專利名稱：從麥曲中提取微生物總dna的方法
技術領域：
本發明屬于核酸提取技術，尤其是指從固體麥曲中提取微生物總DNA。
背景技術：
黃酒與啤酒、葡萄酒并稱為世界三大發酵古酒，黃酒源于中國，有文字記載的釀酒歷史達2500年，享有“國酒”的美譽。黃酒低耗糧、低酒度、高營養，是一種集營養和保健為一體的釀造酒，并具有烹飪、藥用等功效，符合酒類市場低度、營養、保健的消費趨勢，因而被國家列為重點扶植和發展的飲料酒之一。從2002年起，我國黃酒的產量每年都以兩位數的速度增長，2005年國內黃酒產量突破200萬噸。黃酒自身源遠流長的釀造工藝相當復雜而獨特，堪稱世界一絕，而麥曲又是中國黃酒生產敞開式發酵最為經典和獨創之作。麥曲是小麥經軋碎加水制成塊狀，在夏末初秋的氣候下，對自然生境中的多種微生物進行富集培養，形成了包含所產生各種酶及代謝產物的培養物體系。而正是源于多菌種多酶系及其協同作用形成的豐富的代謝產物奠定了黃酒的品質和風格。處于這些不同釀造環境中的微生物，在生產過程中通過不同的代謝途徑相互組合、切斷、阻遏和調節，完成了多種微生物混合發酵過程的復雜代謝和代謝產物的多樣性，富集了大量讓酒出香顯味的物質和前體，而正是這些才形成了具有數千年酒文化歷史且只有中國有之的黃酒的特殊魅力。可以說，參與黃酒釀造過程的多種微生物是黃酒典型的特征和獨一無二的資源，是黃酒生產和發展的基礎。對這些釀酒微生物進行研究和發掘，對黃酒的資源保護以及科學和經濟發展均有重要的價值。釀造黃酒離不開乳酸菌參與生化反應，在一定程度上由乳酸菌代謝產生的乳酸與酵母發酵生成的酒精反應生成乳酸乙酯的含量，決定了黃酒的風味。乳酸菌群與酵母菌、曲霉菌共同參與黃酒發酵，俗稱“三邊發酵”。在黃酒發酵過程中，降低和維持低PH值，形成黃酒中有效成分乳酸。黃酒為開放式發酵，而乳酸桿菌的大量生長，能夠產生并累積乳桿菌素以及維持低PH值，抑制其他細菌的生長繁殖，而對酵母無抑制作用。在黃酒前發酵與主發酵期間，主要是高溫乳酸菌生長、繁殖、發酵。而在釀酒發酵的后期，主要是低溫乳酸菌群的生長、繁殖、發酵。由于厭氧乳酸菌的繁殖，代謝產生較多乳酸，使酒醪酸度上升，有效地抑制了其他的部分雜菌的代謝活動。同時在乳酸菌生長代謝過程中，會產生一些具有抗微生物活性的物質，如有機酸、過氧化氫、二氧化碳等。這些物質均在體外表現出抑菌活性，而且很多乳酸菌都能產生細菌素，如乳鏈菌素、噬酸菌素、乳酸桿菌素等，這些物質在保持和改善黃酒釀造微生態環境的穩定與協調中發揮著重要的調節作用。而且在后發酵中由于醪溫降低，形成部分高溫乳酸菌死亡、自溶，給酵母和低溫乳酸菌發酵提供了豐富的營養物質。建國以來對于黃酒制曲、制酒以及地域環境中的微生物，已有了許多研究并取得了一定成果。但是這些研究都是采用的傳統技術和方法，如先分離再用培養基培養菌株、以及采用平板計數和生物量測定等分析方法，而這些方法都有著自身的局限性和偏差性。一方面，參與黃釀造過程的微生物多種多樣，而目前能分離得到的不過三百余種，還有大量菌株是不可分離和培養的，這些微生物變成了研究的盲區，但是這其中有許多可能是參與釀造的關鍵所在。隨著高通量測序技術和宏基因組學研究的興起，目前的技術已經能對不能分離培養的微生物進行基因分析，然而如何從固體的麥曲中，將所有微生物的DNA都有效的提取出來，以及避免麥曲本身小麥的基因組污染，以防止測序時，產生大量的小麥基因組數據，成為了目前的技術關鍵。現有的一些核酸提取試劑盒，有從土壤、糞便等提取細菌總 DNA，但尚未出現針對釀酒麥曲中提取所有細菌以及真菌的DNA提取試劑盒。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種能提取麥曲中所有細菌以及真菌的基因組 DNA的方法，其能實現小麥的DNA污染非常低，并且成本低廉，得到的DNA總量高，足夠用于后續的高通量測序，real time PCR鑒定等研究。為了解決上述技術問題，本發明提供一種從麥曲中提取微生物總DNA的方法，依次包括以下步驟①、向Ig固體麥曲中加入2. 5 3. 