專利名稱：一種鹵醇脫鹵酶的生產方法
技術領域：
本發明屬于生物工程領域，具體涉及一種利用基因工程菌發酵生產鹵醇脫鹵酶的方法。
背景技術：
有機鹵化合物已成為當今社會的重要環境污染物之一，這主要是由于工業排廢以及人工合成鹵化物在化工合成以及農業上的廣泛應 用造成的。在自然界中，大部分異生質鹵化物自降解能力很差，同時許多化合物被疑是致癌或高誘變物質。因此，應用微生物降解有機鹵化物已引起人們廣泛的關注。從1968年Castro首次發現以2，3- 二溴丙醇作為唯一的碳源而生存的黃桿菌菌株至今，人們相繼篩選到多種可以降解鄰鹵醇的微生物，其中包括從淡水沉淀物中分離的放射形土壤桿菌菌株ADl和節桿菌菌株AD2以及從土壤中獲得的棒狀桿菌菌株N-1074等。它們降解有機鹵化物的途徑雖然存在明顯差異，但是鹵醇脫鹵酶作為關鍵酶之一，催化碳鹵鍵的斷裂存在于所有的代謝途徑中。由于鹵醇脫鹵酶具有很高的選擇特異性(enantioselectivity),因此在合成光學純鹵醇、環氧化物及二醇等重要手性藥物中間體方面也具有很重要的應用價值。野生型鹵醇脫鹵酶存在活性低和選擇性較差的缺陷，使其應用受到限制。通過基因工程和分子定向進化技術，改造天然的鹵醇脫鹵酶，并在大腸桿菌表達系統中高效表達，可以提高鹵醇脫鹵酶的酶活性、底物選擇性和產量。在專利申請號為200810186576. 6的專利中，安琪酵母有限公司通過以上方法開發的鹵醇脫鹵酶的酶活性已經提高到450U/ml。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服現有技術中的鹵醇脫鹵酶活性不高等問題，提供一種酶活性和產量更高、生產成本更低的齒醇脫齒酶生產方法。為解決以上技術問題，本發明采取如下技術方案
一種鹵醇脫鹵酶的生產方法，包括以下步驟
(1)、構建基因工程菌，配制搖瓶種子培養基和發酵培養基；所述基因工程菌為表達了鹵醇脫鹵酶的重組大腸桿菌；
(2)、使基因工程菌斜面活化2(Γ25小時，再將活化后的基因工程菌接種至裝有搖瓶種子培養基的搖瓶中，在37°C的條件下振蕩培養8 15小時，得到種子液；
(3)、將經步驟(2)振蕩培養后的種子液接入發酵培養基中進行發酵，按體積比，接種時種子液/發酵培養基=1°/Γ10% ;發酵培養的溫度控制在25 37°C，發酵液的pH值控制在6. 5^7. O ;當發酵液中的細胞光密度> 20時，向發酵液中添加誘導劑，且誘導劑在發酵液中的加入質量占發酵液總量的O. 01°Γθ. 2% ;然后繼續發酵1(Γ15小時；
所述發酵培養基的組成包括酵母粉擴15g/L、甘油4. 5^7. 5g/L、NaCl 8 llg/L、NaNO3I 2g/L，KH2PO4 2 3g/L，K2HPO4 12 13g/L，微量元素 2 5mg/L ；
(4)、步驟(3)完成后，采用常規方法從步驟(3)所得發酵液的培養物中取得鹵醇脫鹵酶，經后續處理，完成整個生產過程。根據本發明，所述發酵培養基中的微量元素包括CoCl2 · 6H20、MnCl2 · 4H20、CuCl2 · 4H20和生物素 。在本發明的一個優選實施方式中，所述發酵培養基的組成包括酵母粉12g/L、甘油6g/L、NaCl 10g/L、NaNO3 I. 44g/L、KH2PO4 2. 4g/L，Κ2ΗΡ0412· 5g/L，微量元素 2 3mg/L。優選地，所述誘導劑為異丙基_β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)。優選地，步驟(3)的發酵過程中，添加誘導劑前控制發酵液的pH值在6. 5飛.6之間，添加誘導劑后控制發酵液的PH值在6. 8飛.9之間(可用氨水調節)。優選地，步驟(3)的發酵過程中，添加誘導劑前的發酵溫度控制在37°C ;添加誘導劑后的發酵溫度控制在28°C。發酵過程的誘導劑添加前的一個階段是菌體生長階段，溫度控制在37°C，發酵液PH值控制在6. 5飛.6之間，有利于菌體繁殖生長；而發酵過程的誘導劑添加后的一個階段是誘導表達階段，發酵溫度控制在28°C，發酵液pH值在6. 8飛.9之間，更有利于鹵醇脫鹵酶的誘導生成。所以，最佳的誘導時間應在菌體的對數生長后期。