專利名稱：作為重組蛋白和酶技術的工具的SlpA的制作方法
作為重組蛋白和酶技術的工具的SlpA
本發明涉及含有SlpA分子伴倡和耙多肽的融合蛋白；重組表達、 純化和重折疊這些融合蛋白的方法；它們在蛋白和酶生物^t術中的用 途，尤其是它們在診斷中的應用。此外，本發明涉及含有SlpA和靶 多肽的任何復合物，所述復合物旨在增加用于生物技術應用的靶多肽 或酶的溶解性、活性、穩定性和/或折疊可逆性。
背景技術：
蛋白折疊是一個自發的過程，該過程由天然狀態和未折疊狀態之 間的Gibbs自由能的微小差異驅動。在折疊過程中，基本上未結構化 的多肽鏈采用所謂的蛋白的天然構象或三維結構。不完全折疊的分子 的聚集與生產性折疊竟爭，這成了一個嚴重問題，這種竟爭在體內和 體外均影響折疊收率。在活細胞中，折疊由輔助蛋白幫助。折疊輔助 物為輔助其它蛋白折疊并維持其結構完整性的多肽。它們可逆地與其 靶相互作用，由此防止有害的副反應，例如聚集過程，從而具有促進 多肽鏈正確折疊的能力。它們在體內和體外均有此能力，這些折疊輔 助物在生物技術問題中的應用數量一直在增加。 一般而言，折疊輔助 物被細分為折疊催化劑和分子伴侶。
分子伴侶已知與多肽的變性的、部分變性的或簡單地說疏水表面 可逆地結合，并由此幫助復性蛋白或使它們保持在溶液中。分子伴倡 通過可逆地結合和遮蔽疏水表面降低有聚集傾向的折疊中間體和有 聚集傾向的折疊蛋白的濃度。它們因此只發揮結合功能。相反，折疊 催化劑如二硫化物氧化還原酶和肽基脯氨酰順/反異構酶加速蛋白折 疊的限速步驟，由此縮短折疊中間體的壽命。折疊催化劑因其催化功 能而降低有聚集傾向的折疊中間體的濃度。 一類重要的折疊催化劑被稱為肽基脯氨酰順/反異構酶(PPI酶)。
基于序列相似性、蛋白拓樸學和免疫抑制分子的結合，脯氨酰異
構酶,皮分成3個不同的家族環孢素、小小菌素(parvulins)和FK506 結合蛋白(因此首字母簡略詞為FKBP)。 FKBP結合已用作免疫抑制藥 物的FK506、雷帕霉素和相關大環內酯衍生物，并^L它們抑制。
在大腸桿菌(5. co/Z)中屬于肽基脯氨酰順/反異構酶的FKBP家族 的推定折疊輔助物為SlpA， SlpA是"SlyD-樣蛋白A"的首字母簡略 詞(Hottenrott等，1997, JBC 272/25, 15697-15701)。 一直到現在還缺乏 有關SlpA及其在大腸桿菌中的生理作用的信息。盡管已報道了 SlpA 的脯氨酰異構酶活性較差，但該蛋白迄今仍相當神秘。迄今為止，還 沒有有關SlpA的物理-化學特性或可能的分子伴侶特性的信息，甚至 還沒有提到SlpA在大腸桿菌胞質中的功能。
在許多診斷應用中，重組產生的蛋白用作結合配偶體，例如在設 計用于檢測特異性免疫球蛋白分析物的免疫測定中用作抗原。這些抗 原可以作為融合蛋白含有的一部分生產，其構成目標部分或抗原性多 肽，旨在識別和結合在所研究的樣品或測定混合物中存在的特定部 分。重組產生的融合蛋白的另一部分為多肽部分，該部分融合至賦予 特異性的抗原性部分，以利于其克隆、表達、過度生產、折疊/重折疊 和純化，并利于增加其溶解性、其穩定性或其折疊可逆性。重組產生 的融合蛋白的合成在先有技術中已充分描述。還已充分確認的是，使 用分子伴侶作為融合蛋白的組成部分是有利的，該部分起輔助分子的 作用，用于靶多肽的表達、折疊、純化、溶解和增加整體穩定性。
美國專利號6,207,420公開了用于表達蛋白的融合蛋白系統，其 中靶多肽部分的氨基酸序列和融合肽部分來源于不同生物。最近，可 以表明FkpA和SlyD適合作為生產重組蛋白的融合組件。兩個分子伴 倡均增加其客戶蛋白在原核宿主中的表達率，支持正確的重折疊，并 增加甚至有極度聚集傾向的蛋白(如逆轉錄病毒跨膜蛋白)的整體溶解 性(Scholz等，2005, JMB 345, 1229-1241和WO 03/000877)。盡管FkpA和SlyD尤其適用于幫助有難度的或有聚集傾向的蛋 白在診斷試劑(更一般地講，生物技術應用)中采取和保持其天然結構， 但仍存在熱穩定性的難題。蛋白的天然構象通過范德華接觸、氫鍵、 鹽橋和疏水作用的細致平衡的網絡來穩定。優化這些接觸成為相應蛋 白的微環境，pH、離子強度或溫度的改變確實擾動折疊和去折疊分子 之間的平衡。溫度的增加尤其適合于變性蛋白，其常常導致完全或部 分去折疊的分子聚集。熱誘導的蛋白聚集和伴隨的功能喪失對任何蛋 白制品都構成嚴重問題。完全可以想到的是，在蛋白試劑或制品的不 恰當裝運或儲存過程中可能發生溫度升高，或者更一般地講，可能發 生熱應、激。
例如，分子伴侶融合組件如SlyD顯示于約42°C的溫度發生熱誘 導的去折疊，但是例如在用于轉運、裝運或儲存蛋白制品的容器中的 冷卻系統有缺陷時很容易超過42°C。就靶蛋白X高度疏水并完全依 賴于其融合配偶體的分子伴侶活性的情況而言，SlyD組件一去折疊， 完整的融合多肽就將聚集，并伴隨失去其溶解功能。換句話說，當X 為非常疏水并有聚集傾向的客戶蛋白時，SlyD的穩定性限制SlyD-X 融合多肽的整體穩定性。
含有FkpA的融合蛋白顯示出稍微增加的穩定性，這可能歸因于 二聚化FkpA載體組件的較高內在熱穩定性。大腸桿菌SlyD的解鏈溫 度已被確定為約42。C,而FkpA直至約50。C還相當穩定。然而，由 于在以下章節中概述的原因，仍極度需要提供具有高內在穩定性的替 代功能分子伴侶變體。
在雙抗原夾心(DAGS)形式的異質免疫測定中，例如，在測定的 任一側使用抗原的兩個變體。這些變體之一攜帶對固相具有高親和力 的標記，另一個攜帶發信號部分，以便產生信號輸出。這些抗原變體 中的每一個均可以融合輔助序列，即載體或融合組件。至少一個分子 伴倡(或功能性多肽結合域，即分子伴倡結構域)附著或融合至靶多肽， 促進折疊，增加穩定性和溶解性，并將靶多肽保持為適宜構象，以便要測定的抗體分析物可特異性識別并結合靶多肽。優選地，不同的分 子伴侶在免疫橋測定的任一側均用作融合配偶體，以便打破測定的固 有對稱性。在任一側(即在捕獲側和檢測側)含有不同載體或融合組件
但含有相同或相似的靶多肽的測定形式也可以被稱為不對稱的DAGS 形式。通過在DAGS測定的每一側使用不同的融合組件，可顯著降低 由于載體組件而發生免疫交叉反應的風險以及伴隨的錯誤高信號。
顯然，測定的整體穩定性受限于具有最低固有穩定性的免疫組 件。在不對稱DAGS中使用FkpA和SlyD作為融合配偶體時，SlyD 是限制整體穩定性的融合配偶體。因此，明顯需要發現其它分子伴倡， 其可在功能上完全替代SlyD,并固有地對熱應激更穩定。即便已描述 了大量來自嗜熱或超嗜熱生物的SlyD同源物，但對僅使用這些蛋白 作為融合配偶體作一個提示因為它們已對遠超過60。C的溫度進行 了進化和優化，所以它們具有極高的熱動力穩定性。因此，穩定和超 穩定的蛋白經常傾向于在環境溫度變成相當剛性的，即它們失去了柔 韌性，而柔韌性是動態結合靶分子的先決條件。被廣泛認可的是，蛋 白的穩定性僅可以在損害其柔韌性和功能這二者的情況下增加，這經 常阻止高穩定性蛋白于環境溫度的應用。因此，本發明的目標是由嗜 溫生物鑒定熱穩定的折疊輔助物。本發明的又一個目標是提供適于診 斷和生物技術應用的多肽，其具有增加的熱穩定性，并延長診斷試劑 和蛋白制品的保存期限。
