專利名稱：酪酸梭菌的固態發酵方法
技術領域：
本發明涉及微生物技術領域，尤其是涉及一種固態發酵制備酪酸梭菌的方法。
背景技術：
酪酸梭菌又稱酪酸梭狀芽孢桿菌，酪酸桿菌，酪酸菌，丁酸梭狀芽孢桿菌，丁酸梭菌，丁酸桿菌，丁酸菌，拉丁文Clostridium butyricum。本菌存在于土壤、動物和人體的腸道中，細菌學分類歸屬于梭菌屬，為革蘭氏陽性厭氧桿菌。菌體中常有圓形成或橢圓形芽胞，使菌體中部膨大呈梭形。該菌在37°C、PH7時為生長發育的最適條件，它能利用多種糖類，如葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖和果糖等，并能利用淀粉。本菌的主要代謝產物為丁酸、乙酸。酪酸菌是調節人體腸道微生態平衡的有益菌，其在人體腸道內可體現五大生物特性1、促進腸道有益菌群(雙歧桿菌，乳酸桿菌)的增殖和發育，抑制腸道內有害菌和腐敗菌的生長、繁殖，糾正腸道菌群紊亂，減少腸毒素的發生。2、在腸道內能產生B族維生素、 維生素K、淀粉酶等物質，對人體具有保健作用。3、酪酸菌的主要代謝產物丁酸是腸道上皮組織細胞的再生和修復主要營養物質。4、酪酸菌是厭氧芽胞桿菌，穩定性好，在人體內不受胃酸、膽汁酸等影響，在體外室溫下能保存三年以上。5、酪酸菌對多種抗生素有較強的耐受性，在臨床上可與其并用。目前酪酸梭菌的菌劑產品主要通過液態發酵方式生產，發酵后通過固液分離獲得菌體沉淀物，而后加輔料，通過低熱干燥或冷凍干燥制成菌劑產品，而發酵過程中酪酸菌產生的各種生理活性成分，如有機酸、水解酶、維生素、天然抗菌物質和促生長因子均隨分離的上清液體排放掉。這既浪費了發酵產生的有效寶貴資源，又增加了對排放廢水治理的負擔，浪費了資源。
發明內容
針對現有技術存在的上述問題，本申請人提供了一種酪酸梭菌的固態發酵方法。 本發明操作方法簡單，成本低，所得到的酪酸梭菌質量高，有效成分無損失。本發明的技術方案如下
一種酪酸梭菌的固態發酵方法，具體步驟如下
(1)以麩皮、玉米粉、米糠為主料，添加營養物和無機鹽，制備成復合培養基，裝入發酵容器，對該復合培養基進行滅菌；
(2)向發酵容器中通入氮氣，驅趕發酵環境中的氧氣；同時將酪酸梭菌菌種與枯草芽孢桿菌菌種加入發酵容器中，與復合培養基充分攪拌均勻；
(3)在通氮氣的條件下將發酵容器中的混合物裝入不透氣無毒復合包裝袋，密封袋口， 在35、0°C環境中靜置，使酪酸梭菌發酵；發酵完畢后在低于50°C下烘干，粉碎，過篩，即成酪酸梭菌菌劑產品。所述主料的組分及各組分的質量分數為麩皮38飛5%，玉米粉20 30%，米糠15 35%，這三者的含水量均為12 15%;所述營養物和無機鹽的組分及各組分的質量為以主料的重量為基數，葡萄糖占主料的0. 2 1%，酵母膏占主料的0. 5^0. 7%，牛骨蛋白胨占主料的0. 15 0. 35%，硫胺占主料的0. 15 0. 25%，NaCl占主料的0. 15 0. 2%，CaCO3占主料的 0. 2 0. 4%, MgSO4 · 7H20 占主料的 0. θΓθ. 03%。所述營養物和無機鹽的各組分先溶解在水中，然后再添加到主料中；所述水的用量為與主料中含水量加起來一共占復合培養基總質量的45飛5%。所述酪酸梭菌菌種的重量為復合培養基總重量的1(Γ15%，所述枯草芽孢桿菌菌種的重量為復合培養基總重量的 0.5 1.5%。所述步驟(1)中滅菌條件為12(T130°C下3(T60min加熱滅菌。所述復合包裝袋可以為復合塑料袋或鋁箔袋。通過美蘭厭氧度指示劑觀察發酵環境中氧氣含量，當所述美蘭厭氧度指示劑由深藍色逐漸變淺、變淡，接近無色，表明已達到無氧或微氧狀態。發酵時間可以為一周，也可以留在袋內繼續發酵，產品內在質量可進一步得到提高，由于形成芽孢的酪酸梭菌很穩定，封閉在袋內的酪酸梭菌濕態產品可以在常溫下存放兩年。
本發明有益的技術效果在于
