專利名稱：一種還原酶及其基因、重組酶及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種還原酶及其基因，以及含有該基因的重組表達載體和重組表達轉化體，以及其重組酶和該重組酶的制備方法，以及該還原酶或其重組酶作為催化劑在不對稱還原前手性羰基化合物以制備光學活性手性醇中的應用。
背景技術：
含有特定功能基團的光學活性手性醇是合成醫藥、農藥及其它精細化學品的重要手性砌塊。研究人員已開發出多種光學活性手性醇合成的方法，包括動力學拆分和不對稱合成。其中，利用前手性羰基化合物的不對稱還原合成光學活性手性醇的途徑，可實現理論 100%的產率，是生產光學活性手性醇的重要方法。化學家們已經發現手性金屬化合物可作為催化劑用于羰基的不對稱還原，盡管該化學方法已被用于工業生產，然而該方法操作難度大，反應條件苛刻，且產物中可能會殘留重金屬，因此其應用受到限制。生物催化方法不僅反應條件溫和、對環境友好，具有高度的區域選擇性和立體選擇性，而且避免了產物中重金屬殘留，恰好彌補了化學方法的不足之處，因此近幾年來生物催化的羰基不對稱還原反應在手性醇不對稱合成中的應用越來越受到重視。氧化還原酶是催化生物氧化/還原反應的一大類酶，被廣泛應用于不對稱合成光學活性手性藥物和功能性類固醇等化合物，因此開發具有實際應用價值的氧化還原酶一直是生物技術領域的一項重要內容。醛酮還原酶(AKR)和短鏈醇脫氫酶(SDR)是羰基還原酶家族的兩大重要超家族。其中AKR超家族可分成15個家族，包含約150個成員。相比而言，SDR超家族成員數目較為龐大，目前已有46000多個成員。醛酮還原酶多為NADPH依賴型，通常為單亞基結構，亞基大小一般在35 40kDa左右；而短鏈醇脫氫酶多數由雙亞基或四個亞基組成，亞基大小一般在27kDa左右。還原酶來源十分廣泛，在微生物中普遍存在。例如，面包酵母全基因組中包含49個編碼還原酶的開放讀碼框，其中18個還原酶的基因已被克隆表達并用于酮酯的不對稱還原(J. Am. Chem. S°C ·，2004，126 :12827-12832)。另外，從許多其它微生物中也分離得到了具有立體選擇性的還原酶，有些被進一步克隆表達， 并應用于生物催化領域。例如，Kita等(J. Mol. Catal. B =Enzym.，1999，6 :305-313)從擲孢酵母(Sporobolomyces salmonicolor) AKU4429中分離得到三種可催化4-氯乙酰乙酸乙酯不對稱還原的還原酶；Itoh 等(Appl. Microbiol. Biotehnol.，2004，66 :53-62)對青霉菌 (Penicillium citrinum) IF04631中的一種β -酮酯還原酶(AKR3E1)進行了異源表達，并應用于(S)-4-溴-3-羥基丁酸甲酯的生產中。然而目前應用于工業的還原酶類催化劑所占的比率尚不足總量的14%。如何針對特定的底物找到具有高催化活性和選擇性的生物催化劑是該領域至關重要的問題。將生物信息學和基因重組技術相結合，快速高效地開發性能優異的新型生物催化劑，是發展生物不對稱還原技術的有效途徑。Yamamoto等(Appl. Microbiol. Biotechnol.，2003，61 133-139)利用該手段克隆了來自枯草芽孢桿菌中的重組還原酶FabG以及其他多種微生物中的FabG結構類似酶，用以催化4-氯乙酰乙酸乙酯的不對稱還原。另外，其它一些來自枯草芽孢桿菌的還原酶的結構和性質也已有研究報道。如枯草芽孢桿菌還原酶^bE對多種醛類化合物有還原活性(Protein Science, 2009,18 :1792-1800)；還原對聯苯甲酰有還原活性(J. Biotechnol. ,2002,96 :157-169)。但這三種來自枯草芽孢桿菌的還原酶是否可以用于催化其他羰基化合物的不對稱還原，迄今尚無文獻報道。目前已知芽孢桿菌(Bacillus sp. )ECUOO13，即CGMCC No. 2M9可催化多種芳基酮不對稱還原生成光學活性手性仲醇(Bioresour. Technol.，2010，101 =1054-1059 ；發明專利CN101372677B)。