據最近Kwon等人(BMB reports 2008, 41(2)， 108-11 l)的凈艮道，大 腸桿菌的一些蛋白于遠超出49°C的溫度是穩定且可溶的。通過SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定在暴露于提升的溫度時可溶的蛋白。用大腸 桿菌的超聲提取物于多個溫度溫育后進行研究。在已鑒定的17種熱 穩定蛋白中，6種蛋白原來是推定的折疊輔助物(GroEL、GroES、DnaK、 FkpA、觸發因子、EF-T)。值得注意的是，該實驗采用大腸桿菌的無 細胞裂解物，相應蛋白的溶解性^皮視為穩定性的唯一標準。
然而，在蛋白的溶解性和穩定性之間有顯著差異。在本領域眾所周知，蛋白的溶解性經常在最大穩定性的條件下達到最小值。例如， 蛋白的熱力學穩定性在緩沖溶液的pH與相應蛋白的pl —致時達到最 大值。然而，在這些特別條件下，蛋白溶解性達到最小值。另一個普
遍的實例是利用硫酸銨或其它氫鍵形成劑(cosmotropic agents)的蛋白 鹽析蛋白的溶解性在此也隨其穩定性增加而降低(硫酸銨是強氫鍵形 成劑，即其穩定蛋白結構)。
WO 2007/077008公開了重組產生的嵌合融合蛋白，其含有非人 分子伴倡如大腸桿菌SlyD的多肽結合區段，以及N-和C-末端融合至 該區段的人FKBP型肽基脯氨酰順/反異構酶。已公開了使用SlpA的 分子伴倡區段的類似融合多肽。
令人驚奇的是，SlpA,尤其是大腸桿菌SlpA，在用作融合配偶 體時能夠賦予其它靶多肽熱穩定性。如Hottenrott等人(出處同上)所才艮 道，SlpA是肽基脯氨酰順/反異構酶活性相當差的酶。出乎意料的是， SlpA也表現出顯著的分子伴侶特征，更令人驚奇的是，SlpA具有高 內在穩定性，并且賦予融合的靶多肽熱穩定性，由此使靶多肽對熱誘 導的聚集不敏感。而密切相關的SlyD僅表現出臨界穩定性，于約42。C 具有熱去折疊中點，SlpA至少到50。C仍保留其天然折疊，于約56°C 顯示出熱去折疊中點(定義為解鏈溫度)。在已知SlyD和SlpA (其代替 SlyD樣蛋白)之間的密切關系并已知二者均是得自嗜溫生物如大腸桿 菌的單體蛋白、具有49°C的最大生長溫度這一事實的情況下，這確 實令人費解。最令人驚奇的是，嗜溫生物大腸桿菌具有推定的折疊輔 助物，例如SlpA,其組合了突出的熱穩定性和分子伴倡特征。
發明概述
本發明涉及編碼含有SlpA分子伴侶和靶多肽的融合蛋白的重組 DNA分子、編碼所述融合蛋白的相應表達載體以及用所述表達載體轉 化的宿主細胞。本發明的另一方面是生產所述融合蛋白的方法以及含 有SlpA分子伴侶和靶多肽的重組產生的融合蛋白。本發明的又一方面是重組產生的融合蛋白作為結合配偶體(例如抗原、酶或重組校準物 質)或在免疫測定中用作降低干擾的工具的用途。此外，本發明涉及重 組產生的融合蛋白作為免疫原用于生產針對所述耙多肽的抗體的用 途，并涉及重組產生的融合蛋白在疫苗生產中的用途。又一方面是使 用重組產生的融合蛋白以及含有重組產生的融合蛋白的試劑盒在免 疫測定中檢測分析物的方法，所述重組產生的融合蛋白含有SlpA分 子伴侶和靶多肽。又一方面涉及SlpA在免疫測定中作為降低千擾和 交叉反應的工具的用途。本發明的又一方面是含有SlpA和耙蛋白的 可溶性功能復合物預期用于生物技術應用的用途，由此草巴蛋白可具有 治療或診斷價值。
附圖簡述
圖1:大腸桿菌的SlpA的近-UV CD光譜。用Jasco-720分光偏 振計在恒溫池架中于20。C記錄光鐠。在1 cm比色皿中的蛋白濃度為 417 ^M。緩沖液為50mM磷酸鉀pH7.5、 100mMKCl、 1 mM EDTA。 帶寬為2nm,分辨率為0.5nm，掃描速度為50nm/分鐘，響應為2s。 光譜記錄9次，并平均，以便改善信噪比。將信號轉變為平均殘基橢 圓率(以degcn^dmol"給出)。光譜指向天然樣折疊蛋白，信號最大值 位于262 nm。
圖2:大腸桿菌的SlyD的近-UV CD光鐠。用Jasco-720分光偏 振計在恒溫池架中于20。C記錄光譜。在1 cm比色皿中的蛋白濃度為 200 pM。緩沖液為50mM磷酸鉀pH7.5、 100mMKCl、 lmMEDTA。 帶寬為2nm，分辨率為0.5 nm,掃描速度為50nm/分鐘，響應為1 s。 光譜記錄9次，并平均，以便改善信噪比。將信號轉變為平均殘基橢 圓率(以deg cm2 dmor1給出)。SlyD的光譜與SlpA的光譜顯著不同。 其指向天然樣折疊的蛋白，信號最大值位于275nm。
圖3:據275 nm (SlyD)和262 nm (SlpA)的近UV CD監測的SlyD 和SlpA的熱誘導去折疊轉換。解鏈曲線標準化為天然分子的百分率。SlyD和SlpA的去折疊是完全可逆的，當樣品神皮冷卻至環境溫度時， 在熱轉換后天然分子的近-UV CD信號可被完全恢復。解鏈溫度(即 50%的分子折疊和50%去折疊的溫度)對SlyD為42°C，對SlpA為 56。C。圖3清晰揭示了 SlpA的優良熱穩定性。
圖4: SlpA-gp41融合蛋白的近-UV CD光譜。用Jasco-720分光 偏振計在恒溫池架中于20。C記錄光譜。在1 cm比色皿中的蛋白濃度 為18.7 pM。緩沖液為50 mM磷酸鉀(pH 7.5)、 100 mM KC1、 1 mM EDTA。帶寬為2.0nm，分辨率為0.5 nm，掃描速度為50 nm/分鐘， 響應為2s。光譜記錄9次，并平均，以便改善信噪比。將信號轉變為 平均歹植橢圓率(以deg cm2 dmol"給出)。光錯指向天然樣折疊的蛋白。 于293的信號最小值指示天然樣折疊的gp41胞外域片段，該片段富 含色氨酸殘基，并吸收280 nm以上的光。290 nm左右的特征明確地 指向SlpA-gp41融合多肽中天然樣4斤疊的gp41部分。
圖5: SlyD-gp41融合蛋白的近-UV CD光譜。用Jasco-720分光 偏振計在恒溫池架中于20。C記錄光譜。在1 cm比色皿中的蛋白濃度 為14.4 pM。緩沖液為50 mM磷酸鉀(pH 7.5)、 100 mM KC1、 1 mM EDTA。帶寬為2.0nm，分辨率為0.5 nm，掃描速度為50 nm/分鐘， 響應為2s。光譜記錄9次，并平均，以便改善信噪比。將信號轉變為 平均殘基橢圓率(以degcn^dmol"給出)。于293的信號最小值指示天 然樣折疊的gp41胞外域片段，該片段富含色氨酸殘基，并吸收280 nm 以上的光。290nm左右的特征強烈指向SlyD-gp41融合多肽中天然樣 折疊的gp41部分。
圖6 A/B:通過270 nm的圓二色性信號的降低監測SlyD-gp41 (A) 和SlpA-gp41 (B)的熱誘導去折疊。對應的分子伴倡融合配偶體的去折 疊伴隨著其溶解能力的喪失，并導致極為疏水的gp41部分的自發聚 集。對于SlyD-gp41,聚集于約40。C發生，對于SlpA-gp41,聚集于 約56。C發生。橢圓率以毫度(mdeg)給出，超過其發生(不可逆)聚集的 臨界溫度限以虛線突出顯示。圖7:通過280nm的近-UVCD監測的SlyD-gGl (26-189)的熱誘_ 導去折疊轉換。作為溫度函數的融合蛋白的橢圓率以毫度(mdeg)給出。 SlyD-gGl (26-189)的去折疊大部分是可逆的，當樣品被冷卻至環境溫 度時，天然融合多肽的近-UVCD信號大部分恢復。SlyD-gGl (26-189) 的解鏈溫度(即50。/。的分子折疊和50。/o去折疊的溫度)接近53。C。
圖8:通過220 nm的遠-UV CD監測的SlpA-gGl (26-189)的熱i秀 導去折疊轉換。作為溫度函數的融合蛋白的橢圓率以毫度(mdeg)給出。 SlpA-gGl (26-189)的去折疊大部分是可逆的，當樣品被冷卻至室溫時， 天然融合多肽的遠-UV CD信號大部分恢復。SlpA-gGl (26-189)的解 鏈溫度(即50%的分子折疊和50。/。去折疊的溫度)接近63。C。這清楚闡 明了 SlpA-gGl (26-189)與SlyD-gGl (26-189)相比時的優良熱穩定性。
