專利名稱：一種固態發酵生產漆酶的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其是涉及一種固態發酵法生產工業用酶的制備方法。
背景技術：
白腐真菌是一類使木材呈白色腐朽的真菌，能夠分泌胞外氧化酶降解木質素，且降解木質素的能力優于降解纖維素的能力，這些酶可以促使木質腐爛成為淡色的海綿狀團 ±夬——白腐，故稱為白腐真菌。分類學上，白腐真菌屬于真菌門，絕大多數為擔子菌綱，少數為手囊菌綱。目前研究最多的有黃孢厚毛平革菌、彩絨草蓋菌、變色栓菌、射脈菌、鳳尾菇、 朱紅密孔菌等。漆酶是一種多酚氧化酶，可以結合多個銅離子，能催化多酚類、芳胺類、羧酸類、生物色素等的氧化，也具有降解木質素的功能。漆酶可存活于空氣中，發生反應后唯一的產物就是水，因此本質上是一種環保型酵素。漆酶獨特的催化特性使其在生物檢測中有廣泛的應用，作為高效的生物檢測器而成為底物、輔酶、抑制劑等成分分析的有效工具和手段。由于這幾年環保意識逐漸被人所重視，因此近年來漆酶也成為眾多學者的研究對象。工業上生產漆酶的方法主要是液態發酵。而液態發酵存在能耗大、工藝操作較復雜等特定，且生產規模較大，污染較重，成本較高。與液態發酵相比，固態發酵的主要優點為節能節水、后處理簡單、發酵產酶活力較高、能耗低、環境危害小等。固態發酵生產漆酶越來越受到人們的重視。基質的組成，含水量以及濕度、通氣量和培養基組成是影響固態發酵生產漆酶的主要影響因素。目前固態發酵產漆酶存在周期長的缺點。例如，付時雨研究了貝殼狀革耳菌 (Panus conchatus)在固態及液體培養過程中胞外漆酶及同工酶的產生規律及其差異，結果表明固態培養基產漆酶的最高峰在培養17天以后，固態和液體培養過程所產的漆酶同工酶差異比較大，固態培養下產生的漆酶活性遠大于液體培養產生的漆酶活性，在固態培養條件下，Rigidoporus Iignosus的漆酶產量也較液體培養大大提高；Gose等以栗子殼和麩皮為主要原料，其產漆酶高峰出現在發酵的12天Juan等使用木糖渣為主要原料，并用乙醇蒸氣誘導固態發酵產漆酶，漆酶酶活力最大值出現在14天；孫芹英等人采用平板顯色法從三株白腐真菌篩選出一株靈芝屬漆酶高產菌，以農作物秸稈等為培養基進行固態發酵，該菌主要產漆酶和少量木質素過氧化物酶，在優化條件下，該菌發酵18天可達到產酶高峰。
發明內容
針對現有技術存在的上述問題，本申請人提供了一種固態發酵生產漆酶的方法。 本發明使用的固態培養基由農作物秸稈、豆粕和水組成，發酵結束后加提取液浸提，經沉淀、超濾濃縮和凍干或噴霧得到粉狀漆酶，操作簡單，成本低廉。本發明的技術方案如下一種固態發酵生產漆酶的方法，具體步驟如下
(1)種子液制備將白腐真菌菌株接種在經滅菌處理的種子液培養基中，2(T35°C搖床培養2、天即為種子液，所述種子液培養基的組分及質量份數為酵母膏廣5份，葡萄糖 5 20份，蛋白胨2 10份；
(2)發酵產酶將步驟(1)得到的種子液以體積分數2 15%接種量接入固態培養基中， 于2(T35°C條件下發酵6 15天，所述固態培養基的組分及質量份數秸稈廣4份，豆粕廣3 份，水1 7份；
(3)漆酶制劑制備向步驟(2)得到的發酵完畢的培養物中加入質量為該培養物全部質量的廣5倍的蒸餾水，2(T40°C浸提2、小時，過濾；將濾液超濾濃縮5 20倍后干燥，即得漆酶制劑。所述秸稈可以為玄子小麥秸稈、水稻秸稈的一種或者兩種混合，將其粉碎至平均長度為3cm以下使用。本發明有益的技術效果在于
本發明操作簡單，所用固態基質均為廉價的農業廢棄物秸稈，漆酶生產過程中只需要添加水來保持培養基的濕度，不需要添加其他營養物質，發酵成本極為低廉。本發明為秸稈等廢棄物提供了一條工業化應用的有效途徑，還可減少因焚燒造成的環境污染。本發明制備的漆酶酶活高，酶活達9500U/g (DMP法)以上。
具體實施例方式本發明所使用的白腐真菌菌株來自于中國典型培養物保藏中心，命名為 Pycnoporus sp. STOC-L3，保藏編號為CCTCC NO =M 2010235。酵母膏為國產分析純濃稠漿液，葡萄糖為國產分析純粉末，蛋白胨為國產分析純粉末，豆粕為市面購買的粉末。實施例1