但是以該野生菌株整細胞作為催化劑時，由于酶產量很低，導致總體催化活性不高，從而限制了生物催化劑的優勢發揮。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對以野生芽孢桿菌(Baci 1 Ius sp. ) CGMCC No. 2549整細胞作為芳基酮不對稱還原催化劑時酶產量較低使總體催化活性不高，不對稱還原底物譜較窄的缺陷，而提供一種具有優異的不對稱催化活性、底物適用性廣、對環境友好的還原酶及其基因，以及含有該基因的重組表達載體和重組表達轉化體，以及其重組酶和該重組酶的制備方法，以及該還原酶或其重組酶的應用。本發明通過下述技術方案以解決上述技術問題本發明的還原酶的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4或SEQ ID No. 6所示。本發明以來源于芽孢桿菌(Bacillus sp. )ECU0013的輔酶依賴類型為NADPH型的該還原酶為例進行說明。本發明中，所述的芽孢桿菌(Bacillus sp.) E⑶0013現保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號為CGMCC No. 25490該菌株從土壤中篩選得到， 在發明專利(CN101372677B)中有詳細說明。本發明還涉及一種還原酶基因，其為(1)其堿基序列如序列表中SEQ ID No. USEQ ID No. 3 或 SEQ ID No. 5 所示；或(2)其編碼由序列表中 SEQ ID No. 2,SEQ ID No. 4 或 SEQ ID No. 6所示的氨基酸序列組成的蛋白質。本發明的還原酶基因可來源于芽孢桿菌(Bacillus sp. )CGMCC No. 2M9，具體制備方法可為根據Genbank中收錄的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)168的還原 _^bE、FabG和YueD的基因序列設計合成引物，然后以芽孢桿菌(Bacillus sp.) CGMCC No. 2549的基因組DNA為模板，利用聚合酶鏈式反應(PCR)進行基因擴增，獲得三條完整的還原酶全長基因序列，分別為堿基序列如序列表中SEQ ID No. 1所示的基因，命名為BCR I，全長84;3bp。其中， 其編碼序列(CDQ從第1個堿基起至第840個堿基止，起始密碼子為ATG，終止密碼子為 TAA。該序列無內含子，其編碼的蛋白質的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示。堿基序列如序列表中SEQ ID No. 3所示的基因，命名為BCR II，全長741bp。其中，其編碼序列(CDQ從第1個堿基起至第738個堿基止，起始密碼子為ATG，終止密碼子為 TAA。該序列無內含子，其編碼的蛋白質的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 4所示。堿基序列如序列表中SEQ ID No. 5所示的基因，命名為BCR III，全長732bp。其中，其編碼序列(CDQ從第1個堿基起至第7 個堿基止，起始密碼子為ATG，終止密碼子為 TAG。該序列無內含子，其編碼的蛋白質的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 6所示。如本領域技術人員所知，本發明的還原酶基因的堿基序列也可以是編碼由序列表中SEQ ID No. 2,SEQ ID No. 4或SEQ ID No. 6所示的氨基酸序列組成的蛋白質的其他任何堿基序列。本發明另涉及包含本發明的還原酶基因的核苷酸序列的重組表達載體。其可通過本領域常規方法將本發明的還原酶基因的核苷酸序列連接于各種載體上構建而成。所述的載體可為本領域常規的各種載體，如市售的質粒、粘粒、噬菌體或病毒載體等，優選pET28a。 