圖9:在自動化Elecsys㊣分析儀中SlpA-gGl (26-189)和SlyD-gGl (26-189)與人抗-HSV-l陽性血清和抗-HSV-l陰性血清的免疫反應性， 如在實施例4中所述。表1顯示了在苛刻的60。C過夜熱處理之前和 之后兩種抗原變體的效力。實驗結果清楚表明了熱應激的SlpA-gGl (26-189)以雙重方式超越熱應激的SlyD-gGl (26-189)的優越性。首先， 采用抗-HSV-l陽性血清的信號回收率(表l的上半部分)對于熱應激的 SlpA融合多肽顯著較高。其次，采用抗-HSV-l陰性血清的背景信號 增加(表1的下半部分)對于熱應激的SlpA融合多肽顯著較低。兩種作 用均改善免疫測定的信號動力.學，突顯了 SlpA作為賦予穩定性和溶 解性的融合配偶體對有難度的靶蛋白的優勢。因此，免疫測定的靈敏 度可通過使用SlpA代替密切相關的SlyD作為融合配偶體來保證。
序列表簡述
SEQ IDNO. 1顯示了大腸桿菌SlpA的完整氨基酸序列(149個氨 基酸)，由SwissProt數據庫登錄號POAEMO得到
MSESVQSNSA VIjVHFTIiKIiD DGTTAESTRN NGKPALFRIiG DASLSEGLEQ HI^GLKVGDK TTFSLEPDAA FGVPSPDLIQ YFSRREFMDA GEPEIGAIML FTAMDGSEMP GVIRE工NGDS ITVDFNHPLA GQTVHFDIEV LEIDPALEA
11SEQ ID NO. 2顯示了如在實施例章節中使用的大腸桿菌SlpA的 氨基酸序列(氨基酸絲氨酸2至谷氨酸148)。在大腸桿菌中協同翻譯除 去N-末端甲硫氨酸。為利于克隆，C-末端丙氨酸也已被除去。此外， 已加入C-末端六組氨酸標簽，以利于蛋白的純化和重折疊
SESVQSNSAV LiVHFTIiKIiDD GTTAESTRNN GKPALFRLGD ASLSEGLEQH l^GLKVGDKT TFSLEPDAAF GVPSPDLIQY FSRREFMDAG EPEIGAIMLF TAMDGSEMPG VIREINGDSI TVDFNHPLAG GTVHFDIEVL EIDPALEHHH HHH
SEQ ID NO. 3顯示了大腸桿菌SlpA-gp41的氨基酸序列。gp41 部分含有HIV 1 gp41的氨基酸536-681, SlpA部分含有氨基酸1-146。 該序列帶有已加入的C-末端六組氨酸標簽，以利于融合蛋白的純化和 重折疊。
MSESVQSNSA VI/ZHFTLKLD DGTTAESTRN NGKPAIjFRLG DASLSEGIiEQ HLLGIiKVGDK TTFSLEPDAA FGVPSPDLIQ YFSRREFMDA GEPEIGAIML FTAMDGSEMP GVIREINGDS ITVDFNHPLA GGTVHFDIEV LE工DPAGGGS GGGSGGGSGG GSGGGSGGGT LTVQARGIjIjS GIVQQQNNEL RAIEAQQHLE QI/TWGTKQIj QARELAVERY LKDQQLIiGIW GCSGKLICTT AVPWNASWSN KSLEQIWNNM TWMEWDREIN NYTSLIHSLI EESQNQQEKN EQELLELDKW ASLWNWFNIT NWLWYLE冊H HHH
SEQ ID NO. 4顯示了大腸桿菌SlpA-SlpA-gp41的M酸序列。 兩個SlpA單元連接至fflVgp41胞外域，構成了有強烈聚集傾向的靶 多肽。第一個SlpA單元含有氨基酸1-146，第二個SlpA單元含有氨 基酸2-149 (就功能性和穩定性而言兩個SlpA變體完全等同)。已加入 C-末端六組氨酸標簽，以利于融合蛋白的純化和重折疊。
MSESVQSNSAVIjVHFTIiKLiDDGTTAESTRNngkpalfr:lgDASLSEGLEGHLLGIiKVGDK
TTFSLEPDAAFGVPSPDIiIGYFSRREFMDAGEPEIGA工MIiFTAMDGSEMPGVIREINGDS
工TVDFNHPLAGQTVHFDIEVLEIDPAGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSESVQSNSAVL
VHFTIiKIiDDGTTAESTRNNGKPALFRLiGDASLSEGLE^HIiLGLKVGDKTTFSIjEPDAAFG
VPSPDIjIGYFSRREFMDAGEPE工GAIMLFTAMDGSEMPGVIREINGDSITVDFNHPLAGG
TVHFDIEVLE工DPALEAGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSG工VQQQNNE
IjRAI eaqqhlEQI/TVWGTKQARELAVERYIiKDQQLIiGIWGCSGKIiICTTAVPWNASWS
NKSLEQ工麗NMT麗EWDREINNYTSLIHSL工EESQNQQEKWASLW麗FNI
TNWIiWYLEHHHHHH
SEQ ID NO. 5顯示了大腸桿菌SlyD-gp41的氨基酸序列。已加入C-末端六組氨酸標簽，以利于蛋白的純化和體外重折疊。
MKVAKDLWS LAYQVRTEDG VLVDESPVSA PLDYIjHGHGS LISGLETAIiE GHEVGDKFDV AVGANDAYGQ YDENIjVQRVP KDVFMGVDEIi QVGMRFLAET DQGPVPVEIT AVEDDHWVD GNHMLAGQ肌KFNVEWAIR kATEEELAHG HVHGAHDHHH DHDHDGGGSG GGSGGGSGGG SGGGSGGGTL WQARQIXSG IVQQQNNELR AIEAQQHLEQ I/TWGTKQLQ ARELAVERYL GIWG CSGKLICTTA VPWNASWSNK SLEQI麗腿T麗EWDREINN YTSLIHSLIE ESQNQQEKNE QELLELDKWA SLWNWFNITN WLWYLEHHHH HH
SEQ ID NO. 6顯示了大腸桿菌SlyD-SlyD-gp41的氨基酸序列。 兩個SlyD單元融合至把多肽gp41。已加入C-末端六組氨酸標簽，以 利于蛋白的純化和體外重折疊。
MKVAKDLWS LAYQVRTEDG VLVDESPVSA PLDYLHGHGS LISGLETALE GHEVGDKFDV AVGANDAYGQ YDENLVQRVP KDVFMGVDEL QVGMRFLAET DQGPVPVEIT AVEDDHVWD GNHMLAGQN!L KFNVEWAIR EATEEELAHG HVHGAHDHHH DHDHDGGGSG GGSGGGSGGG SGGGSGGGKV AKDLWSLAY QVRTEDGVLV DESPVSAPLD YIjHGHGSIjIS GLETALEGHE VGDKFDVAVG ANDAYGQYDE NLVQRVPKDV FMGVDELQVG MRFLAETDQG PVPVEITAVE DDHVWDGNH MLAGQNLKFN VEWAIREAT EEELAHGHVH GAHDHHHDHD HDGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGT!LTVQ ARQLLSGIVQ QQNNEIiRAIE AQQHLEQLTV WGTKQ!LQARE LAVERYLKDQ QLLG工WGCSG KLICTTAVPW NASWSNKSLE QI柳麗T麗E WDREINNYTS LIHSLIEESQ NQQEKNEQEL LELDKWASLW NWFNIT麗LW YHGHDHDHDH HHHHH