優選地，步驟(3)的發酵過程中，發酵液中的溶氧控制在209Γ25%。優選地，所述搖瓶種子培養基的組成包括蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L和卡那霉素50ug/mL，且pH值為7. O。若未經特殊說明，本發明中所述的細胞光密度皆指的是0D_值。0D_是追蹤液體培養物中微生物生長的標準方法。OD是optical density (光密度)的縮寫，表示被檢測物吸收掉的光密度，是檢測方法里的專有名詞。光通過被檢測物，前后的能量差異即是被檢測物吸收掉的能量，特定波長下，同一種被檢測物的濃度與被吸收的能量成定量關系。0D_指的就是某種溶液在600nm波長處的吸光值。吸光值正比于溶液中的吸光物質的濃度，相應地與樣品的透過率成反比。由于以上技術方案的實施，本發明與現有技術相比具有如下優點
本發明利用基因工程菌發酵生產鹵醇脫鹵酶，通過優化發酵培養基和發酵工藝條件，能夠顯著地提高鹵醇脫鹵酶的產量，提高酶活性(可達到近900U/ml)。
具體實施例方式下面結合具體的實施例對本發明做進一步詳細的說明，但不限于這些實施例。本發明中的基因工程菌一重組大腸桿菌的構建按照常規分子生物操作完成見《分子克隆》(科學出版社，第二版，2002年)。本實驗使用的發酵罐為上海保興生物設備工程有限公司生產的BIOTECH-1OL發酵罐。本發明生產鹵醇脫鹵酶的一個具體實施方式
是
(I )、構建基因工程菌，配制搖瓶種子培養基和發酵培養基。(2)、使基因工程菌斜面活化24小時，再將活化后的基因工程菌接種至搖瓶種子培養基裝液量為50mL的300 mL搖瓶中，在37°C的條件下以220 r/min的轉速振蕩培養10小時，再按接種液/搖瓶種子培養基的體積比為25%的接種量將上述振蕩培養液接入二級搖瓶中，同樣條件下再振蕩培養10小時，得到種子液；分兩次搖瓶培養只是為擴大菌株的培養量，這是常規操作。
(3)、將經步驟(2)振蕩培養后的種子液接入發酵培養基中進行發酵，按體積比，接種時種子液/發酵培養基=1°/Γ5% ;發酵培養的溫度控制在25 37°C，發酵液的pH值控制在
6.5^7. O ;當發酵液中的細胞光密度> 20時，向發酵液中添加誘導劑IPTG，且誘導劑在發酵液中的加入質量占發酵液總量的O. 01°Γθ. 2% ;然后繼續發酵12小時； (4)、步驟(3)完成后，采用常規方法從步驟(3)所得發酵液的培養物中取得鹵醇脫鹵酶，經后續處理，完成整個生產過程。上述用到的搖瓶種子培養基的組成包括蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L和卡那霉素50ug/mL,且pH值為7. O。其制備過程如下稱取IOg蛋白胨、5g酵母粉、IOgNaCl，溶解在700ml去離子水中，調節pH至7. 0，用去離子水定容至1000ml，121°C下保持20分鐘，待溶液冷卻到60°C左右加入卡那霉至卡那霉素的最終濃度為50ug/ml。上述用到的發酵培養基的組成包括酵母粉擴15g/L、甘油4. 5 7. 5g/L、NaCl8 llg/L、NaN03 I 2g/L，KH2PO4 2 3g/L，K2HPO4 12 13g/L，微量元素 2 5mg/L ;所述微量元素包括CoCl2 · 6H20、MnCl2 · 4H20、CuCl2 · 4H20和生物素。其中，甘油主要為菌株的生長提供碳源，其他常見的碳源還有乳糖、蔗糖和葡萄糖等；酵母粉主要為菌株的生長提供氮源，一般常見的氮源還有牛肉膏、蛋白胨等有機氮源，以及NaN03、NH4NO3^ (NH4)2SO4和尿素等無機氮源，通常無機氮源和有機氮源會配合使用以提高菌體產酶能力。實施例I
在其它條件相同的情況下，本實施例用三種常見碳源分別代替甘油作為發酵培養基中碳源，以對比不同碳源對于所生產的鹵醇脫鹵酶的酶活性的影響(見表I)。結果表明，以乳糖、蔗糖和葡萄糖為碳源，添加量為O. 6% (v/v)時酶活性較低，添加量增加為5. 0%時酶活性增加不明顯甚至下降。表I碳源對菌體生長及產酶的影響
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實施例2