較佳的，可通過下述方法制得本發明的重組表達載體將通過PCR擴增所得的還原酶基因產物與載體PMD-18T連接，形成克隆載體pBCRI-18T、pBCRII-18T或pBCRIII-18T，之后將克隆載體和表達載體pET28a用限制性內切酶BamHI和BioI雙酶切，形成互補的粘性末端，再經T4DNA連接酶連接，形成含有本發明的還原酶基因的重組表達質粒pET-BCRI、pET-BCRII 或pET-BCRIII。本發明進一步涉及包含本發明的還原酶基因或其重組表達載體的重組表達轉化體。其可通過將本發明的重組表達載體轉化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物可為本領域常規的各種宿主微生物，只要能滿足重組表達載體可穩定的自行復制，且所攜帶的本發明的還原酶基因可被有效表達即可。本發明優選大腸桿菌，更優選大腸埃希氏菌 (E. coli)BL21(DE3)或大腸埃希氏菌(E. coli)DH5 α。將前述重組表達質粒pET-BCRI、 pET-BCRII或pET-BCRIII轉化至大腸埃希氏菌(E. coli)BL21 (DE3)中，即可得本發明優選的基因工程菌株，即大腸埃希氏菌(E. coli)BL21(DE3)/pET-BCRI、大腸埃希氏菌(E. coli) BL21(DE3)/pET-BCRII 或大腸埃希氏菌(E. co 1 i)BL21 (DE3)/pET-BCRI11 本發明還進一步涉及一種重組還原酶的制備方法，其包括如下步驟培養本發明的重組表達轉化體，獲得重組還原酶。其中，所述的重組表達轉化體同前述介紹，可通過將本發明的重組表達載體轉化至宿主微生物得到。其中，所述的培養重組表達轉化體中所用的培養基可本領域任何可使轉化體生長并產生本發明的還原酶的培養基，對于菌株，優選LB培養基蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L， NaCl 10g/L，pH 7. O。培養方法和培養條件沒有特殊的限制，可以根據宿主類型和培養方法等因素的不同按本領域普通知識進行適當的選擇，只要使轉化體能夠生長并產生還原酶即可。其他培養轉化體具體操作均可按本領域常規操作進行。對于菌株，優選下述方法將表達本發明的還原酶基因的重組大腸桿菌(優選本發明的大腸埃希氏菌(E. coli)BL21(DE3) 重組表達轉化體)接種至含氨芐青霉素的LB培養基中培養，當培養液的光密度OD6tltl達到 0. 5-0. 7 (優選0. 6)時，在終濃度為0. 1-lmmol/L (優選0. 5mmol/L)的異丙基- β _D_硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的誘導下，即可高效表達本發明的重組還原酶。本發明再進一步涉及一種重組還原酶，其為(1)按上述方法制得的重組還原酶； 或(2)氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2,SEQ ID No. 4或SEQ ID No. 6所示的重組還原酶。本發明的重組還原酶的輔酶依賴類型為NADPH型。本發明更進一步涉及本發明的還原酶或其重組酶作為催化劑在不對稱還原前手性羰基化合物以制備光學活性手性醇中的應用。較佳的，所述的應用按下述方法進行在pH 6-8的磷酸鹽緩沖液中，在葡萄糖脫氫酶、葡萄糖和NADP+的存在下，在本發明的還原酶或重組還原酶的作用下，將前手性羰基化合物進行不對稱還原反應，制得光學活性手性醇。上述應用中，所述的不對稱還原反應的各條件可按本領域此類反應的常規條件進行選擇，優選如下所述的前手性羰基化合物較佳的為芳基酮類化合物或酮酯類化合物。所述的芳基酮中的芳基較佳的為苯基或芳雜基，如含有1 2個選自N、S和0的雜原子的五元或六元芳雜基，優選吡啶基。本發明優選如式1、2、3或4所示的前手性羰基化合物
權利要求
1.一種還原酶，其特征在于其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 6所示。
2.如權利要求1所述的還原酶，其特征在于其來源于芽孢桿菌(Bacillussp.)CGMCC No. 2M9。