SEQ ID NO. 7顯示了融合多肽SlpA-gGl的^&酸序列。1個SlpA 單元融合至靶多肽gGl，該靶多肽gGl含有如在實施例4中使用的人 單純皰滲病毒HSV-1抗原gGl的氨基酸26-189。
MSESVQSNSA VLVHFTIjKLD DGTTAESTRN NGKPAIjFRIjG DASLSEGIjEQ HLLGIjKVGDK TTFSLEPDAA FGVPSPDIjIQ YFSRREFMDA GEPEIGAIMIj ftamdgsemp gvireingds ITVDFNHPLA GQTVHFDIEV LEIDPALEGG GSGGGSGGGS GGGSGGGSGG GPTNVSSTTQ P,TTGRPS HEAPNMTQTG TTDSPTAISL TTPDHTPPMP SIG!LEEEEEE EGAGDGEHLE GGDGTRDTLP QSPGPAFPLA EDVEKDKPNR PWPSPDPNN SPARPETSRP KTPPTIIGPL ATRPTTRLTS KGRPLVPTPQ HTPLFSFLTA SPALDLEHHH H冊
SEQ ID NO. 8顯示了融合多肽SlyD-gGl的氛基酸序列。1個SlyD 單元融合至靶多肽gGl ，該靶多肽gGl含有如在實施例4中使用的人 單純皰滲病毒HSV-1抗原gGl的氨基酸26-189。
MKVAKDLWS LAYWRTEDG VLVDESPVSA PliDYLHGHGS LISGLETALE GHEVGDKFDV AVGANDAYGQ YDENLVQRVP KDVFMGVDEL QVGMRFLAET DQGPVPVEIT AVEDDHVWD GNHMLAGG肌KFNVEWAIR EATEEELAHG HVHGAHDHHH DHDHDGGGSG GGSGGGSGGGSGGGSGGGPT NVSSTTQP" QTTGRPSHEA PNMTQTGTTD SPTAISLTTP DHTPPMPSIG LEEEEEEEGA GDGEHLEGGD GTRDTLPQSP GPAFPLAEDV EKDKPNRPW PSPDPNNSPA RPETSRPKTP PTIIGPLATR PTTRI/TSKGR PLVPTPQHTP LFSFI/TASPA LDIiEHHHHHH
SEQ ID NO. 9顯示了依據Swiss Prot ID: Q9CKP2的多殺巴斯德
桿菌(Pcwfewre〃a ww/focWa) SlyD (全長)的#^酸序列。
MKIAKNVWS工AYQVRTEDG VLVDEAPVNQ PLEYLQGHNN LVIGLENALE GKAVGDKFEV
RVKPEEAYGE YNENMVQRVP KDVFQGVDEL WGMRFIADT DIGPLPWIT EVAENDVWD
GNHMLAGQEL LFSVEWATR EAT!LEEIAHG HIHQEGGCCG GHHHDSDEEG HGCGCGSHHH
HEHEHHAHDG CCGNGGCKH
SEQ ID NO. IO顯示了 C-末端截短的、無半胱氨酸的多殺巴斯德 桿菌SlyD變體的氨基酸序列，其優選在雙抗原夾心免疫測定中用作 融合蛋白的分子伴侶單元(PmS SlyD 1-156):
MKIAKNVWS IAYQVRTEDG VLVDEAPVNQ PLEYLQGHNN LVIGLENALE GKAVGDKFEV RVKPEEAYGE YNENMVQRVP KDVFGGVDEL WGMRFIADT DIGPLPWIT EVAENDVWD GNHMLAGQEL LFSVEWATR EATLEEIAHG HIHQEG
SEQ ID NO. 11顯示了依據Swiss Prot ID: P45523的大腸桿菌 FkpA (全長)的氛基酸序列
MKSLFKVTL:L ATTMAVMiHA PITFAAEAAK ENSLKEQEKL GIKLDKDQLI AGVQDAFADK AADNEAKGKE YREKFAKEKG VKTSSTGLVY FDNSYTRGEP LSFRLDGVIP GWTEGLKNIK FDVELLDVKP APKADAKPEA DAKAADSAKK
SEQ ID NO. 12顯示了大腸桿菌FkpA的氨基酸序列部分，其優 選在雙抗原夾心免疫測定中用作融合蛋白的分子伴侶單元。該序列沒 有N-末端信號序列(氨基酸殘基1-25)，并基本上對應于成熟FkpA (TkoA 26-270):
AEAAKPATAA DSKAAFKNDD QKSAYALGAS LGRYMENSLK EQEKLGIKLD KDQLIAGVQD AFADKSKLSD QEIEQTLQAF EARVKSSAQA KMEKDAADNE AKGKEYREKF AKEKGVKTSS TGLVYQWEA GKGEAPKDSD TVWNYKGTL IDGKEFDNSY TRGEPIiSFRL DGVIPGWTEG LKNIKKGGKI KKVIPPELAY GKAGVPGIPP NSTLVFDVEL LDVKPAPKAD AKPEADAKAA DSAKK
SEQ ID NO. 13顯示了 EB病毒核抗原1 (EBV核抗原1或EBNA-l) 401-641位的氨基酸序列，(EBV = HHV-4 =人皰滲病毒4);毒林B95-8。 EBNA-l的完整氨基酸序列由641個殘基組成，可按照Swiss Prot ID
PATAADSKAA FKNDDGKSAY ALGASLGRYM SKLSDQEIEQ TLQAFEARVK SSAQAKMEKD QWEAGKGEA PKDSDTWVN YKGTLIDGKE KGGKIKIiVIP PELAYGKAGV PGIPPNSTLVP03211得到。天然半胱氨酸殘基對于EBNA-1的抗原性不是必要的， 已被改變為丙氨酸(標下劃線的)，以便簡化純化過程和增加天然樣折 疊的溶解性蛋白的收率。
GRRPFFHPVG EADYFEYHQE GGPDGEPDVP PGAIEQGPAD DPGEGPSTGP RGQGDGGRRK KGGWFGKHRG QGGSNPKFEN IAEGLRALLA RSHVERTTDE GTWAGVFVY GGSKTSLY肌 RRGTALAIPQ ^RLTPIjSRIjP FGMAPGPGPQ PGPIiRESIV^ YFMVFLQTHI FAEVLKDAIK DIA/MTKPAPT ^NIRVTV^SF DDGVDLPPWF PPMVEGAAAE GDDGDDGDEG GDGDEGEEGQ E
SEQ ID NO. 14顯示了依據Swiss Prot ID P14348的EB病毒蛋白 p18的氨基酸序列的氨基酸1-176 (可讀框BFRF3， HHV-4/B95-8)。在 氨基酸位56的天然半胱氨酸殘基對于EBV p18的抗原性不是必要的， 已被改變為丙氨酸(標下劃線的)，以便筒化純化過程和增加天然樣折 疊的溶解性蛋白的收率。