本發明解決了酪酸梭菌液態發酵工藝的兩大問題一是發酵液體經固液分離只取菌體沉淀物制成菌劑產品，而發酵產生的多種有效活性成分，包括有機酸、消化酶、維生素、天然抗菌物質和促生長因子等，因為它們可溶，卻隨廢液外排，寶貴資源嚴重浪費；二是外排廢液污染程度高，COD達到了 2779ang/L，NH3-N 達到了 643. 8mg/L,形成了一種高濃度的有機廢水，為此需要加大環保治理力度，增加了企業的環保壓力。本發明使這兩個問題得到解決，既大大提高了酪酸梭菌產品的內在質量和實際應用效果，也可使酪酸梭菌產品的生產做到沒有發酵廢液外排，真正實現零排放清潔生產。本發明采用塑料袋(或鋁箔袋)替代厭氧發酵罐，具有下列優點1、投資小，成本低；2、容量可大可小；3、容易處理達到厭氧或微氧條件；4、發酵產物可以干粉固態形式作產品，也可以濕態形式作為產品，后者可降低生產能耗；5、具有商品包裝功能。本發明發酵中通過生物耗氧體枯草芽孢桿菌，可促進和穩定環境厭氧，保障酪酸梭菌順利進行發酵。
具體實施例方式本實施例所用酪酸梭狀芽孢桿菌的菌種源于江蘇省微生物研究所，菌種編號 jsim-BCB 20040312。枯草芽孢桿菌的菌種源于江蘇省微生物研究所，菌種編號jsim-1019。美蘭厭氧度指示劑的制備方法為(1)取3ml濃度為0. 5%的美蘭溶液，用蒸餾水稀釋至IOOml ;(2)配制6ml濃度為0. lmol/L的氫氧化鈉溶液，用蒸餾水稀釋至IOOml ； (3) 取6g試劑級葡萄糖加蒸餾水稀釋至IOOml ； (4)將上述三種溶液等體積混合即可得到美蘭厭氧度指示劑。實施例1
(1)以麩皮38kg、玉米粉30 kg、米糠32 kg為主料，其含水量為均12%，即主料的水分質量為12kg ；添加溶于水中的營養物和無機鹽(營養物和無機鹽的組分為葡萄糖0. 2 kg，酵母膏 0.5 kg，牛骨蛋白胨 0.15 kg，硫胺 0.15 kg, NaCl 0. 15 kg, CaCO3 0.2 kg, MgSO4 ·7Η20 0.01 kg，以上組分溶解在61. Ilkg水中，與主料中水分加起來一共為73. Ilkg的水，其占復合培養基總質量(162. 47kg)的45%)，制備成復合培養基，裝入發酵容器，對該復合培養基進行滅菌，滅菌條件為120°C下50min加熱滅菌；
(2)向發酵容器中通入氮氣，驅趕發酵環境中的氧氣；同時將16.247kg (占復合培養基總質量的10%)的酪酸梭菌菌種與0. 81kg (占復合培養基總質量的0. 5%)的枯草芽孢桿菌菌種加入發酵容器中，與復合培養基充分攪拌均勻；
(3)在通氮氣的條件下將發酵容器中的混合物裝入不透氣無毒復合塑料袋，密封袋口， 在35°C環境中靜置一周，使酪酸梭菌發酵；發酵完畢后在45°C下烘干，粉碎，過篩，即成酪酸梭菌菌劑產品。實施例2
(1)以麩皮陽kg、玉米粉25kg、米糠20 kg為主料，其含水量為均15%，即主料的水分質量為15kg ；添加溶于水中的營養物和無機鹽(營養物和無機鹽的組分為葡萄糖1 kg，酵母膏 0.7 kg，牛骨蛋白胨0.35 kg %，硫胺0.25 kg,NaCl 0.2 kg, CaCO3 0.4 kg，MgSO4 ·7Η20 0. 03 kg,以上組分溶解在92. 47kg水中，與主料中水分加起來一共為107. 47kg的水，其占復合培養基總質量(195. 4kg)的55%)，制備成復合培養基，裝入發酵容器，對該復合培養基進行滅菌，滅菌條件為130°C下30min加熱滅菌；
(2)向發酵容器中通入氮氣，驅趕發酵環境中的氧氣；同時將四.31kg(占復合培養基總重量的15%)的酪酸梭菌菌種與2. 931kg (占復合培養基總重量的1. 5%)的枯草芽孢桿菌菌種加入發酵容器中，與復合培養基充分攪拌均勻；
(3)在通氮氣的條件下將發酵容器中的混合物裝入不透氣無毒鋁箔袋，密封袋口，在 40°C環境中靜置一周，使酪酸梭菌發酵；發酵完畢后在45°C下烘干，粉碎，過篩，即成酪酸梭菌菌劑產品。檢測與對比
