專利名稱：基于通用pcr擴增進行生物編碼的多組分色譜單核苷酸多態性檢測方法
技術領域：
本發明屬于一種檢測單核苷酸多態性的生物傳感方法，包括等位特異性連接酶鏈反應，通用PCR擴增反應，限制性內切酶消化反應以及利用液相色譜對目標基因型特異性的生物編碼長度熒光標記核酸片段的多組分定量檢測。
背景技術：
基因多態性的檢測在分子生物學、病原檢測、臨床檢驗、新藥開發和人類的起源與進化方面的研究中具有非常重要的作用。人類的許多遺傳疾病如α和β地中海貧血癥等都是由于單基因突變產生的。這些遺傳疾病是我國最主要的出生缺陷之一，嚴重影響我國的人口質量，給社會與家庭帶來沉重的經濟負擔，因此，需要建立一種快速、靈敏、特異性的高通量檢測技術。傳統基因突變檢測主要借助于電泳、質譜或基因芯片方法，這些方法需昂貴精密儀器，操作程序復雜，技術外延性差，分析周期長，故不適于進行大規模人群篩查與產前的生物學研究。目前國際上的主要趨勢都集中于以DNA修飾酶為基礎，利用酶催化反應提高基因突變鑒定方法的忠實性、可靠性與靈敏度，發展操作簡便、快速可靠、低成本、高通量的基因突變分析手段。例如，基于DNA聚合酶的等位特異性延伸或外切建立的TaqMan 探針分析、單核苷酸延伸分析等，基于DNA連接酶的等位特異性連接建立的寡核苷酸連接分析、連接酶鏈分析等，基于DNA內切酶結構識別的Invader分析等。但是,這些檢測方法大多基于核酸分子雜交、凝膠電泳分析，核酸鏈的多重標記，要么靈敏度不高、重現性不好、 可靠性差，要么分析通量較低、成本較高，且需要精密的儀器，不能滿足經濟、準確、快速檢測的需求。本發明建立的基于通用PCR擴增進行生物編碼的多組分色譜單核苷酸多態性檢測方法，樣品用量少、操作簡便、成本較低，且可進行多組分同時測定。
發明內容
本發明要解決的技術問題是，針對現有技術存在的不足，提出了一種基于通用PCR 擴增進行生物編碼的多組分色譜單核苷酸多態性檢測方法，這種方法樣品用量少、操作簡便、成本較低，且可進行多組分同時測定。本發明的技術方案是，基于通用PCR擴增進行生物編碼的多組分色譜單核苷酸多態性檢測方法，包括以下步驟(I)等位特異性連接酶鏈反應；(2)通用PCR擴增反應；(3)限制性內切酶消化反應；(4)基于液相色譜的核酸片段多組分定量檢測。以下對本發明做出進一步說明。所述基于通用PCR擴增進行生物編碼的多組分色譜單核苷酸多態性檢測方法采用以下步驟實現
等位特異性連接酶鏈反應產生與目標基因型匹配的連接產物，經通用PCR擴增反應產生連接產物的熒光標記擴增產物，通過限制性內切酶消化反應將擴增產物轉化為目標基因型特異性的長度編碼熒光標記核酸片段，利用液相色譜實施核酸片段多組分定量檢測。本發明中，所述基于通用PCR擴增進行生物編碼的多組分色譜單核苷酸多態性檢測分以下幾個步驟實現等位特異性連接酶鏈反應20 μ L IXTaq ligase buffer反應緩沖溶液(20mM Tris-HCl,25mM KAC,IOmM Mg(AC)2，and IOmM DTT，ImM NAD+,and 0. 1% Triton X_100，pH 7.9)中包含IOpM等位特異性區分探針對，IU/μ L熱穩定Taq DNA連接酶和一定濃度的相應目標鏈，于熱循環儀中進行連接酶鏈反應。95°C變性3min，10個循環95°C變性lmin，60°C 退火雜交連接5min。通用PCR反應連接酶鏈反應之后取10 μ L上述反應液，添加I μ L dNTPs混合溶液(IOmM)，O. 5 μ L Vent exo-DNA聚合酶，12. 5 μ L通用引物混合溶液(濃度分別為4 μ Μ)， 5μ L IOXThermopol buffer (IOOmM KCl,200mM Tris-HCl, IOOmM (NH4) 2S04, and I % Trion-X-100, pH 8. 8)，同時調整溶液反應體積到50 μ L，于PCR儀中進行PCR擴增反應。 95°C變性3min，30個循環95°C變性IOs ;70°C退火30s ;72°C延伸反應15s，最后72°C延伸 7min，4°C避光保存備用。