專利名稱：應用生物反應器灌流培養制備狂犬疫苗的方法
技術領域：
本發明涉及制備狂犬疫苗的方法，具體涉及應用生物反應器灌流培養制備狂犬疫苗的方法。
背景技術：
狂犬病疫苗是預防狂犬病的唯一有效手段。采用Vero細胞做為生產基質制備狂犬疫苗是國內外目前主要采用的工藝，Vero細胞是WHO推薦使用的人用疫苗生產基質。早期Vero細胞制備狂犬病疫苗大多數采用轉瓶生產工藝，由于受到轉瓶表面積和培養條件的限制，細胞密度低，勞動強度大，操作過程易污染，疫苗質量難以得到保證。自從60年代微載體生物反應器培養技術建立以來，生物反應器便以其高密度、大規模、低成本的優勢引起廣泛關注。生物反應器培養工藝，具有綜合成本低、批量大、批間差小、所獲得病毒抗原含量高等優點。國內外許多企業對其在疫苗生產中的應用進行了廣泛研究，有多家研究機構對貼壁依賴性細胞用生物反應器流加式培養(Fed-batch culture)方法進行了研究，但尚未將灌流式培養(Perfusion culture)方法用于Vero細胞狂犬疫苗生產。灌流式培養是一方面新鮮培養基不斷加入反應器，另一方面又將反應器液體不斷取出，使培養環境相對穩定。我們將生物反應器技術和灌流式培養技術結合起來，以微載體為載體，VERO細胞做為生產基質針對狂犬病疫苗大規模工業化生產進行了研究，取得了很好的效果。生物反應器灌流式培養與流加式培養方式的原理與比較生物反應器流加式培養的原理通過流加高濃度葡萄糖和谷氨酰胺，使培養液中的葡萄糖和谷氨酰胺的濃度控制在設定范圍內。生物反應器灌流式培養的原理通過調節灌流速率，將反映細胞代謝活性的某一環境變量控制在設定點。使用流加式培養方式，使得細胞密度和目標產物濃度有所提高，但有時往往提高的不多。因為有三十多種甚至更多的營養物質的濃度需要控制，僅控制葡萄糖和谷氨酰胺的濃度是不高的。采用灌流式培養，可以更精確地控制培養液中的各種營養物質的濃度，使得細胞密度和目標產物濃度大幅提高，彌補了流加式培養方式的不足。使用生物反應器灌流式培養不僅大大提高了細胞生長密度和病毒液的滴度，而且有助于產物的純化，較其他方式的生物反應器方法進一步提高了產物的效力和產量。
發明內容
本發明將生物反應器技術和灌流式培養技術結合起來，原理是細胞生長在反應器中懸浮的微載體上，并且通過灌流式系統不斷地更新培養液和提供細胞生長和病毒表達所需要的氣體環境，以使細胞的生長和病毒的表達達到最佳狀態。本發明還通過大量實驗找出了適于該方法的涉及接種量、培養液組成、反應器參數等的各項最佳條件，采用這些條件下的生物反應器灌流培養使單位時間內病毒產量得到了很大的提高。本發明提供一種應用生物反應器灌流培養狂犬病毒的方法，其包括以下步驟a)用添加有8-10%小牛血清和谷氨酰胺、PH值被調節為7. 4-7. 8的MEM培養基復蘇VERO細胞；
b)在生物反應器中用含8-10%小牛血清的MEM溶液作為預孵液將微載體孵育20-24小時；c)將步驟a)中的復蘇VERO細胞接種至步驟b)中的包含微載體的生物反應器中進行培養，接種量為1. 8 X 109-2. 2 X IO9個細胞，所述反應器連接有灌流系統，所述灌流系統主要由與液位電極偶聯的具有補液和排液功能的蠕動泵組成；d)反應器內細胞長滿單層后，按0. 1-0. 001M0I加入aG加入狂犬病毒株，吸附4_5小時后開啟灌流系統，補加添加有0. 5-1%人血白蛋白和1-2%谷氨酰胺，PH值被調節為7. 4-7.8的MEM培養基作為細胞維持液，進液量和出液量相同，反應器內培養體積恒定；e)病毒接種48-72小時后進行病毒液收獲，連續收獲14_20天；f)濃縮、滅活、純化和稀釋后，制成疫苗。在一個優選實施方案中，步驟c)中加入的VERO細胞為由130代VERO細胞復蘇至135代的細胞。在一個更優選的實施方案中，步驟c)中加入的VERO細胞在加入反應器之前用胰蛋白酶消化。