5ml的Tris-EDTA浸泡，均勻混合后靜置；吸取浸泡液；將浸泡液低速離心，得首次上清液(低速離心的目的是將一些固體顆粒除去，而細菌比較小，在低速離心下，不會沉淀下來，所以還在首次上清液中)；將首次上清液高速離心，得沉淀(高速離心將所有細菌都離心下來，然后重懸于后續少量的TriS-EDTA中，目的是濃縮體積)；將沉淀重懸在180 220 ill的Tris-EDTA中，均勻混合；②、將20ul濃度為15-20mg/ml的溶菌酶和20ul濃度為15_20mg/ml蛋白酶K加入到步驟①所得的產物中，于36. 5 37. 5°C孵育20 40min ;備注說明溶菌酶、蛋白酶K 均用Tris-EDTA來配制；③、向步驟②所得的產物中加入50 70iU質量濃度為10%的SDS (十二烷基磺酸鈉)溶液，于36. 5 37. 5°C孵育20 40min ；④、向步驟③所得的產物中加入140 160 ill濃度為5mol/l的NaCl溶液，渦旋震蕩，混勻；再加入140 150iU提前預熱至60 70°C的CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)， 于60 70°C孵育I 13min ；⑤、向步驟④所得的產物中加入等體積的試劑混合液(即，試劑混合液與步驟④ 所得的產物的體積比為I : I)，上下顛倒混勻，于3 5°C 10000 14000rcf/min離心10 20min;所述試劑混合液由酚氯仿異丙醇按照25 24 I的體積比混合而得；⑥、將步驟⑤離心所得的上清液轉移到新的離心管并加入等體積氯仿(即，氯仿與步驟⑤離心所得的上清液的體積比為I : I),于3 5°C 10000 14000rcf/min離心 10 20min ；⑦、將步驟⑥離心所得的上清液轉移到新的離心管并加入400 600iU的異丙醇，上下顛倒混勻后，-18 -22°C沉淀30 40min ；⑧、將步驟⑦的所得物于3 5°C 10000 14000rcf/min離心10 20min,去上清；再加入體積濃度為70 80%的乙醇0. 8 I. 2ml，于3 5°C 10000 14000rcf/min 離心10 20min ;去上清，并在室溫下干燥10 20min ；⑨、在步驟⑧所得的沉淀中加入50 100 ill的Tris-EDTA溶解后，取I U I測濃度，其余于_20°C保存備用。作為本發明的從麥曲中提取微生物總DNA的方法的改進步驟①低速離心為 300 500rcf/min 離心 4 6min ;高速離心為 12000 14000rcf/min 離心 0. 8 I. 2min。本發明的從麥曲中提取微生物總DNA的方法，具有如下優點I、成本低廉，平均提取每樣品不足2元；2、得率高，從Ig麥曲中，可以提取到4. 6ug以上的微生物總DNA ；3、質量好，蛋白質污染少，提取到的DNA的260/280值都在2. 0左右；綜上所述，本發明提供了一種可以從黃酒釀造的麥曲中，提取所有細菌以及真菌的總DNA的方法，該方法成本低、提取的DNA得率高、污染低；適合為大規模麥曲的微生物研究做樣品準備工作；也可以為進一步研制相應的快速提取試劑盒提供研究基礎。
具體實施例方式實施例I、從麥曲中提取微生物總DNA的方法，分別用麥曲自然發酵1-6天，共6個樣本，編號分別為kql, kq2, kq3, kq4, kq5, kq6 ;對上述6個樣本分別進行以下步驟的操作①、無菌條件下，在超凈工作臺各稱取麥曲固體樣本lg，加入3ml TE(Tris-EDTA)， 上下顛倒5次混勻并靜置5min。吸取液體部分(即浸泡液)，400rcf/min離心5min,得首次上清液。吸取首次上清液轉移到新的管子中，13000rcf/min離心Imin ;棄去上清,將沉淀重懸在200 的TE中，渦旋震蕩混勻。TE為Tris-EDTA簡稱，為公知技術。例如可按照以下方法進行配制Iml IM Tris-HCl加0. 2ml 0. 5M EDTA，加18. 2M歐姆的超純水定容至100ml。②、將20 ii L濃度為15mg/ml的溶菌酶與20 U I的濃度為15mg/ml的蛋白酶K加入到步驟①所得產物中，37°C孵育30min;備注說明上述溶菌酶和蛋白酶K均用TE進行稀釋。