限制性內切酶反應通用PCR反應之后取26 μ L上述反應液，添加IyL RsaI限制性內切酶，3 μ L 10ΧΝΕΒ buffer 4(200mM Tris-Ac, IOOmM Mg (AC) 2，500mM KAC，and IOmM DT T，pH 7. 9)，混勻，于37°C反應2h，然后65°C加熱20min進行RsaI限制性內切酶的滅活處理，然后4°C避光保存備用。注意，以上反應條件為最優條件，所述溶液體積均可成倍變化不改變最優結果。本發明中，所述基于通用PCR擴增進行生物編碼的多組分色譜單核苷酸多態性檢測方法的定量檢測可采用常規的高效液相色譜法(HPLC)進行，以下是用HPLC法對基于通用PCR擴增進行生物編碼的多組分色譜檢測單核苷酸多態性的定量檢測步驟取10 μ L限制性內切酶反應混合溶液注入LC-20AT高效液相色譜儀(Shimadzu， Japan)中進行分析。色譜條件為分離色譜柱為Shim-pack VP-ODS (4. 6 μ m, 150X4. 6mm), 保護柱為 Shim-pack VP-ODS (4. 6 μ m, I X 4. 6mm)，柱溫為 40。。，流速為 lmLl/min。流動相 A 為O. IM醋酸三乙胺水溶液(TEAA)，pH 7. O ;流動相B為O. IM含25%乙腈的ΤΕΑΑ,ρΗ 7. O。 線性洗脫梯度為25min內流動相B從50%增加到58%, IOmin內流動相B從58%增加到 60%。檢測器為RF-IOAxl突光檢測器(Shimadzu, Japan),最大激發光波長設定為490nm, 最大發射光波長設定為520nm。本發明提出了一種基于通用PCR擴增進行生物編碼的多組分色譜單核苷酸多態性檢測方法，該方法依靠連接酶鏈反應進行等位基因的基因分型，利用通用PCR進行連接產物的擴增，從而產生大量的熒光標記的擴增產物，然后通過限制性內切酶將該擴增產物轉化成目標基因型特異的編碼長度熒光標記核酸片段，最后利用HPLC進行分離檢測，從而可實現對目標基因的便捷，穩健，多組分同時檢測。
具體實施例方式
實施例I :基于通用PCR擴增進行生物編碼的多組分色譜單核苷酸多態性檢測方法用于β地中海貧血IVS-II-654(C > T)和⑶17(A > T)基因突變位點的突變檢測I)等位特異性連接酶鏈反應20 μ L I XTaq ligase buffer反應緩沖溶液 (20mM Tris-HCl,25mM KAC,IOmM Mg(AC)2, and IOmM DTT，ImM NAD+, and 0. 1% Triton X-100, pH7. 9)中包含 IOpM 等位特異性區分探針對(Probe LI :5，-P032—CCTTAACCC AGAAATTCATTGTTCGTAGCGCCCTGCCAC-3’ ；Probe Rl-M :5’ -GCGCCAGCAAGATCCAATCTAGAG TACAGAGATATTGCT ATTA-3’ ；Probe IU-W :5’ -GCGCCAGCAAGATCCAATCTAGAGTGTGTGTGT GTACAGAGATATTGCTATTG-3，；Probe L2 :5’-P032-GCCCCACAGGGATTGTTCGTAGCGCCCTGCCAC-3，； Probe R2-M :5’ -GCGCCAGCAAGATCCAATCTAGAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTACCACGTTCACCTA-3’； Probe R2-ff :5’-GCGCCAGCAAGATCCAATCTAGAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTACCACGTT CACCTT-3’)，lU/μ L熱穩定Taq DNA連接酶和一定濃度的相應目標鏈，于熱循環儀中進行連接酶鏈反應。95°C變性3min，10個循環95°C變性Imin，60°C退火雜交連接5min。2)通用PCR反應連接酶鏈反應之后取10 μ L上述反應液，添加I μ L dNTPs混合溶液(IOmM) ,0. 5μ L Vent exo-DNA聚合酶，12. 