MARRLPKPTL QGRLEADFPD SPLLPKFQEL NQNNLPNDVF REAQRSYLVF LTSQF5YEEY VQRTFGVPRR QRAIDKRQRA SVAGAGAHAH LGGSSATPVQ QAQAAASAGT GALASSAPST AVAQSATPSV SSSISSLRAA TSGATAAASA AAAVDTGSGG GGQPHDTAPR GARKKQ
SEQ ID NO. 15顯示了依據Swiss Prot ID P14348的EB病毒蛋白 p18的C-末端部分的氨基酸序列的氨基酸105-176 (可讀框BFRF3, HHV誦4/B95誦8)。
AASAGTGALA SSAPSTAVAQ SATPSVSSSI SSLRAATSGA TAAASAAAAV DTGSGGGGQP HDTAPRGARK KQ
SEQ ID NO. 16顯示了依據Swiss Prot ID P03197的EB病毒蛋白 p23的氨基酸序列的氨基酸1-162 (可讀框BLRF2， HHV-4/B95-8)。在 氨基酸位46的天然半胱氨酸對于EBV p23的抗原性不是必要的，已 被改變為丙氨酸(標下劃線的)，以便簡化純化過程和增加天然樣折疊 的溶解性蛋白的收率。
msaprkvrlp svkavdmsme dmaarlarle senka闊qv lrgga^asst svpsapvppp ep!jTarqrev m工tqatgrla sqamkkiedk vrksvdgvtt rnemen工，ltlriqvsml gakgqpspge gtrpresndp natrrarsrs rgreakkvqi sd
SEQ ID NO. 17顯示了如在實施例1中使用和顯示的富含甘氨酸 的接頭肽序列L=(GGGS)5GGG，用于克隆含有SlpA和靶多肽的表達
GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS GGG
15發明詳述
本發明的一個方面是編碼融合蛋白的重組DNA分子，其含有有 效連接的至少一個編碼靶多肽的核苦酸序列，以及該核苷酸序列上游 或下游的至少一個編碼SlpA分子伴估單元的核香酸序列。
術語"重組DNA分子"是指通過組合兩個分開的序列區段得到 的DNA分子，所述組合通過基因工程技術或化學合成人工操作分離 的多核苷酸區段來完成。這樣做，人們可以將具有所需功能的多核苦 酸區段連接在一起，從而產生所需的功能組合。
多核苷酸序列在它們彼此處于功能關系時是有效連接的。例如， 如果啟動子控制編碼序列的轉錄或表達，則啟動子有效連接至編碼序 列。 一般而言，有效連接指連接的序列是連續的，在必須連接兩個蛋 白編碼區的情況下，二者是連續的并在可讀框內。然而，眾所周知的 是，某些遺傳元件，如增強子，即使相隔一定距離時--即縱使不連續， 也可以有效連接。
術語"上游"和"下游"是功能上的定義，是指編碼核普酸序列 鏈的方向或極性。"上游"方向意指核普酸位于給定多核苷酸序列的 5'方向，即朝向起始核苷酸。就氨基酸序列而言，術語"上游"釋為/ 指位于N-末端方向的氨基酸，即朝向多肽鏈的起始處。優選地，編碼 SlpA分子伴倡單元的核香酸序列位于編碼耙多肽的核香酸序列的上 游。
"下游"方向是指核苷酸位于多核普酸的3，方向，即朝向核苷酸 序列的末端。就氨基酸序列而言，術語"下游"解釋為位于C-末端方 向的氛基酸，即朝向多肽鏈的末端。
多核苷酸4皮說成"編碼"多肽，多核苷酸在其天然狀態下或通過 本領域已知的方法操作時，可被轉錄為核苦酸才莫板和/或被翻譯，以產 生多肽或其片段。
本發明的另一方面是含有有效連接的重組DNA分子的表達載 體，該重組DNA分子含有至少一個編碼靶多肽的核苷酸序列，以及該核苷酸序列的上游或下游的至少一個編碼SlpA分子伴倡的核香酸 序列。
制備用于導入到宿主中的DNA構建體通常含有宿主識別的復制 系統，包括編碼所需靶融合肽的預期DNA片段，優選還包括與多肽 編碼區段有效連接的轉錄和翻譯起始調節序列。表達系統(表達載體) 可以包括例如復制起點或自主復制序列(ARS)和表達控制序列、啟動 子、增強子和必需的加工信息位點，例如核糖體結合位點、RNA剪接 位點、聚腺苷酸化位點、轉錄終止序列和mRNA穩定序列。
選擇適宜的啟動子和其它必需的載體序列，以便在宿主中有功 能。許多在細菌、酵母、哺乳動物、昆蟲、植物或其它細胞中有用的 表達載體是本領域已知的，并市售可得。另外，可將構建體連接至可 擴增的基因，以便可以獲得該基因的多個拷貝。
表達和克隆載體有可能含有選擇標記，其為編碼對載體轉化的宿 主細胞的存活和生長所必需的蛋白的基因，盡管這樣的標記基因可在 另一個共導入宿主細胞中的多核苷酸序列上攜帶。在選擇性條件下只 有表達標記基因的那些宿主細胞才存活和/或生長。典型的選擇基因包 括但不限于編碼以下蛋白的那些基因(a)賦予對抗生素或其它毒素物 質(例如氨芐青霉素、四環素等)的抗性的蛋白；(b)補充營養缺陷的蛋 白；或(c)提供由復合培養基無法獲得的關鍵營養物的蛋白。適宜的選 擇標記的選擇取決于宿主細胞，用于不同宿主的適宜標記是本領域已 知的。
可通過本領域已知的任何方法將含有目標多核苷酸的載體導入 到宿主細胞中。這些方法隨對應宿主系統的類型變化，包括但不限于 使用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖、其它物質轉染，以及 通過病毒感染。本發明的大量多核苦酸和多肽可通過在相適的宿主細 胞中的載體或其它表達載體中表達本發明的多核苦酸來制備。最常用 的原核宿主為大腸桿菌菌林，盡管還可以使用其它原核生物，例如枯
草芽孑包桿菌(Bac/〃iA 5^"http://力。在大腸桿菌中表達代表了實施本發明的優選模式。表達含有至少
一個SlpA單元和至少一個靶多肽X單元的融合蛋白，或者，共表達 SlpA和X，以產生可溶性SlpA-X復合物，無論SlpA和X是否共價 連接，這在原核以及在真核宿主細胞中均是可行的。
使用常規的連接技術構建依據本發明的載體。切割、修整分離的 質粒或DNA片段，并以產生所需質粒需要的形式再連接。如有需要， 以已知方式進行分析，以證實在構建質粒中的正確序列。適用于構建 表達載體、制備體外轉錄物、將DNA導入宿主細胞中以及進行分析 來評價表達和功能的方法是本領域技術人員已知的。可直接檢測樣品 中的基因存在情況、擴增和/或表達，例如通過常規的DNA印跡、定 量mRNA的轉錄的RNA印跡、點印跡(DNA或RNA分析)或使用可 基于本文提供的序列的適宜標記探針進行的原位雜交。如果需要，本 領域的技術人員很容易設想如何修改這些方法。
本發明的又一個實施方案為用含有有效連接的重組DNA分子的 表達載體轉化的宿主細胞，所述重組DNA分子含有至少一個編碼靶 多肽的核普酸序列，以及在該核苷酸序列上游或下游的至少一個編碼 SlpA分子伴侶的核普酸序列。
本發明的另一個實施方案涉及在原核或真核宿主中共表達SlpA 和耙多肽的方法，由此過量生產的SlpA與耙多肽相互作用，并形成 可溶性非共價復合物，該復合物有利于制備天然樣折疊的且有活性的
靶多肽。這意味著編碼SlpA的DNA序列和耙多肽可位于同 一載體上， 并由相同或不同的啟動子控制。或者，編碼SlpA和耙多肽的DNA分 子可位于不同的相適載體上。為了同時表達SlpA和靶多肽，用兩種 載體轉化宿主細胞。優選地，編碼耙蛋白和SlpA的基因由響應于不 同誘導物的不同啟動子控制。因此，可以采用受控或限定的方式同時 或連續進行SlpA和靶蛋白的誘導。例如，可首先誘導SlpA表達，以 產生基礎水平的功能性分子伴侶，隨后可進行靶基因的誘導。暫且不 談此隨后的方案，同時誘導折疊輔助物和靶多肽是可行的，同樣可以