在一個更優選的實施方案中，步驟c)中培養的反應器參數設置為溫度34-37°C、轉速 50-55rpm、pH 值 7. 2-7. 8、溶氧 20-30%。在一個更優選的實施方案中，步驟d)中開啟灌流系統后的反應器參數設置為溫度 34-38°C、轉速 50-55rpm、pH 值 7. 2-7. 8、溶氧 15-25%,出液泵速 25%,進液泵速 100%,進液量和出液量為每M小時一個罐體積。在一個更優選的實施方案中，步驟f)中使用PALL超濾器和截留分子量為30W的密理博膜包按20-30倍比例進行濃縮，并且超濾器的系統參數設定為溫度4-8°C、泵速50-60rpm、壓力差 0. 1-0. 3pa。在一個更優選的實施方案中，步驟f)中使用β-丙內酯作為滅活劑進行滅活，按1/3000-1/6000濃度加入，在2-8°C下滅活20- 小時，然后在37°C下水解M小時。在一個更優選的實施方案中，步驟f)中使用阿瑪西亞層析系統和瓊脂糖凝膠Sepharose 4FF進行純化，系統參數設定為波長觀0、溫度4_8 °C、泵速50_80rpm、壓力0. 1-0. 4pa.在一個更優選的實施方案中，步驟f)中使用的稀釋液為含3%人血白蛋白溶液的PBS。 在一個更優選的實施方案中，所用微載體為GE公司的Cytodexl微載體，所用反應器為NBS公司的4500或310型反應器。
具體實施例方式以下具體描述僅出于舉例的目的，而不限制本發明的范圍。本發明使用的VERO細胞來源于中國生物制品檢定所。本發明使用的MEM培養基來自北大清一，小牛血清來自武漢三利小牛血清，谷氨酰胺來自北京化工廠或其他進口廠商，胰蛋白酶來自DIFCO公司，硅化液來自GIBCO公司，人血白蛋白來自奧科特法碼公司，β -丙內酯來自SERVA。本發明使用的細胞計數裝置由計數板和光學顯微鏡(0LYMP0Q組成。本發明使用的反應器為美國NBS公司4500或310型產品。本發明使用的濃縮設備為PALL超濾器，使用的濾膜為截留分子量30W的密理博膜包。本發明使用的中純化設備為阿瑪西亞層析系統，凝膠為瓊脂糖凝膠kpharose 4FF。實施例1用加入10%小牛血清和谷氨酰胺的MEM培養基(調節PH值為-7.8)將130代VERO細胞進行復蘇，擴增。后在轉瓶中進行擴增培養至接種反應器所需的量，經胰酶消化獲得139代細胞2 X IO9個，將所得細胞導入已經加入預孵Cytodexl微載體的滅菌(高壓蒸汽115-121°C 40-60分鐘)后的14L生物反應器(反應器為NBS310型)，生物反應器中已加入添加有10%小牛血清和1 %谷氨酰胺的MEM培養基(調節PH值為7. 4-7. 8)。調整反應器參數為溫度37°C、轉速55rpm、pH值7. 8、溶氧30%。每天取樣觀察細胞，細胞接種7天后按0. 001M0I加入aG株狂犬病毒，吸附4小時后開啟灌流系統，補加細胞維持液(添加有0. 5 %人血白蛋白、1 %谷氨酰胺的MEM培養基，調節PH值為7. 4-7. 8)。調整反應器參數為溫度35°C、轉速50rpm、pH值7. 2、溶氧20%、出液泵速25%、進液泵速100%，進液量和出液量為每M小時10L。細胞接種病毒M小時后可進行病毒液收獲，連續收獲20天，共收獲200升病毒液。檢定疫苗病毒收獲液的滴度為8. 01ogLD50。檢定方法見中國藥典第101頁2. 2. 3項。將收獲的200升病毒液經截留分子量為30W單位的密理博膜包按壓力差0. Ipa進行濃縮，共收集IOL病毒濃縮液。經1/4000 β -丙內酯4度M小時滅活，37度2小時水解制得滅活病毒濃縮液10L，經安全檢驗合格后進行層析純化，層析系統設定為波長觀0、溫度25°C、泵速80rpm、壓力0.4pa，凝膠為kpharose 4FF。上樣后收集第一峰，共收獲20L純化液，根據效力檢定指標用含3%人血白蛋白溶液的PBS稀釋純化液共制備半成品40L。