的基因-放射治療(gene-radiotherapy)是近年來興起的、有效解決放射治療 和基因治療各自的難點和薄弱環節的綜合治療腫瘤的新方法。基因-放射治療理論的確立 為腫瘤放射治療和基因治療的結合開辟了新途徑。特別是隨著功能基因組學的發展、有效 治療基因的篩查和表達調控的進一步研究，為腫瘤基因放射治療的探索提供了科學的研究 方向。
[0004] 美國哈佛大學和芝加哥大學的研究者最早進行了腫瘤基因治療聯合放射治療的 實驗研究，將治療基因克隆于可被輻射誘導激活的Egr-Ι啟動子下游，通過轉染，將具輻射 誘導表達特性的治療基因轉入瘤體內，在對腫瘤實施局部放療時誘導腫瘤殺傷基因的表 達，形成射線和基因對腫瘤的雙重殺傷作用。一方面可以相對降低有效照射劑量，緩解正常 組織的損傷；另一方面通過射線的局部照射來實現腫瘤殺傷基因的定位表達，對治療基因 的表達進行時空調控。以往的實驗結果表明，下游治療基因的選擇對實現這一治療方案，提 高基因-放射治療效果至關重要。
[0005] 共刺激分子B7是參與T細胞活化的重要粘附分子，表達于大部分抗原遞呈細胞表 面，與T細胞表面的CD28相互作用使IL-2等淋巴因子的mRNA轉錄增強，為激發T細胞免疫反 應提供第二信號，大多數腫瘤細胞不表達B7分子，因而逃避了免疫細胞的監視。IL-18又稱 干擾素γ誘生因子(IGIF)，具有抗感染、抗腫瘤、抗超敏反應等作用。目前IL-18在腫瘤治療 中的意義的研究已成為新的熱點，認為IL-18通過細胞毒作用、參與粘附分子調節、抑制腫 瘤血管生成等多種途徑發揮其抗腫瘤作用。實踐表明，單一一種基因治療作用較弱。
【發明內容】
[0006] (一)解決的技術問題
[0007] 針對現有技術的不足，本發明提供一種pEgr-IL18-B7.2雙基因共表達質粒的構建 及其在聯合輻射抗腫瘤中的應用，本發明構建了雙基因共表達質粒pEgr-IL18-B7.2,通過 雙基因載體，把有抗腫瘤作用的IL18基因及共刺激分子B7-2基因轉染腫瘤細胞，在分子水 平檢測IL18及B7.2表達顯著增高，表現了比單純放療更加顯著的抑瘤效果，還可明顯提高 免疫力，機體抑瘤能力顯著增高。
[0008] (二)技術方案
[0009] 為實現以上目的，本發明通過以下技術方案予以實現：
[0010] 一種pEgr-IL18-B7.2雙基因共表達重組質粒的構建，包括以下步驟：
[0011] S1、取PIRES載體，用Xbal及Smal酶切，另取連接B7-2基因的T載體，用PstI酶切，得 到pIRES載體和B7-2基因片斷，粘端補平，然后把B7-2基因連接到pIRES上，得到第一中間 質粒PIRES-B7-2;
[0012] S2、分別用BamHI和Xbal酶切pIRES-B7-2質粒和KS-IL18質粒，補平粘端，再用 EcoR頂每切，得到pIRES-B7-2和IL18片斷，把IL18基因連接到pIRES-B7-2上，得到第二中間 質粒PIRES-IL18-B7-2;
[0013] S3、用SacI酶切質粒pIRES-IL18-B7-2,補平，電泳回收，得到IL18-B7-2大片斷，用 EcoRV酶切質粒pcDNA3·l-Egr-Ι，去磷，把大片段IL18-B7-2連接到pcDNA3·l-Egr-Ι上，得到 雙基因表達質粒pcDNA3.1-Egr-IL18-B7-2,即可。
[0014] 優選的，所述mIL-18和mB7-2基因分別定向克隆至IRES前后插入位點，從而使mlL-18和mB7-2基因在同一載體上獲得良好相關表達。pEgr-IL18-B7.2雙基因共表達重組質粒 在聯合輻射抗腫瘤中的應用，將所述重組質粒體外轉染B16黑色素瘤細胞，經0.1~6.OGy劑 量的X射線照射后體外激活Egr-Ι啟動子誘導mIL-18和B7-2表達。
[0015]優選的，所述X射線照射劑量為0.5~5.OGy。
[0016] 優選的，所述pEgr-IL18-B7.2雙基因能夠提高機體免疫活性，增強NK和CTL細胞毒 效應，刺激T細胞和腹腔巨噬細胞分泌IFN-γ和TNF-α，腫瘤局部B7-2的表達增強免疫細胞 對腫瘤細胞的識別殺傷能力。
[0017](三)有益效果
[0018]本發明提供了一種pEgr-IL18-B7.2雙基因共表達質粒的構建及其在聯合輻射抗 腫瘤中的應用，本發明以多基因表達載體為基因導入系統，把有抗腫瘤作用的IL18基因及 共刺激分子B7-2基因轉染腫瘤細胞，通過輻射誘導使之表達IL18及B7.2分子，增強腫瘤的 免疫原性，提高機體抗腫瘤的免疫功能;通過基因-放射治療不僅實現了放療、免疫及基因 治療的協同作用，而且達到了對基因表達的時空調控的目的；本發明可為惡性腫瘤患者提 供一個特異、靶向性的多基因聯合治療模式，并為臨床應用奠定理論和實驗基礎。
【附圖說明】