18產生溶解性和功能性的靶蛋白。編碼SlpA和靶蛋白的基因可位于相 同或不同載體上。
術語"融合蛋白"是指兩個分開或獨立的多肽功能性地組合在一 條多肽鏈上。融合蛋白的單個元件，即SlpA分子伴侶部分和靶多肽
部分(也稱為靶多肽X),可彼此直接鄰接。可選地，它們被1-100個 氨基酸殘基、優選5-30個氨基酸殘基、最優選約20個氨基酸殘基的 肽接頭分隔。技術人員會認識到，這樣的接頭多肽^皮設計為對預期用 途最適合的，尤其是就長度、柔性、電荷和親水性而言。接頭多肽序 列還可以包含蛋白水解切割位點。可選地，融合蛋白還可以包含信號 肽序列，用于將蛋白靶向其中應發生折疊的目標區室。
按照本發明，1個以上的靶多肽X，例如2、 3或4個拷貝的耙多 肽，可以為融合蛋白的組成部分。作為實例，SlpA-X2指1個SlpA單 元融合至2個X型的靶多肽單元。單個靶多肽單元可由或可不由接頭 多肽區段分隔。融合蛋白包含至少一個SlpA分子伴倡單元。串聯、 三重或更高的組合也可以構成融合蛋白，例如SlpA-SlpA-X或 SlpA-SlpA-SlpA-X。其中靶多肽夾在至少兩個分子伴倡單元之間的融 合蛋白也是本發明的 一 部分，例如 SlpA-X-SlpA或 SlpA曙SlpA-X-SlpA誦SlpA。
SlpA是FKBP家族的推定肽基脯氨酰順/反異構酶。按照 SwissProt登錄號P0AEM0公開的大腸桿菌SlpA氨基酸序列示于SEQ ID NO. 1。
按照本發明，術語"編碼SlpA分子伴倡的核苷酸序列"是指編 碼含有SlpA的多肽結合區段的多肽片段的核苷酸序列。術語分子伴 侶的"多肽結合區段"表示分子伴侶的結合感受態部分，即結合并保 持客戶或底物多肽鏈并因此與其螯合的部分，以降低有聚集傾向的折 疊中間體的濃度，并利于以后的折疊。SlpA的"多肽結合區段，，還可 以被命名為IF結構域(在flap結構域中插入)。定義為自發折疊單元的 蛋白結構域能夠在適宜的重折疊條件下在水性溶液中采取天然樣的穩定折疊。術語"多肽結合區段"、"IF-環"、IF-結構域或分子伴侶
結構域可同義使用。
依據本發明的"SlpA"或"SlpA分子伴侶"或"SlpA單元，，包 括SlpA的多肽結合區段或IF結構域。優選地，大腸桿菌SlpA的完 整分子用作融合配偶體。或者，SlpAIF結構域可以用作融合配偶體。 其至少含有如下的片段N-末端起始于SEQ ID NO. 2的第59-78個氨 基酸之間的任何氨基酸，C-末端終止于SEQ ID NO. 2的第125-139個 氨基酸之間的任何氨基酸。最優選的是編碼N-末端起始于SEQ ID NO. 2的第72個氨基酸(纈氨酸72)和C-末端終止于SEQ ID NO. 2的第 132個氨基酸(蘇氨酸132)的多肽的序列。按照本發明，SlpA是指該 分子伴侶的成熟的非人源化形式。這意味著SlpA分子伴倡既不包含 FKBP12或任何其它人FKBP的N-末端側翼序列，也不包含其C-末端 側翼序列。
依據本發明，來自其它生物的SlpA分子伴侶同源物可以與具有 分子伴侶活性的脯氨酰異構酶組合用作折疊輔助物。這樣的SlpA同 源物可起源于以下的生物(Swiss Prot數據庫ID號在括號中顯示)福 氏志賀菌(幼/ge〃a_/7e;c"w0(Prot.ID. P0AEM3)、宋內氏志賀菌(幼!'ge〃a w朋"')(Prot.ID Q3Z5Y2)、痢疾志賀菌(57 /ge〃a <a^e"^n'are)(Prot ID Q32K69)、柯氏檸檬酸桿菌(C"ra6artw ^Toym)(Prot.ID A8ALT4)、傷 寒沙門氏菌(& /附o"e/to 0^")(Prot.IDQ8XG79)、鼠傷寒沙門氏菌 (Sa/mo"e〃a i>p/n>nimMw)(Prot.ID Q7CR92)、曱型和乙型副傷寒沙門氏 菌(& /mo"e〃aparaO^/^')(Prot.ID Q5PKI5和A9MYG7)、豬霍亂沙門氏 菌(Sa/wowe〃a c/2o/era^w^)(Prot.ID Q57TL3)、肺炎克雷伯菌(K/eh!'e〃a /wewwom.ae)(Q9RF46)、 亞利桑那沙門氏菌(Sa/wo"e〃a ahzcwae)(Prot.ID A9MR44)、 腸桿菌屬(五"&roZ^"er 5p.)(Prot.ID A4W6E3)、阪崎腸桿菌(五"feraZ ac^r sa^^ah7)(A7MIMl)、變形斑沙 雷氏菌(Serra"a / rato3fmacw/a"s)(Prot.ID A8G9L6)、鼠疫耶爾森氏菌 (JeraZ"/a ; ^to)(Prot.ID Q8CZP4或Q0WJI9)、 4i結核耶爾森氏菌(7erazma /wewcfotoZ)en:w/cw;y)(Prot.ID A7FMD5)、 耶爾森氏腸桿菌 (Jeraz'm'a OT&ra/"/ca)(AlJJE3)、 胡蘿卜軟腐歐文氏菌(￡>vWm'a caratovora)(Prot.ID Q6D0C5)、 發光光桿狀菌(尸/20foraZ)血s /w肌力escem)(Prot.ID Q7N8X0)、 S。(ia/^ g/c^/w'^w (Prot.ID Q2NVY4)、 A/z'oma〃'"a 6a/"ca (Prot.ID A3WMS1) 、 口合維氏弧菌(W力n'o /wrv^0(Prot.ID A6ATG3 或 A7MTD8)、 創傷弧菌(F,力no vw/m》cw力(Prot.ID Q7MNM6 或 Q8DES9)、 坎氏弧菌(P76〃'o cam/7&〃,'/)(Prot.ID A8T7R0)、 K力r/0 A〃cw7 (Prot.ID A6D8Q3)、杣爛 弧菌一e"c^/w》(Prot.ID A3UXQ8) 、 W纖a"'"a /0/A/潔/s (Prot.ID Q5QZR6)、溶藻弧菌(7,力"o a/g/"o(y"cw力(Prot.ID Q1V5T9)、 殺鮭氣單胞菌(Jeromo"ay M/momc,'da)(Prot.ID A4SIX7)、發光桿菌屬 (尸/ oto^rfen.wwsp.)(Q2C7Vl)、 副 溶血弧 菌 (P%n.o / ara/wemo(y"o^)(Prot.ID Q87S88 或 A6B565)、々￡另'J單胞菌 (i^ewcfoa/ferowowos1 <^/aw〃ca)(Prot.ID Q15R06)、 霍舌L 瓜菌(Fz力ho cAo/erae)(Prot.ID A5F8X4，或Q9KU45，或A6Y5H7，或A6XZU4， 或A6ADB4，或A6A5W5，或A3H4C9,或A3GPA9，或A3EG01, 或A2PSS5，或A2P8T9，或A1F6Q8)、嗜水氣單胞菌04erowo"w / ;^ra/ / 〃a)(Prot.ID A0KG41)、 K/6no a"gwWww (Prot.ID Q1ZMQ4)、南 極細菌屬(A/on化〃a s/7.)(ProtlD A6FG75)、 交替假單胞菌 (P<sew(ioa/fen9wow<2S" / a/o/ /a""/力(Prot.ID Q3正A0) 、 j/^eromowo^a/es 6cr"en'wm (Prot.ID A0Y1B2)、 尸syc/^omowos z>igra/2aw// (Prot.ID A1SZP1)、費歇爾狐菌(7,力n'o力sc/2m')(Prot.ID Q5E7N2或A9IPH0)、 尸/20to6ac&"'ww / ro/w"<iww (Prot.ID Q1Z378 或 Q6LUK9)、 尸"wcfoatera歸W(xy 化m'c她 (Prot.ID A4C627)、 尸，/2ramo/ os (Prot.ID Q1ZHS3)、(Prot.ID A4BJL0)、 P%no /wyc/jraeo^^ (Prot.ID Q486T8)、幼ew朋e〃a awazowewk (Prot.ID A1S427)、希瓦氏 菌屬(幼ewa"e〃a ^.)(Prot.ID Q0HFZ1或Q0HS84或A0KZY9)、 幼e麗we//(3 pea/e朋a (Prot.ID A8H1H5)、 幼e而we〃a /n'gW廳"'wor(Prot.ID Q07Z37)、幼ew朋e〃a Am'^/k""s (Prot.DD Q12KM6)、 幼ewa"e〃a (Prot.ID A3QBX4)和腐敗希瓦氏菌(幼ewa"e〃a