5 μ L通用引物(引物I : 5’ -GTGGCAGGGCGCTACGAACAAT-3’ ；引物 2 :5’ -FAM-GCGCCAGCAAGATCCAATCTAGA-3’ )混合溶液(濃度分別為 4μΜ)，5μ IOXThermopol buffer(IOOmM KCl,200mM Tris-HCl, IOOmM (NH4)2S04, and 1% Trion-X-100, pH 8. 8)，同時調整溶液反應體積到 50 μ L，于 PCR 儀中進行PCR擴增反應。95°C變性3min，30個循環95°C變性10s ;70°C退火30s ;72°C延伸反應15s，最后72°C延伸7min，4°C避光保存備用。3)限制性內切酶反應通用PCR反應之后取26 μ L上述反應液，添加IyL RsaI 限制性內切酶，3yL 10XNEB buffer 4(200mM Tris-Ac, IOOmM Mg (AC) 2, 5 OOmMKAC, and IOmMDTT, pH 7. 9)，混勻，于37°C反應2h，然后65°C加熱20min進行RsaI限制性內切酶的滅活處理，然后4°C避光保存備用。4)高效液相色譜測定取10 μ L限制性內切酶反應混合溶液注入LC-20AT高效液相色譜儀(Shimadzu, Japan)中進行分析。色譜條件為分離色譜柱為Shim-pack VP-ODS (4. 6 μ m，150 X 4. 6mm)，保護柱為 Shim-pack VP-ODS (4· 6 μ m，I X 4. 6mm)，柱溫為 40°C，流速為lmLl/min。流動相A為0. IM醋酸三乙胺水溶液(TEAA)，pH 7. O ;流動相B為 O. IM含25%乙腈的ΤΕΑΑ,ρΗ 7.0。線性洗脫梯度為25min內流動相B從50%增加到58%， IOmin內流動相B從58%增加到60%。檢測器為RF-IOAxl熒光檢測器(Shimadzu，Japan)， 最大激發光波長設定為490nm,最大發射光波長設定為520nm。按照上述步驟1)、2)、3)、4)對4個四種不同基因型的目標鏈(人工合成)的標準溶液(濃度分別為0fM、0. lfM、lfM、10fM、100fM、lpM、5pM、10pM。)進行檢測，記錄各標準溶液的相對保留時間和所對應的色譜峰的熒光強度，未知樣品的相對保留時間和熒光強度與和標準的液的相對保留時間和熒光強度對照，從而實現對未知樣品的基因分型。
權利要求
1.一種基于通用PCR擴增進行生物編碼的多組分色譜單核苷酸多態性檢測方法，其特征是，該方法包括以下步驟(1)等位特異性連接酶鏈反應；(2)通用PCR擴增反應；(3)限制性內切酶消化反應；(4)基于液相色譜的核酸片段多組分定量檢測。
2.根據權利要求I所述的基于通用PCR擴增進行生物編碼的多組分色譜單核苷酸多態性檢測方法，其特征在于，步驟(4)中所述的核酸片段為目標基因特異性的長度編碼熒光標記核酸片段。
3.根據權利要求I所述的基于通用PCR擴增進行生物編碼的多組分色譜單核苷酸多態性檢測方法，其特征在于，步驟(4)中所述的定量檢測是采用高效液相色譜進行多組分同時檢測。
全文摘要
本發明公開了一種基于通用PCR擴增進行生物編碼的多組分色譜單核苷酸多態性檢測方法，它包括等位特異性連接酶鏈反應，通用PCR擴增反應，限制性內切酶消化反應以及利用液相色譜對目標基因型特異性的生物編碼長度熒光標記核酸片段的多組分定量檢測。本發明利用等位特異性連接酶鏈反應產生與目標基因型匹配的連接產物，經通用PCR擴增反應產生連接產物的熒光標記擴增產物，通過限制性內切酶消化反應將擴增產物轉化為目標基因型特異性的長度編碼熒光標記核酸片段，利用液相色譜實施核酸片段多組分定量檢測。該方法樣品用量少、操作簡便、成本較低，且可進行多組分同時測定，可望為人群篩查、產前的生物學研究提供一個通用的技術平臺。
文檔編號C12Q1/68GK102586462SQ20121007384
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月20日 優先權日2012年3月20日
發明者俞汝勤, 唐麗娟, 楚霞, 王紅旗, 蔣健暉, 譚蔚泓 申請人:湖南大學