3.—種還原酶基因，其特征在于其為(1)其堿基序列如序列表中SEQ ID No. 5所示； 或(2)其編碼由序列表中SEQ ID No. 6所示的氨基酸序列組成的蛋白質。
4.一種重組表達載體，其特征在于其包含如權利要求3所述的還原酶基因的核苷酸序列。
5.如權利要求4所述的重組表達載體，其特征在于所述的重組表達載體的骨架為 pET28a。
6.一種重組表達轉化體，其特征在于其包含如權利要求3所述的還原酶基因或如權利要求4或5所述的重組表達載體。
7.如權利要求6所述的重組表達轉化體，其特征在于其為將如權利要求5所述的重組表達載體轉化至宿主微生物中制得的基因工程菌株；所述的宿主微生物為大腸桿菌，較佳的為大腸埃希氏菌(E. coli)BL21(DE3)。
8.—種重組還原酶的制備方法，其特征在于其包括如下步驟培養如權利要求6或7 所述的重組表達轉化體，獲得重組還原酶。
9.如權利要求8所述的制備方法，其特征在于其包括如下步驟將如權利要求7所述的重組表達轉化體接種至含氨芐青霉素的LB培養基中培養，當培養液的光密度OD6tltl達到 0. 5-0. 7，優選0. 6時，在終濃度為0. 1-lmmol/L,優選0. 5mmol/L的異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷的誘導下，即可得重組還原酶；所述的LB培養基包括蛋白胨10g/L，酵母膏5g/ L 禾口 NaCl 10g/L, pH 為 7. 0。
10.如權利要求1或2所述的還原酶作為催化劑在不對稱還原前手性羰基化合物以制備光學活性手性醇中的應用。
11.如權利要求10所述的應用，其特征在于所述的應用按下述方法進行在PH6-8 的磷酸鹽緩沖液中，在葡萄糖脫氫酶、葡萄糖和NADP+的存在下，在如權利要求1或2所述的還原酶的作用下，將前手性羰基化合物進行不對稱還原反應，制得光學活性手性醇。
12.如權利要求10或11所述的應用，其特征在于所述的前手性羰基化合物為芳基酮類化合物或酮酯類化合物；所述的芳基酮中的芳基較佳的為苯基或芳雜基，所述的芳雜基較佳的為含有1 2個選自N、S和0的雜原子的五元或六元芳雜基，更佳的為吡啶基；所述的前手性羰基化合物最優選如式1、2、3或4所示的前手性羰基化合物式1 式2 式3 式4其中，R1為-H、-Cl或-Br，R1取代的位置為苯基的對位； R2 為-CH3> -CH2CU-CH2Br 或-CF3 ； R3為2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基； R4 為-CH3> -CH2CU-CH2Br 或-CF3 ；R5 為 _CH3、O-Cl-C6H5-或 _(CH2)2C6H5。
13.如權利要求12所述的應用，其特征在于所述的前手性羰基化合物在反應液中的濃度為ι 15mmol/L ；所述的還原酶或重組還原酶的用量為1 10U/L ；葡萄糖脫氫酶的用量為10 100U/L ；所述的葡萄糖的用量為5 50g/L ；所述的NADP+的用量為0. 5 1. Ommol/L ；所述的磷酸鹽緩沖液的濃度為0. 05 0. lmol/L ；所述的不對稱還原反應的溫度為20 35°C ；所述的不對稱還原反應的時間以反應完全為準。
全文摘要
本發明公開了一類還原酶及其基因，以及含有該基因的重組表達載體和重組表達轉化體，以及其重組酶和該重組酶的制備方法，以及該還原酶或其重組酶作為催化劑在不對稱還原前手性羰基化合物以制備光學活性手性醇中的應用。本發明的還原酶或其重組酶可來源于芽孢桿菌(Bacillus sp.)CGMCC No.2549，可作為催化劑應用于不對稱還原前手性羰基化合物以制備多種光學活性手性醇，其催化效率高、立體選擇性強，且適用的反應條件溫和、對環境友好。與野生型芽孢桿菌(Bacillus sp.)CGMCC No.2549的整細胞相比，本發明的還原酶催化效果更佳，底物適用性更廣，具有很好的工業應用開發前景。
文檔編號C12R1/19GK102559623SQ20121005084
公開日2012年7月11日 申請日期2010年10月29日 優先權日2010年10月29日
發明者倪燕, 張 杰, 李春秀, 潘江, 王麗娟, 許建和 申請人:華東理工大學