實施例1和2所制備得到的發酵產品采用硫乙醇酸鹽流體培養基發酵培養，然后按照中華人民共和國農業行業NY 527-2002光合細菌菌劑標準附錄B有效活菌數的測定步驟 MPN 5管法進行計算，實施例1中發酵產品中酪酸梭菌活菌數和芽孢數為1. 3*109cfu/克， 實施例2中發酵產品中酪酸梭菌活菌數和芽孢數為2. I^lO9Cfu/克；一般液體發酵法生產的酪酸梭菌的含量為3. 6 6. 4*108cfu/ ml,《天津科技大學學報》2010年第二期《酪酸梭狀芽孢桿菌發酵培養基的優化》報道4. l*108cfu/ml,《飼料工業》2004年第25卷第2期《一株飼用酪酸菌特性和培養條件的研究》報道8. 2*108cfu/ml,《飼料工業》2005年第沈卷第 10期《酪酸梭狀芽孢桿菌培養條件的研究》報道6. 5*108cfu/ml，《飼料工業》2009年第4期 《益生菌酪酸菌93-7發酵培養基及培養條件的研究》報道8. 5*108cfu/ml。上述數據單位中 Iml可以約為lg。通過對比實施例及所提供的對比例，本固態發酵法的發酵活菌數和芽孢數提高了 2飛倍。
權利要求
1.一種酪酸梭菌的固態發酵方法，其特征在于具體步驟如下(1)以麩皮、玉米粉、米糠為主料，添加營養物和無機鹽，制備成復合培養基，裝入發酵容器，對該復合培養基進行滅菌；(2)向發酵容器中通入氮氣，驅趕發酵環境中的氧氣；同時將酪酸梭菌菌種與枯草芽孢桿菌菌種加入發酵容器中，與復合培養基充分攪拌均勻；(3)在通氮氣的條件下將發酵容器中的混合物裝入不透氣無毒復合包裝袋，密封袋口， 在35、0°C環境中靜置，使酪酸梭菌發酵；發酵完畢后在低于50°C下烘干，粉碎，過篩，即成酪酸梭菌菌劑產品。
2.根據權利要求1所述的酪酸梭菌的固態發酵方法，其特征在于，所述主料的組分及各組分的質量分數為麩皮38 55%，玉米粉20 30%，米糠15 35%，這三者的含水量均為 12 15%;所述營養物和無機鹽的組分及各組分的質量為以主料的重量為基數，葡萄糖占主料的0. 2 1%，酵母膏占主料的0. 5^0. 7%，牛骨蛋白胨占主料的0. 15^0. 35%，硫胺占主料的 0. 15 0. 25%, NaCl 占主料的 0. 15 0. 2%, CaCO3 占主料的 0. 2 0. 4%, MgSO4 · 7H20 占主料的 0.01 0.03%。
3.根據權利要求2所述的酪酸梭菌的固態發酵方法，其特征在于，所述營養物和無機鹽的各組分先溶解在水中，然后再添加到主料中；所述水的用量為與主料中含水量加起來一共占復合培養基總質量的45飛5%。
4.根據權利要求1所述的酪酸梭菌的固態發酵方法，其特征在于，所述酪酸梭菌菌種的重量為復合培養基總重量的1(Γ15%，所述枯草芽孢桿菌菌種的重量為復合培養基總重量的 0. 5 1. 5%ο
5.根據權利要求1所述的酪酸梭菌的固態發酵方法，其特征在于，所述步驟(1)中滅菌條件為12(Tl30°C下3(T60min加熱滅菌。
6.根據權利要求1所述的酪酸梭菌的固態發酵方法，其特征在于，所述復合包裝袋可以為復合塑料袋或鋁箔袋。
全文摘要
一種酪酸梭菌的固態發酵方法，具體步驟如下(1)以麩皮、玉米粉、米糠為主料，添加營養物和無機鹽，制備成復合培養基，裝入發酵容器，對該復合培養基進行滅菌；(2)向發酵容器中通入氮氣，驅趕發酵環境中的氧氣；同時將酪酸梭菌菌種與枯草芽孢桿菌菌種加入發酵容器中，與復合培養基充分攪拌均勻；(3)在通氮氣的條件下將發酵容器中的混合物裝入不透氣無毒復合包裝袋，密封袋口，在35~40℃環境中靜置，使酪酸梭菌發酵；發酵完畢后在低于50℃下烘干，粉碎，過篩，即成酪酸梭菌菌劑產品。本發明操作方法簡單，成本低，所得到的酪酸梭菌質量高，有效成分無損失。
文檔編號C12N1/20GK102533597SQ20111043704
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月23日 優先權日2011年12月23日
發明者劉鳳琴, 薛宏基, 鄒益東 申請人:宜興市天石飼料有限公司