選擇甘油作為發酵培養基的碳源，在其它條件相同的情況下，以包括酵母粉在內的三種有機氮源和四種無機氮源分別作為發酵培養基的氮源，添加量以氮元素摩爾數相等為依據，以對比不同氮源對于所生產的鹵醇脫鹵酶的酶活性的影響(見表2)。從表2中可看出，當酵母粉為氮源時，酶活性高達545. 7U/mL，而生物量僅為I. 78g/L ;以蛋白胨和牛肉膏做氮源時，雖然單位酶活性高于無機氮源，但菌體生長過快，大量營養物質消耗在生物量的增加上；而采用無機氮源雖然菌體產酶能力較高，但由于菌體量較少導致總酶量不高。表2氮源對菌體生長及產酶的影響
權利要求
1.一種鹵醇脫鹵酶的生產方法，其特征在于所述生產方法包括以下步驟 (1)、構建基因工程菌，配制搖瓶種子培養基和發酵培養基；所述基因工程菌為表達了鹵醇脫鹵酶的重組大腸桿菌； (2)、使基因工程菌斜面活化2(Γ25小時，再將活化后的基因工程菌接種至裝有搖瓶種子培養基的搖瓶中，在37°C的條件下振蕩培養8 15小時，得到種子液； (3)、將經步驟(2)振蕩培養后的種子液接入發酵培養基中進行發酵，按體積比，接種時種子液/發酵培養基=1°/Γ10% ;發酵培養的溫度控制在25 37°C，發酵液的pH值控制在6.5^7. O ;當發酵液中的細胞光密度> 20時，向發酵液中添加誘導劑，且誘導劑在發酵液中的加入質量占發酵液總量的O. 01°Γθ. 2% ;然后繼續發酵1(Γ15小時； 所述發酵培養基的組成包括酵母粉擴15g/L、甘油4. 5^7. 5g/L、NaCl 8 llg/L、NaNO3I 2g/L，KH2PO4 2 3g/L，K2HPO4 12 13g/L，微量元素 2 5mg/L ； (4)、從經過步驟(3)的發酵液的培養物中取得所述鹵醇脫鹵酶。
2.根據權利要求I所述的鹵醇脫鹵酶的生產方法，其特征在于所述發酵培養基中的微量元素包括 CoCl2 · 6H20、MnCl2 · 4H20、CuCl2 · 4H20 和生物素。
3.根據權利要求I或2所述的鹵醇脫鹵酶的生產方法，其特征在于所述發酵培養基的組成包括酵母粉 12g/L、甘油 6g/L、NaCl 10g/L、NaNO3 I. 44g/L、KH2PO4 2. 4g/L，K2HPO412. 5g/L，微量元素 2 3mg/L。
4.根據權利要求I所述的鹵醇脫鹵酶的生產方法，其特征在于所述誘導劑為異丙基-β -D-硫代批喃半乳糖苷。
5.根據權利要求I所述的鹵醇脫鹵酶的生產方法，其特征在于步驟(3)的發酵過程中，添加誘導劑前控制發酵液的PH值在6. 5^6. 6之間，添加誘導劑后控制發酵液的pH值在6.8 6. 9之間。
6.根據權利要求I所述的鹵醇脫鹵酶的生產方法，其特征在于步驟(3)的發酵過程中，添加誘導劑前的發酵溫度控制在37°C ;添加誘導劑后的發酵溫度控制在28°C。
7.根據權利要求I所述的鹵醇脫鹵酶的生產方法，其特征在于步驟(3)的發酵過程中，發酵液中的溶氧控制在20% 25%。
8.根據權利要求I所述的鹵醇脫鹵酶的生產方法，其特征在于所述搖瓶種子培養基的組成包括蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L和卡那霉素50ug/mL，且pH值為7. O。
全文摘要
本發明涉及一種鹵醇脫鹵酶的生產方法，是利用微生物發酵生產鹵醇脫鹵酶，通過優化發酵工藝和發酵培養基，提高鹵醇脫鹵酶的產量和活性。本發明利用的基因工程菌為表達了鹵醇脫鹵酶的重組大腸桿菌，發酵培養基的組成包括酵母粉9~15g/L、甘油4.5~7.5g/L、NaCl8~11g/L、NaNO31~2g/L，KH2PO42~3g/L，K2HPO412~13g/L，微量元素2~5mg/L；所述微量元素包括CoCl2·6H2O、MnCl2·4H2O、CuCl2·4H2O和生物素等。本發明能夠顯著地提高鹵醇脫鹵酶的產量，酶活性可提高至900U/ml。
文檔編號C12R1/19GK102634502SQ20121007233
公開日2012年8月15日 申請日期2012年3月19日 優先權日2012年3月19日
發明者張秀蘭, 李斌, 謝磊, 鄭飛劍 申請人:蘇州漢酶生物技術有限公司