1、種子液的制備
配制種子液培養基酵母膏ι份，葡萄糖5份，蛋白胨2份，PH為自然狀態，高壓蒸汽滅菌20 min0冷卻后接種白腐真菌菌株，于20°C的恒溫搖床中培養4天；
2、接種于固態培養基
配制固態培養基平均長度為3cm以下的玄子小麥秸稈1份，豆粕3份，水1份，pH為自然狀態，高壓蒸汽滅菌20 min0冷卻后按體積分數洲的比例將種子液接入固態培養基中，于35°C條件下發酵6天；發酵過程是在固態發酵罐中，發酵罐密封；
3、后處理
向發酵完畢的培養基中加入1倍質量的蒸餾水，20°C浸提2小時，過濾，超濾濃縮5倍后，即得漆酶液體制劑。經過噴霧干燥后即得漆酶粉狀制劑；
4、漆酶活性的測定
漆酶活性的測定方法以DMP為底物，每3ml反應體系含160 mmol/1檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH 3. 5),10 mmol/1 DMP, 30 °C保溫5 min，加入100 μ 1酶液，用紫外可見分光光度計在470 nm處測吸光值。以每分鐘氧化1 μ mol的DMP成為3，5，3‘ 5'-四甲氧基二苯醌(ε =49. 6 mrnoF1 · 1 · cnT1)所需要的酶量定義為1個酶活力單位，以U/ml表示；
5、結果漆酶粉末制劑的酶活達到9500U/g。
實施例2
1、種子液的制備
配制種子液培養基酵母膏5份，葡萄糖20份，蛋白胨10份，pH為自然狀態，高壓蒸汽滅菌20 min0冷卻后接種白腐真菌菌株。于35°C的恒溫搖床中培養2天；
2、接種于固態培養基
配制固態培養基平均長度為3cm以下的水稻秸稈4份，豆粕1份，水7份，pH為自然狀態，高壓蒸汽滅菌20 min0冷卻后按體積分數15%的比例將種子液接入固態培養基中，于 20°C條件下發酵15天；發酵過程是在固態發酵罐中，發酵罐密封；
3、后處理
向發酵完畢的培養基中加入5倍質量的蒸餾水，40°C浸提8小時，過濾，超濾濃縮20倍后，即得漆酶液體制劑。經過噴霧干燥后即得漆酶粉狀制劑；
4、漆酶活性的測定與實施例1相同；
5、結果
漆酶粉末制劑的酶活達到7800U/g。
權利要求
1.一種固態發酵生產漆酶的方法，其特征在于具體步驟如下(1)種子液制備將白腐真菌菌株接種在經滅菌處理的種子液培養基中，2(T35°C搖床培養2、天即為種子液，所述種子液培養基的組分及質量份數為酵母膏廣5份，葡萄糖 5 20份，蛋白胨2 10份；(2)發酵產酶將步驟(1)得到的種子液以體積分數2 15%接種量接入固態培養基中， 于2(T35°C條件下發酵6 15天，所述固態培養基的組分及質量份數秸稈廣4份，豆粕廣3 份，水1 7份；(3)漆酶制劑制備向步驟(2)得到的發酵完畢的培養物中加入質量為該培養物全部質量的廣5倍的蒸餾水，2(T40°C浸提2、小時，過濾；將濾液超濾濃縮5 20倍后干燥，即得漆酶制劑。
2.根據權利要求1所述的固態發酵生產漆酶的方法，其特征在于所述秸稈可以為玄子小麥秸稈、水稻秸稈的一種或者兩種混合，將其粉碎至平均長度為3cm以下使用。
全文摘要
一種固態發酵生產漆酶的方法，具體步驟(1)種子液制備將白腐真菌菌株接種在經滅菌處理的種子液培養基中，20~35℃搖床培養2~4天即為種子液，種子液培養基的組分及質量份數為酵母膏1~5份，葡萄糖5~20份，蛋白胨2~10份；(2)發酵產酶將步驟(1)得到的種子液以體積分數2~15%接種量接入固態培養基中，于20~35℃條件下發酵6~15天，固態培養基的組分及質量份數秸稈1~4份，豆粕1~3份，水1~7份；(3)漆酶制劑制備向步驟(2)得到的發酵完畢的培養物中加入質量為該培養物全部質量的1~5倍的蒸餾水，20~40℃浸提2~8小時，過濾；將濾液超濾濃縮5~20倍后干燥，即得漆酶制劑。本發明使用的固態培養基由農作物秸稈、豆粕和水組成，操作簡單，成本低廉。
文檔編號C12R1/645GK102533685SQ20121005480
公開日2012年7月4日 申請日期2012年3月5日 優先權日2012年3月5日
發明者廖詳如, 楊勝林, 王欣, 趙曉聯 申請人:宜興市金和農業技術有限公司