/ 旨e/a"'卿)(Prot.ID A4Y4A6)。
按照本發明，SlpA分子伴侶序列可通過氨基酸取代(優選同源取 代)、缺失和插入來修飾，前提是保持SlpA分子伴侶的整體結構、功 能和穩定性。通過確定所研究的含有靶多肽和SlpA分子伴倡序列的 融合蛋白的解鏈溫度，可易于測試該SlpA變體的功能保持。解鏈溫 度定義為50%的分子折疊和50%去折疊的溫度，即解鏈溫度確定了在 給定的緩沖體系中于給定的蛋白濃度熱誘導去折疊轉換的中點。根據 芳香族殘基的含量，可通過簡單的光鐠探針如UV吸光度、焚光或圓 二色性監測蛋白的解鏈。具體地說，圓二色性完全適合監測蛋白的二 級結構(酰胺CD或遠-UV CD)或三級結構(芳香族CD或近-UV CD)的 構象變化。
通過近-UV CD評價的熱誘導SlpA去折疊揭示，去折疊過程是完 全可逆的，即在樣品由95°C冷卻降至環境溫度后，即降至15-25。C 后，SlpA自發地再采取其天然構象。這種折疊和去折疊的可逆性在生 物技術應用中是理想的折疊輔助物的必要前提條件通常，當重組融 合蛋白嚴重過度生產時，它們在大腸桿菌胞質中作為包涵體累積。在 此情況下，必須精心設計強力有效的復性方案，以在7.0M氯化胍或 其它離液劑如尿素中裂解的細菌細胞或包涵體開始。不言而喻的是， 任何分子伴侶融合配偶體的重折疊必需足夠強力、有效和可逆，以便 幫助目標客戶蛋白的體外重折疊。在先有技術中已知的許多融合配偶 體，例如NusA、 MBP (麥芽糖結合蛋白)和GST (谷胱甘肽-S-轉移酶)， 在宿主細胞中翻譯時表現出非常強的從頭折疊，但它們在熱誘導或化 學誘導的去折疊后不易被重折疊。因此，為了在宿主系統中溶解性表 達靶蛋白而使用這些融合配偶體。當它們在宿主細胞中翻譯時，如果 在從頭折疊過程中不能賦予它們的客戶蛋白溶解性，就難以通過體外 復性試驗恢復聚集的融合蛋白。按照本發明，完全可逆的融合配偶體如SlpA具有明顯優勢，因為其同樣可在宿主細胞中從頭折疊時導致
溶解性蛋白產生。另外，SlpA依靠其折疊可逆性，同樣可用于幫助融
合多肽的體外重折疊，所述融合多肽在宿主細胞中大量過度生產時以 不溶性包涵體累積。去折疊的完全可逆性連同高固有穩定性和顯著的
分子伴侶特征是本發明的融合配偶體的重要先決條件。SlpA完全滿足 這些標準。
按照本發明， 一個或多個、優選2個編碼SlpA分子伴侶的核香 酸序列位于編碼靶多肽的核普酸序列的上游，產生含有2個鄰接的 SlpA單元的串聯SlpA分子伴倡。 一個或多個編碼SlpA分子伴倡的核 苷酸序列可被編碼(按讀框)1-100個氨基酸的肽接頭的核苷酸序列分 隔。可使用不同的核苦酸序列編碼兩個SlpA分子伴倡單元。同樣， 應使用不同的核苷酸序列編碼融合多肽中所有其它的高重復性元件， 例如接頭或間隔區段。應該變性核苷酸序列，以避免由于大腸桿菌宿 主中的無意重組事件而導致失去1個SlpA編碼序列。通過細心選擇 相同或重復性氨基酸序列的不同密碼子，可保證表達盒的穩定性。
本發明的"靶多肽"可以為溶解性或穩定性有限的任何多肽(即 任何氨基酸序列)，其在不利條件下傾向于聚集，需要得到折疊輔助物 支持或幫助，但條件是FK506結合蛋白(FKBP),尤其是人FK506結 合蛋白，^皮排除作為靶多肽。這意味著FK506結合蛋白如人FKBP12 被排除作為靶多肽。在優選的實施方案中，顯示出聚集傾向性和/或對 熱應激敏感的多肽可以用作靶多肽。而且，具有酶活性的多肽為依據 本發明的優選靶多肽。具體地說，接受并周轉疏水底物(并因此具有它 們自身的疏水表面模式)的酶是依據本發明的優選靶多肽。在進一步優 選的實施方案中，細菌或病毒蛋白或朊蛋白或與類風濕性關節炎相關 的蛋白用作靶多肽。
哺乳動物病原體的任何結構性的、膜結合的、膜束縛的或分泌性 的基因產物均可用作靶多肽。哺乳動物病原體包括可感染或寄居于哺 乳動物宿主的病毒、細菌、單細胞或多細胞寄生物。例如，起源于諸20 肽人免疫 缺陷病毒(fflV)、痘苗病毒、脊髓灰質炎病毒、腺病毒、流感病毒、甲 肝病毒、乙肝病毒、登革病毒、日本乙型腦炎病毒、水痘-帶狀皰疹病 毒、巨細胞病毒、EB病毒、輪狀病毒以及引起麻滲、黃熱病、腮腺 炎、狂犬病、皰滲、流感、副流感等的病毒。例如霍亂弧菌(PUho c/zo/erae)、傷寒沙門氏菌(5WOT。"e〃a 0^/2/)、 一每毒螺旋體(7Ve/ o"e附a pa///dww)、 幽門*|JfM(//e//'cokirrf^* p少/oh)、百日咳才干菌(5oWefe〃a / eWwMz'》、肺炎鏈球菌(5^e/ tococcm / "ewwow'ae)、 流感嗜血桿菌 (//"ewo/7/7,7ws /"y wewzae)、石皮傷風才炎菌(C7oWr/(iz'wm fetom')、 白"提才干菌 (Coo^e6ac&n'ww <i^ /^/2en'ae)、麻風分支斥干菌(A^yco6a"en'wm /eprae)、 立氏立克次體(兄nc&to/,)、志賀氏菌(幼/ge〃a)、奈瑟雙球菌(A^/^er/a goww"/zoeae)、 腦膜炎奈瑟菌(7VW^er/a mew'"g〃/'cfe)、 厭酷3求孑包子菌 (Cocc/力'o/(3fes z'w附/"力、十專氏$乾束累^走體(5。;7^//(3 6"^^<^0//6〃')等的纟田菌蛋 白可以用作靶多肽。
優選通過本發明方法生產的靶多肽的進一步實例包括哺乳動物 基因產物，例如酶、細胞因子、生長因子、激素、疫苗、抗體等。更 具體地說，本發明優選的過表達基因產物包括基因產物，例如促紅細 胞生成素、胰島素、生長激素、生長激素釋放因子、血小板衍生生長 因子、表皮生長因子、轉化生長因子a、轉化生長因子、表皮生長因 子、成纖維細胞生長因子、神經生長因子、胰島素樣生長因子I、胰 島素樣生長因子II、凝血因子VIII、超氧化物歧化酶、干擾素、y-干 擾素、白介素-1、白介素-2、白介素-3、白介素-4、白介素-5、白介素 -6、粒細胞集落刺激因子、多譜系集落刺激因子、粒細胞-巨噬細胞刺 激因子、巨噬細胞集落刺激因子、T細胞生長因子、淋巴毒素等。優 選的過表達基因產物為人基因產物。
對于診斷用途，例如當要測定的分析物為抗體時，靶多肽含有至 少 一個由待測定的抗體識別的表位。這樣的表位也叫做診斷相關表 位。本發明的靶多肽還可以含有來自幾種不同蛋白的、類似于例如診斷相關表位的序列，其構建用于作為單個重組多肽表達。優選地，耙
多肽具有10-500個氨基酸的長度。
最優選地，靶多肽為由逆轉錄病毒蛋白(例如HIV-1的gp41和 p17、 fflV-2的gp36和p16、 HTLV-I/II的gp21)組成的群體的成員， 由包膜蛋白(例如風滲病毒的El和E2)組成的群體的成員或由致淀粉 樣變蛋白(例如(3-AP42 (阿爾茨海默肽))或朊蛋白組成的群體的成員。
