專利名稱：一株降解金霉素的小刺青霉lj220的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株能夠降解金霉素的小刺青霉(Penicillium spinulosum)LJ220,屬于微生物技術領域。
背景技術：
金霉素可以預防多種動物疾病，被廣泛應用于獸醫臨床和畜牧業養殖中。金霉素在發酵生產過程中會產生大量菌渣和廢水，若處理不完善，大量金霉素進入環境，會對生態環境和諸多生物產生毒性和抑制作用，同時還可能誘導出耐藥性菌及耐藥基因，對人類健康造成潛在危害。因此，金霉素廢棄物的脫毒處理已成為金霉素廢棄物殘留污染和生產企業可持續發展中亟待解決的重大問題。與此同時，金霉素菌渣中富含蛋白質、礦物質等多種營養成分，資源化利用潛力巨大。篩選并利用高效降解金霉素的微生物菌株，對菌渣進行ニ 次發酵，降解菌渣中的金霉素殘留，不僅可以減少金霉素對環境的危害，而且又為菌渣的資源化利用和變廢為寶提供了基礎條件。目前，國內外對金霉素降解菌株的篩選以及利用高效菌株降解金霉素廢棄物的研究報導極少。2005年，何瑜利用篩選得到一株紅曲霉B3菌株對金霉素生產廢水進行了降解率研究。而有關小刺青霉對降解金霉素方面的研究，國內外尚無報導。
發明內容
本發明的目的在于提供一株金霉素高效降解菌株小刺青霉LJ220以及基因。本發明所提供的金霉素降解菌株LJ220，通過對其形態特征觀察和rDNA-ITS序列分析，確定該菌株為小刺青霉(Penicillium spinulosum),命名為小刺青霉LJ220 (Penicillium spinulosum LJ220)。該菌株已于2012年2月14日保存于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號為=CGMCC No. 5754，保藏單位地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。該菌株的rDNA-ITS序列由554個堿基(bp)組成，序列如下TGOGGAAGGA TCATTACTGA GTGAGGGCCC TCTGGGTCCA ACCTCCCACC 0GTGTTTATT 60GTACCTTGTT GCTTCGGTGC GCCCGCCTCA CGGCOGCCGG GGGGCTTCTG CCCC0GGGTC 1200G0G0GCACC GGAGACACCA TTGAACTCTG TCTGAAGATT GCAGTCTGAG CATAAACTAA 180ATAAGTTAAA ACTTTCAACA ACGGATCTCT TGGTTCOGGC ATCGATGAAG AA0GCAGCGA 240AATG0GATAA CTAATGTGAA TTGCAGAATT CAGTGAATCA TOGAGTCTTT GAACGCACAT 300TGOGCCCCCT GGTATTCOGG GGGGCATGCC TGTC0GAG0G TCATTGCTGC CCTCAAGCAC 360GGCTTGTGTG TTGGGCTCCG TCCCCCOGGG GACGGGCCOG AAAGGCAGCG GCGGCACCGA 420GTCCGGTCCT CGAGCGTATG GGGCTTTGTC ACCCGCTCTG TAGGCCCGGC 0GGCGCCAGC 480OGACAACCCA TCATCCTTTT CAGGTTGACC TOGGATCAGG TAGGGATACC 0GCTGAACTT 540AAGCATATCA ATAA554本發明中的菌株LJ220的菌落形態為
菌落邊緣較整齊，周邊菌絲為乳白色，短絨毛狀，菌絲致密，中部產生分生孢子區，為灰緑色，表面上常分泌出水珠，菌落背面為肉桂色。顯微鏡觀察菌絲具橫隔，分生孢子梗頂端生有掃帚狀的分枝結構，分生孢子橢圓形。本發明中的金霉素降解菌株LJ220可以在以金霉素為唯一碳源的培養基中生長。在以金霉素為唯一碳源且金霉素含量為4. Og/L的液體培養基中培養，其對金霉素的降解率可達31. 60%。本發明中的菌株LJ220對 菌渣中金霉素的降解率達到80. 20%，該菌株對金霉素菌渣具有較好的適應性，在新鮮的菌渣中能快速生長。該菌株可應用于金霉素生產企業廢棄物的處理和周邊污染環境的生物修復。本發明的有益效果本發明的一株金霉素降解菌株LJ220的基因，它是小刺青霉(Penicilliumspinulosum) LJ220的rDNA-ITS基因，它是通過基因組DNA的提取，rDNA-ITS序列的擴增，rDNA-ITS全序列測定和分析而獲得。本發明從金霉素生產企業的廢棄物中篩選得到一株在金霉素為唯一碳源培養基中能較好生長的新菌株LJ220。該菌株使用方便，具有降解菌渣與液體中殘留金霉素的作用，可應用于金霉素生產企業廢棄物的處理，也可望應用于金霉素污染環境的生物修復。同吋，菌株LJ220還可作為金霉素降解菌劑的制備原料。