經分裝后制得水針型狂犬病疫苗6700人份。在細胞投入量相同的條件下本發明工藝與其他生物反應器工藝相比較，生物反應器灌流培養制備狂犬疫苗的產量是目前普遍采用的生產方法的培養產量的10倍。實施例2用加入8%小牛血清和2%谷氨酰胺的MEM培養基(調節PH值為7. 4-7. 8)將130代VERO細胞進行復蘇，擴增。后在轉瓶中進行擴增培養至接種反應器所需的量，經胰酶消化獲得139代細胞2 X IO9個，將所得細胞導入已經加入預孵Cytodexl微載體的滅菌(高壓蒸汽115-121°C 40-60分鐘)后的14L生物反應器(反應器為NBS310型)，生物反應器中已加入添加有8%小牛血清和2%谷氨酰胺的MEM培養基(調節PH值為7. 4-7. 8)。調整反應器參數為溫度37°C、轉速55rpm、pH值7. 8、溶氧30 %。每天取樣觀察細胞，細胞接種7天后按0. 001M0I加入aG株狂犬病毒，吸附4小時后開啟灌流系統，補加細胞維持液(添加有1 %人血白蛋白、2 %谷氨酰胺的MEM培養基，調節PH值為7. 4-7. 8)。調整反應器參數為溫度35°C、轉速50rpm、pH值7. 8、溶氧20 %、出液泵速25 %、進液泵速100%，進液量和出液量為每M小時10L。細胞接種病毒M小時后可進行病毒液收獲，連續收獲20天，共收獲200升病毒液。檢定疫苗病毒收獲液的滴度為7. 851ogLD50。檢定方法見中國藥典第101頁2. 2. 3項。將收獲的200升病毒液經截留分子量為30W單位的密理博膜包按壓力差0. Ipa進行濃縮，共收集9. 5L病毒濃縮液。經1/4000 β -丙內酯4度M小時滅活，37度2小時水解制得滅活病毒濃縮液9. 5L，經安全檢驗合格后進行層析純化，層析系統設定為波長觀0、溫度25°C、泵速80rpm、壓力0.4pa，凝膠為kpharose 4FF。上樣后收集第一峰，共收獲19L純化液，根據效力檢定指標用含3%人血白蛋白溶液的PBS稀釋純化液共制備半成品38L。經分裝后制得水針型狂犬病疫苗6300人份。實施例3用加入9%小牛血清和1. 5%谷氨酰胺的MEM培養基(調節PH值為7. 4-7. 8)將130代VERO細胞進行復蘇，擴增。后在轉瓶中進行擴增培養至接種反應器所需的量，經胰酶消化獲得139代細胞2 X IO9個，將所得細胞導入已經加入預孵Cytodexl微載體的滅菌(高壓蒸汽115-121°C 40-60分鐘)后的14L生物反應器(反應器為NBS310型)，生物反應器中已加入添加有9%小牛血清和1. 5%谷氨酰胺的MEM培養基(調節PH值為7. 4-7. 8)。調整反應器參數為溫度37°C、轉速55rpm、pH值7. 8、溶氧30%。每天取樣觀察細胞，細胞接種7天后按0. 001 MOI加入aG株狂犬病毒，吸附4小時后開啟灌流系統，補加細胞維持液(添加有0. 8 %人血白蛋白、1. 5 %谷氨酰胺的MEM培養基，調節PH值為7. 4-7. 8)。調整反應器參數為溫度35 °C、轉速50rpm、pH值7. 5、溶氧20 %、出液泵速25 %、進液泵速100 %，進液量和出液量為每M小時10L。細胞接種病毒M小時后可進行病毒液收獲，連續收獲20天，共收獲200升病毒液。檢定疫苗病毒收獲液的滴度為7. 651ogLD50。檢定方法見中國藥典第101頁2. 2. 3項。將收獲的200升病毒液經截留分子量為30W單位的密理博膜包按壓力差0. Ipa進行濃縮，共收集L病毒濃縮液。經1/4000 β -丙內酯4度M小時滅活，37度2小時水解制得滅活病毒濃縮液9L，經安全檢驗合格后進行層析純化，層析系統設定為波長觀0、溫度25°C、泵速80rpm、壓力0. 4pa，凝膠為kpharose 4FF。上樣后收集第一峰，共收獲18L純化液，根據效力檢定指標用含3%人血白蛋白溶液的PBS稀釋純化液共制備半成品36L。經分裝后制得水針型狂犬病疫苗6000人份，1. Oml/支。檢定疫苗的效力達到了 5. 5IU。檢定方法見(中國藥典附錄XI A)。