[0019] 圖1為RT-PCR擴增小鼠mB7-2的cDNA，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測得到的930bp 片段圖；
[0020] 圖2為質粒pcDNA3.1-CMV-B7-2的酶切鑒定圖；
[0021]圖3為質粒pcDNA3 · l-Egr-B7-2的鑒定圖；
[0022]圖 4 為質粒pcDNA3.1-Egr-IL18-B7-2 的鑒定圖；
[0023]圖5為不同劑量X射線照射8h后重組質粒轉染的B16細胞表面B7.2蛋白表達變化 圖；
[0024]圖6為不同劑量X射線照射8h后重組質粒轉染的B16細胞上清中IL18表達變化圖；[0025]圖7為5Gy劑量X線照射C57/BLBC小鼠接種B16細胞后長出的黑色素瘤，基因放射治 療抑瘤作用圖；
[0026]圖8為C57/BLBC小鼠接種B16細胞后長出的黑色素瘤，基因放射治療后脾CTL細胞 毒性活性的變化圖；
[0027]圖9為C57/BLBC小鼠接種B16細胞后長出的黑色素瘤，基因放射治療后脾NK細胞毒 性活性的變化。
【具體實施方式】
[0028]為使本發明實施例的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合本發明實施例 及附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本 發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在 沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。
[0029]一、材料與方法[0030] 1、主要試劑及器材
[0031] 1.1試劑
[0039] 3、質粒與菌種
[0040]雙基因共表達質粒pIRESlneo購自BD公司，pMD18-T、pcDNA3.l( + )、pGL3-Egrl-EnhancerVector、pEgr_l由田梅博士惠贈，pBlueminusKS(-)_IL18由金光輝博士惠贈，感 受態大腸桿菌DH5a由本實驗室保存。
[0041] 4、細胞株
[0042] B16:惡性黑色素瘤細胞，由本實驗室保存，體外完全培養基傳代培養。
[0043] YAC-1細胞:小鼠T淋巴瘤，由本實驗室保存，體外完全培養基傳代培養。
[0044] L929細胞:小鼠成纖維細胞，本實驗室保存，體外完全培養基傳代培養。
[0045] 5、實驗動物
[0046] C57BL/6J純系小鼠，一級，雌性，體重18±2g，健康，購自北京大學醫學部實驗動物 部。
[0047] 6、照射條件
[0048]用國產X射線深部治療機進行照射，電壓200kV，電流10mA，濾板為0.5mmCu和 1.〇11111^1^。低劑量照射時靶皮距243.7〇11，劑量率12.51116^1^11-1;高劑量照射時靶皮距 50cm，劑量率0.287Gy·min-1。
[0049] 7、病毒及其處理
[0050]濾泡性口炎病毒(VSV)由衛生部生物制品所傳代保存。
[0051] VSV增殖：待L929細胞長成單層后加入400TCID50/mlVSV病毒液（TCID:tissue cultureinfectiondoses,病毒攻擊細胞發生50%病變的病毒稀釋液的倒數），設無病毒 對照組，待對照瓶中L929細胞生長良好，而病毒瓶中L929細胞幾乎全部發生病變時（36~ 48h)，將病變細胞置-20°C過夜，次日將其融解，用吸管猛烈吹打，離心3000rpm，20min，取上 清，測定TCID50后于-20°C貯存備用。
[0052] 8、分子生物學實驗方法
[0053] 8.1引物設計及合成
[0054] 根據小鼠B7-2的cDNA序列設計PCR引物（由TaKaRa公司合成）。
[0055] B7-2:有義鏈引物:5 ' -AACTTACGGAAGCACCCACG-3 '
[0056] 反義鏈引物：5 ' -CTCTCACTGCCTTCACTCTGC-3 '
[0057] 8.2脾細胞總RNA的提取及質量鑒定
[0058]取健康6周齡的昆明小鼠脾臟，于RPMI1640培養液(無FBS)中用毛玻璃研磨洗2次， 取2X106脾細胞，用RNA提取試劑盒說明書提取小鼠脾細胞總RNA。紫外分光光度計測定RNA 純度及含量，A260與A280比值在1.8~2.0之間，基本無蛋白質污染。RNA經甲醛變性瓊脂糖 凝膠電泳后，28S與18S區帶清晰集中，28S與18S比值大于2，則表明RNA樣品未降解。
[0059] 8.3RT-PCR法釣取B7-2全長序列
[0060] 參照TaKaRaone-stepRNAPCRkit試劑盒說明書，以2yg總RNA為模板進行RT-PCR，循環參數為：50°(315