圖I為金霉素降解菌株LJ220的基因組DNA凝膠電泳圖(從左向右第一泳道和第ニ泳道為LJ220的基因組DNA，第三泳道為Marker)；圖2為金霉素降解菌株LJ220的菌落形態圖；圖3為金霉素降解菌株LJ220的顯微形態圖。
具體實施例方式實施例II. 一株降解金霉素的小刺青霉LJ220的篩選方法I. I材料準備菌樣品來源采自金霉素生產企業廢棄物。培養基無機鹽固體培養基(NH4)2S042.00g, K2HPO4O. 50g, KH2PO4O. 50g, MgSO4 · 7H20O. 50g, NaCl 0. 20g, CaCl2O. lg, FeSO4O. Olg, EDTA 0. 015g,瓊脂 13. OOg,葡萄糖 2. OOg/L,溶于1000ml蒸餾水中。115°C滅菌20min后，在超凈工作臺中添加2. 00g/L金霉素。馬丁氏培養基:蛋白胨6. 0g，葡萄糖 10. 0g, KH2PO4L 0g, MgSO4 · 7H20 O. 5g，溶于1000ml蒸懼水中。115で滅菌20111；[11。選擇培養基(NH4)2S042. 00，K2HPO4O. 50，KH2PO4O. 50，MgSO4 · 7H20 0. 50，NaCl0. 20,CaCl2O. 10,FeSO4O. Olg,EDTA 0. 015g，溶于 1000ml 蒸餾水中。115°C滅菌 20min，待冷
卻后，添加4. 0g/L金霉素。I. 2實驗儀器與設備
島津LC-20A高效液相色譜儀，UNICO UV-2600A紫外可見光分光光度計，MettlerToledo ML204 分析天平、Mettler Toledo pH 計、YT-CJ-IND 超凈工作臺、HZQ-F160 全溫振蕩培養箱、TG16-W高速離心機、YX-280D手提式壓力蒸汽滅菌器、Nicon Eclipse 80i熒光顯微鏡、DNA Engine PCR儀、DcodeTM變性梯度凝膠電泳儀、DHP-9082電熱恒溫培養箱、BOSCH冰箱、Champ Gel-3200凝膠成像系統等。I. 3菌株篩選操作步驟如下I)菌株分離與純化吸取400 μ L廢水樣，涂布于無機鹽固體培養基平板上，置于28-30°C條件下遮光培養2-7天。挑選單菌落，在無機鹽固體培養基上劃線分離純化。此步驟重復1-2次，直至得到單ー菌落。
2)高效降解金霉素菌株的篩選將步驟I)中得到的單菌落挑起并依次接入馬丁氏培養基中進行活化，然后按2%的接種量轉接到的選擇培養基中，置于28-30°C，170r/min震蕩條件下進行暗培養，第3天和第6天用高效液相色譜法測定各個單ー菌落對金霉素的降解率，從中篩選出降解率高的菌株LJ220。2.對金霉素降解菌株LJ220的分子生物學鑒定鑒定步驟如下2. I基因組DNA的提取I)菌種活化配制馬鈴薯培養基，分裝后滅菌。按O. 5%的接種量將菌株LJ220的種子液接種至裝有馬鈴薯培養基的三角瓶中，28°C，170r/min培養24h。取上述發酵液按2%接種量轉接至新的馬鈴薯培養基中，28°C，170r/min培養48h。2)將步驟I)培養得到的菌球放入研缽中用液氮充分研磨，將研磨后的粉末轉入新的I. 5ml的EP管中，加入600 μ I 65°C的CTAB，于水浴鍋中65°C保溫15_30min。3)向EP管中加入600μ1氯仿異戊醇為24 I的混合液，充分混勻，4°C，10000r/min離心5min,取上清液至新的EP管中。4)向步驟3)得到的上清液中加入1/10體積的3M NaAc和2. 5倍體積的無水こ醇，-20°C沉淀 IOmin0 4°C, 10000r/min 離心 5min,棄上清。5)用70%冰こ醇500 μ I洗滌DNA 2-3次，倒掉液體，倒置EP管晾干，然后加入100 μ I I X TE 溶解。6)用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測。7)凝膠成像系統觀測，照相。圖I為金霉素降解菌株LJ220的基因組DNA凝膠電泳圖(從左向右第一泳道和第二泳道為LJ220的基因組DNA，第三泳道為Marker)。