權利要求
1.一種應用生物反應器灌流培養狂犬病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟a)用添加有8-10%小牛血清和1-2%谷氨酰胺、PH值被調節為7.4-7. 8的MEM培養基復蘇VERO細胞；b)在生物反應器中將微載體用含8-10%小牛血清的MEM溶液作為預孵液孵育20-24 小時；c)將步驟a)中的復蘇VERO細胞接種至步驟b)中的包含微載體的生物反應器中進行培養，接種量為1. 8 X 109-2. 2 X IO9個細胞，所述反應器連接有灌流系統，所述灌流系統主要由與液位電極偶聯的具有補液和排液功能的蠕動泵組成；d)反應器內細胞長滿單層后，按0.1-0. 001M0I加入aG加入狂犬病毒株，吸附4_5小時后開啟灌流系統，補加添加有0. 5-1 %人血白蛋白和1-2 %谷氨酰胺，PH值被調節為 7. 4-7.8的MEM培養基作為細胞維持液，進液量和出液量相同，反應器內培養體積恒定；e)病毒接種48-72小時后進行病毒液收獲，連續收獲14-20天；f)濃縮、滅活、純化和稀釋后，制成疫苗。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟c)中加入的VERO細胞為由130代 VERO細胞復蘇至135代的細胞。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟c)中使用的VERO細胞在加入反應器之前用胰蛋白酶消化。
4.根據權利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于，步驟c)中培養的反應器參數設置為溫度 34-37"C、轉速 50-55rpm、pH 值 7. 2-7. 8、溶氧 20-30%。
5.根據權利要求1-4任一項所述的方法，其特征在于，步驟d)中開啟灌流系統后的反應器參數設置為溫度34-38°C、轉速50-55rpm、pH值7. 2-7. 8、溶氧15-25%，出液泵速 25%，進液泵速100%，進液量和出液量為每M小時一個罐體積。
6.根據權利要求1-5任一項所述的方法，其特征在于，步驟f)中使用PALL超濾器和截留分子量為30W的密理博膜包按20-30倍比例進行濃縮，并且超濾器的系統參數設定為溫度 4-8°C、泵速 50-60rpm、壓力差 0. 1-0. 3pa。
7.根據權利要求1-6任一項所述的方法，其特征在于，步驟f)中使用β-丙內酯作為滅活劑進行滅活，按1/3000-1/6000濃度加入，在2-8°C下滅活20- 小時，然后在37°C下水解M小時。
8.根據權利要求1-7任一項所述的方法，其特征在于，步驟f)中使用阿瑪西亞層析系統和瓊脂糖凝膠kpharose 4FF進行純化，系統參數設定為波長觀0、溫度4_8°C、泵速 50-80rpm、壓力 0. 1-0. 4pa.
9.根據權利要求1-8任一項所述的方法，其特征在于，步驟f)中使用的稀釋液為含 3%人血白蛋白溶液的PBS。
10.根據權利要求1-9任一項所述的方法，其特征在于，所用微載體為GE公司的 Cytodexl微載體，所用反應器為NBS公司的4500或310型反應器。
全文摘要
本發明公開一種制備狂犬疫苗的方法，具體公開了一種在涉及接種量、培養液組成、反應器參數等的各項最佳條件下應用生物反應器灌流式培養制備狂犬疫苗的方法。
文檔編號C12N7/02GK102552899SQ20121005847
公開日2012年7月11日 申請日期2012年3月7日 優先權日2012年3月7日
發明者朱昌林, 陶雷 申請人:長春百克生物科技股份公司