③、向步驟②所得的產物中加入60 ill質量濃度為10%的SDS，并在37°C孵育 30min ；④、向步驟③所得的產物中加入160 U I濃度為5mol/l的NaCl，渦旋震蕩，混勻； 再加入144 ill提前預熱至65°C的CTAB，65°C下孵育IOmin ；⑤、向步驟④所得產物中加入等體積的試劑混合液(由酚氯仿異丙醇= 25 : 24 : I的體積比混合而得)，上下顛倒8次混勻，4°C 12000rcf/min離心15min ;⑥、將步驟⑤離心所得的上清液轉移到新的離心管并加入等體積氯仿， 4°C 12000rcf/min 離心 15min ；⑦、將步驟⑥離心所得的上清液轉移到新的離心管并加入500 U I異丙醇，上下顛倒 5 次，_20°C沉淀 35min ；⑧、將步驟⑦的所得物取出后4°C下12000rcf/min離心lOmin，去上清，再加入 Iml 75% (體積濃度)的乙醇，4°C下12000rcf/min離心IOmin ;去上清,并在室溫下干燥 15min ；⑨、在步驟⑧所得的沉淀中加入TE定容至80 iil，溶解后，取I ill測濃度，其余于-20°C保存備用。⑩、用NanoDrop測得濃度為表I所示
表I
權利要求
1.從麥曲中提取微生物總DNA的方法，其特征是依次包括以下步驟①、向Ig固體麥曲中加入2.5 3. 5ml的Tris-EDTA浸泡，均勻混合后靜置；吸取浸泡液；將浸泡液低速離心，得首次上清液；將首次上清液高速離心，得沉淀；將沉淀重懸在180 220 μ I的Tris-EDTA中，均勻混合；②、將20ul濃度為15-20mg/ml的溶菌酶和20ul濃度為15_20mg/ml蛋白酶K加入到步驟①所得的產物中，于36. 5 37. 5°C孵育20 40min ；③、向步驟②所得的產物中加入50 70μ I質量濃度為10%的SDS溶液，于36. 5 37. 5°C 孵育 20 40min ；④、向步驟③所得的產物中加入140 160μ I濃度為5mol/l的NaCl溶液，渦旋震蕩， 混勻；再加入140 150 μ I提前預熱至60 70°C的CTAB，于60 70°C孵育7 13min ；⑤、向步驟④所得的產物中加入等體積的試劑混合液，上下顛倒混勻，于3 5°C 10000 14000rcf/min離心10 20min ;所述試劑混合液由酹氯仿異丙醇按照 25 : 24 : I的體積比混合而得；⑥、將步驟⑤離心所得的上清液轉移到新的離心管并加入等體積氯仿，于3 5°C 10000 14000rcf/min 離心 10 20min ；⑦、將步驟⑥離心所得的上清液轉移到新的離心管并加入400 600μ I的異丙醇，上下顛倒混勻后，-18 -22 沉淀30 40min ；⑧、將步驟⑦的所得物于3 5°C10000 14000rcf/min離心10 20min,去上清；再加入體積濃度為70 80 %的乙醇O. 8 I. 2ml,于3 5°C 10000 14000rcf/min離心 10 20min ;去上清，并在室溫下干燥10 20min ；⑨、在步驟⑧所得的沉淀中加入50 100μ I的Tris-EDTA溶解后，取I μ I測濃度，其余于-20°C保存備用。
2.根據權利要求I所述的從麥曲中提取微生物總DNA的方法，其特征是所述步驟①低速離心為300 500rcf/min離心4 6min ；高速離心為12000 14000rcf/min 離心 O. 8 I. 2min。
全文摘要
本發明公開了一種從麥曲中提取微生物總DNA的方法，包括以下步驟①向固體麥曲中加入Tris-EDTA浸泡，浸泡液多次離心，所得沉淀重懸在Tris-EDTA中；②加入溶菌酶和蛋白酶K孵育；③加入SDS溶液孵育；④加入NaCl溶液和CTAB孵育；⑤加入由酚、氯仿和異丙醇混合而得的試劑混合液，離心；⑥將步驟⑤離心所得的上清液加入氯仿后，離心；⑦將步驟⑥離心所得的上清液加入異丙醇，沉淀30～40min；⑧將步驟⑦的所得物離心，去上清；再加入乙醇后，離心，去上清，干燥；⑨在步驟⑧所得的沉淀中加入Tris-EDTA溶解后，取1μl測濃度，其余于-20℃保存備用。
文檔編號C12N15/10GK102586232SQ201210062008
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月9日 優先權日2012年3月9日
發明者余文菁, 宓婭娜, 洪旭濤, 程小璇, 謝廣發 申請人:浙江加州國際納米技術研究院紹興分院