2.2ITS序列的擴增采用通用引物ITSl和ITS4，對菌株LJ220的rDNA基因的ITS片段進行PCR擴增。PCR擴增序列采用50 μ L反應體系Mix 25yL，引物ITSl(10mmol/L)lyL，引物ITS4 (IOmmoI/L) I μ L,模板(約 25mmol/L) 2 μ L, ddH20 21 μ しPCR 反應條件為94°C預變性 5min，94°C變性 30S，55°C退火 45S，72°C延伸 lmin，30個循環，最后72°C延伸IOmin。擴增后的PCR產物通過I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用凝膠成像系統觀察。2.3ITS序列的鑒定將擴增的ITS序列送北京諾賽基因組研究中心測序，得到該菌株的rDNA-ITS序列組成TGOGGAAGGA TCATTACTGA GTGAGGGCCC TCTGGGTCCA ACCTCCCACC OGTGTTTATT 60GTACCTTGTT GCTTCGGTGC GCCCGCCTCA CGGCOGCCGG GGGGCTTCTG CCCCOGGGTC 1200G0G0GCACC GGAGACACCA TTGAACTCTG TCTGAAGATT GCAGTCTGAG CATAAACTAA 180ATAAGTTAAA ACTTTCAACA ACGGATCTCT TGGTTCOGGC ATCGATGAAG AAOGCAGCGA 240AATGOGATAA CTAATGTGAA TTGCAGAATT CAGTGAATCA TOGAGTCTTT GAACGCACAT 300TGOGCCCCCT GGTATTCOGG GGGGCATGCC TGTCOGAGOG TCATTGCTGC CCTCAAGCAC 360GGCTTGTGTG TTGGGCTCCG TCCCCCOGGG GACGGGCCOG AAAGGCAGCG GCGGCACCGA 420GTCCGGTCCT CGAGCGTATG GGGCTTTGTC ACCCGCTCTG TAGGCCCGGC OGGCGCCAGC 480OGACAACCCA TCATCCTTTT CAGGTTGACC TOGGATCAGG TAGGGATACC OGCTGAACTT 540AAGCATATCA ATM554上述rDNA-ITS序列由554個喊基(bp)組成。3.菌落形態特征觀察菌株LJ220在馬丁氏平板培養基上能較好生長。菌落邊緣較整齊，周邊菌絲為乳白色，短絨毛狀，菌絲致密；菌落中部產生分生孢子后，為灰緑色，表面上常分泌出水珠；菌落背面為肉桂色。顯微鏡觀察菌絲具橫隔，分生孢子梗頂端生有掃帚狀的分枝結構，分生孢子橢圓形。圖2為金霉素降解菌株LJ220的菌落形態圖；圖3為金霉素降解菌株LJ220的顯微形態圖。4.菌株LJ220鑒定為一種新功能菌株將測序結果與NCBI中的GenBank進行Blast比對，得到LJ220與Penicilliumspinulosum的ITS序列的同源性為99%。根據菌株LJ220的形態特征以及rDNA-ITS序列分析結果，將該菌株鑒定為小刺青霉(Penicillium spinulosum),并命名為小刺青霉LJ220 (Penicillium spinulosum LJ220)。該菌株已于2012年2月14日保存于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號=CGMCC No. 5754。目前，國內外尚沒有文獻報導小刺青霉(Penicillium spinulosum)具有降解金霉素的功能。因此，菌株LJ220屬于ー種新功能菌株。實施例2菌株LJ220對金霉素為唯一碳源的降解實驗將菌株LJ220接入以金霉素為唯一碳源且金霉素含量為4. 00g/L的無機鹽液體培養基中，進行搖瓶培養，測定培養液中金霉素含量。通過測定得知LJ220對唯一碳源金霉素的降解率可達31. 60% ο測定方法為取ImL培養液,加入5mL的甲醇,8000r/min離心5min,取上清液用22 μ m的濾膜過濾，利用高效液相色譜儀測定濾液中金霉素含量并計算出的降解率。實施例3菌株LJ220對金霉素菌渣處理實驗用馬丁氏培養基活化菌株LJ220，然后接種到新鮮的金霉素菌渣中，室溫條件下、進行暗培養，然后定期取樣測定菌渣中金霉素的殘留量，得知菌株LJ220對菌渣中金霉素的降解率為80. 02%。測定方法為準確稱取菌渣5. 00g，用50mL丙酮鹽酸溶液(4mol/L):水=13 : I : 6的提取液提取，提取液在8000r/min條件下，離心5min，取上清液，用 22 μ m的濾膜過濾，利用高效液相色譜儀測定濾液中金霉素含量并計算出的降解率。
權利要求
1.一株降解金霉素的小刺青霉LJ220，其特征在于通過形態特征觀察，基因組DNA提取和rDNA-ITS序列擴增與比對，鑒定菌株LJ220為小刺青霉(Penicillium spinulosum)，命名為小刺青霉 LJ220 (Penicillium spinulosum LJ220)，CGMCC No. 5754。
2.根據權利要求I所述的一株降解金霉素的小刺青霉LJ220，其特征在于小刺青霉LJ220的菌落形態為邊緣較整齊，周邊菌絲為乳白色，短絨毛狀，菌絲致密，中部產生分生孢子區，為灰綠色，表面上常分泌出水珠，菌落背面為肉桂色；顯微鏡觀察菌絲具橫隔，分生孢子梗頂端生有掃帚狀的分枝結構，分生孢子橢圓形。
3.根據權利要求I所述的一株降解金霉素的小刺青霉LJ220的基因，其特征在于菌株的rDNA-ITS全序列如下 TGCGGAAGGA TCATTACTGA GTGAGGGCCC TCTGGGTCCA ACCTCCCACC CGTGTTTATT 60 GTACCTTGTT GCTTCGGTGC GCCCGCCTCA CGGCCGCCGG GGGGCTTCTG CCCCCGGGTC 120 CGCGCGCACC GGAGACACCA TTGAACTCTG TCTGAAGATT GCAGTCTGAG CATAAACTAA 180ATAAGTTAAA ACTTTCAACA ACGGATCTCT TGGTTCCGGC ATCGATGAAG AACGCAGCGA 240AATGCGATAA CTAATGTGAA TTGCAGAATT CAGTGAATCA TCGAGTCTTT GAACGCACAT 300 TGCGCCCCCT GGTATTCCGG GGGGCATGCC TGTCCGAGCG TCATTGCTGC CCTCAAGCAC 360 GGCTTGTGTG TTGGGCTCCG TCCCCCCGGG GACGGGCCCG AAAGGCAGCG GCGGCACCGA 420 GTCCGGTCCT CGAGCGTATG GGGCTTTGTC ACCCGCTCTG TAGGCCCGGC CGGCGCCAGC 480 CGACAACCCA TCATCCTTTT CAGGTTGACC TCGGATCAGG TAGGGATACC CGCTGAACTT 540 AAGCATATCA ATAA554 該菌株的rDNA-ITS序列由554個堿基(bp)組成。
4.根據權利要求3所述的一株降解金霉素的小刺青霉LJ220的基因，其特征在于采用BLAST分析法，對菌株LJ220的rDNA-ITS基因序列與NCBI中的GenBank進行Blast比對，得到菌株LJ220與Penicillium spinulosum的ITS序列的同源性為99%。
5.根據權利要求I所述的一株降解金霉素的小刺青霉LJ220的應用，其特征在于該菌株LJ220用于金霉素的降解中。
6.根據權利要求5所述的一株降解金霉素的小刺青霉LJ220的應用，其特征在于將菌株接種于以金霉素為唯一碳源且金霉素含量為4. Og/L的液體培養基中，其對金霉素的降解率達到31.6%。
7.根據權利要求5所述的一株降解金霉素的小刺青霉LJ220的應用，其特征在于用馬丁氏培養基活化菌株LJ220，然后接種到金霉素菌渣中，室溫條件下進行暗培養；菌株LJ220對菌渣中金霉素的降解率為80. 02%。
全文摘要
本發明涉及一株能夠降解金霉素的小刺青霉LJ220，屬于微生物技術領域。本發明所述的小刺青霉命名為小刺青霉LJ220(Penicillium spinulosum LJ220)。該菌株已于2012年2月14日保存于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號為CGMCC No.5754。本發明的基因序列是通過基因組DNA提取、rDNA-ITS序列擴增和全序列測定與分析而獲得。本發明菌株LJ220能在金霉素為唯一碳源的培養基中生長。該菌株使用方便，對菌渣中殘留的金霉素具有高效降解作用。
文檔編號C12N1/14GK102732431SQ20121005768
公開日2012年10月17日 申請日期2012年3月7日 優先權日2012年3月7日
發明者李秀珍, 李艷菊, 楊正禮, 肖思穎, 董曉霞 申請人:北京理工大學, 楊正禮