還優選單純皰滲病毒1的糖蛋白Gl和單純皰滲病毒2的糖蛋白 G2作為靶多肽。更確切地說，沒有其信號序列及其跨膜區的相應糖 蛋白片段(gGl 26-189、 gG2 343-594)為適宜的靶多肽。
進一步優選以下的人巨細胞病毒的蛋白和蛋白片段作為靶多肽 pp28 (15-179)、 ppl50 (821-1048)、 ppl50 (547-725)、 ppl50 (495-854)、 p38 (105-308)、 p38 (105-373)、 p38 (209-308)、 p52 (254-293)、 p52 (295-330)、p52 (298-433)、 gB (67-84)、卯65 (372畫549)和pp65 (372-458)。
還優選以下的梅毒螺旋體(7ye/ o"ewa pa〃/血w)的蛋白和蛋白片 段TpN17 (23-156)、 TpN47 (21-434)、 TpN15 (23-142)、 TmpA (23-345)、 Tp0453 (27-287)。所有這些密螺旋體抗原的信號序列均已被略去，以 確保在大腸桿菌宿主中表達時的胞質定位。
進一步優選的靶多肽為以下的包柔氏螺旋體菌(So^re//a)的蛋白 和蛋白片段內部鞭毛片段p41i (137-262)、 VlsE (IR6/C6)、 DbpA (26-175)、 OspB (17-296)和OspC (19-214)。
進一步優選的靶多肽為EB病毒(EBV)的蛋白，例如在SEQ ID NO. 13中顯示的EBV核抗原1 (EBNA-1)、分別在SEQ E) NO. 14和15 中顯示的p18的多肽和片段以及如在SEQIDNO. 16中顯示的來源于 p23的多肽。
在融合至SlpA分子伴倡時，這些靶多肽中的任一種均可在免疫 測定中作為結合配偶體用于檢測分析物，例如針對靶多肽的抗體，或 者可以用作用于免疫測定的標準品或校準物質，如下文進一步詳述。
本發明的又一個實施方案是生產融合蛋白的方法，所述方法包括以下步驟a)培養宿主細胞，其含有至少一個編碼靶多肽的核苷酸序 列，以及該序列上游的至少一個編碼SlpA分子伴估的核苷酸序列， b)表達所述融合蛋白，c)純化所述融合蛋白和d)重折疊成可溶性的和 天然樣的或免疫反應性的(即抗原性的)構象。通過該方法生產的融合 蛋白也是本發明的一個方面。
本發明的融合蛋白表現出高溶解性。當以低速率在胞質中過表達 時，它們主要以可溶性部分累積。根據細胞生長和誘導的條件，尤其 是在大量過表達時，SlpA-X基因產物也可以包涵體累積。通常，技術 人員目的在于在大腸桿菌胞質中過量生產溶解性革巴多肽。然后通過超 聲或組合的溶菌酶/EDTA處理裂解細胞，并由溶解性部分中分離推定 的天然樣的折疊靶蛋白。SlpA-X融合蛋白是可行的，在靶多肽X 具有足夠高的內在'溶解性的情況下產生溶解性物質。在靶多肽X非常 疏水并強烈傾向于聚集的情況下，可應用替代策略，該策略在基質輔 助的復性方法中利用SlpA的有效且堅固的重折疊特性。在適宜的緩 沖條件下，如在離液物質中，裂解細胞，所述條件強烈變性和溶解甚 至疏水的細胞組分以及包涵體，盡管損害了結構完整性。當融合蛋白 在N-末端或C-末端用6組氨酸部分標記時，它們可以去折疊狀態特 異性結合至含金屬的柱子(Ni-NTA或Zi^+或Q +支持體)。固定至固相 的分子在適宜的緩沖條件下容易有效地重折疊。這種被稱作基質輔助 復性已被表明增加許多有難度的蛋白的重折疊收率，得到共價連接的 SlpA強有力支持，SlpA利用其分子伴倡特性有可能識別并可逆地遮 蔽折疊中間體中的疏水補丁。如在實施例章節中更詳細表明的適宜的 純化和重折疊方案是技術人員眾所周知的。
本發明的又一方面涉及含有SlpA和靶多肽序列的任何復合物， 其包括將SlpA加至任何蛋白制品。本發明的又一方面涉及重組產生 的融合蛋白，其含有至少一個對應于SlpA的多肽序列和至少一個對 應于耙多肽的多肽序列。本發明的又一方面涉及單獨的或與重組或合 成來源的耙多肽組合的合成產生的SlpA。按照本發明，SlpA分子伴侶在用作融合配偶體時，能夠改善有難 度的靶多肽的熱穩定性。SlpA賦予融合靶多肽熱穩定性，由此使靶多 肽對熱誘導的聚集不敏感，如在實施例章節中所示。當對融合至大腸 桿菌SlyD的有強烈聚集傾向的把蛋白實施熱應激時，產生的融合蛋 白于約42。C顯示出開始熱誘導的聚集，這與SlyD的固有穩定性明顯 一致。當相同的靶蛋白融合至SlpA、優選大腸桿菌SlpA時，它們直 到約56°C仍穩定并可溶。例如，含有SlyD和HIV蛋白gp41的片段 536-681的融合蛋白(SEQ ID NO. 5)于42。C的溫度開始聚集，而依據 本發明的融合至大腸桿菌SlpA的相同靶蛋白(SEQ ID NO. 3)在50°C 以上的溫度是熱穩定的。可以表明，SlpA作為融合蛋白的一部分防止 有難度的或有聚集傾向的蛋白在熱誘導的變性后聚集。
還可以表明，SlpA的融合即便對幾乎沒有聚集傾向的蛋白或蛋白 片段也發揮有益作用。當HSV-1的糖蛋白Gl片l史gGl (26-189)融合 至SlyD時，產生的融合蛋白可以用基本上可逆的方式以53。C的近似 解鏈溫度經熱力去折疊(圖7)。然而，當同一片段融合至SlpA時，產 生的融合蛋白于約63°C顯示出熱誘導去折疊中點(圖8)。顯然，在SlpA 取代SlyD作為融合配偶體時，gGl融合多肽的穩定性移動10。C。該 發現清楚表明了 SlpA-X融合多肽相比于其SlyD-X對應物的優良穩定 性特征。
為了闡明在免疫測定中是否也反映出SlpA融合多肽的這些優良 穩定性特征，用抗-HSV陽性和陰性的人血清評價熱挑戰(thermally challenged/heat-challenged))的SlyD-gGl和SlpA-gGl樣品(實施例4) 在熱應激后恢復的免疫反應性。在與未應激樣品相比時，，見察到清晰 的結果(參見實施例4和圖9):熱處理的SlyD-gGl和SlpA-gGl與抗 -HSV陽性血清產生的信號在所有情況下都降低，但采用SlyD融合變 體的信號損失更加明顯。反過來，熱處理的SlyD-gGl和SlpA-gGl和 抗-HSV陰性血清產生的背景信號在所有情況下均增加(指示綴合釕的 抗原的聚集過程)，但采用SlyD融合變體的信號高度的增加又更加顯著。就陽性和陰性血清的信號讀取結果(即對于信號動力學)而論，SlpA 作為用于gGl (26-189)的融合配偶體明顯優于SlyD。顯然，使用SlpA 代替SlyD作為融合配偶體，確保了針對陰性血清的較低信號水平和 針對陽性血清的較高信號回收率。簡而言之，使用SlpA作為融合配 偶體，即便是苛刻處理用于檢測免疫球蛋白分析物、含有多肽抗原的 免疫測定試劑盒后，也確保了極佳的信號動力學。可充分設想的是， 經由足夠長和柔性的交聯接頭(利用標準化學方法)共價連接至其耙分 子的SlpA或相關的分子伴倡組件發揮出類似的溶解性作用。在這些 情況下，當融合多肽不可行時，應生產分子伴侶和靶分子，并在共價 連接前單獨重折疊。
本發明的又一方面涉及重組或合成產生的、含有SlpA分子伴侶 和靶多肽的融合蛋白在免疫測定中作為結合配偶體的用途。免疫測定 以及各種均質和異質測試形式對技術人員是眾所周知的。它們可在本 領域技術人員已知的所有生物液體中進行。優選的樣品是體液，如全
血、血清、血漿、尿或唾液o
依照本發明含有SlpA和至少一種靶多肽的融合多肽也可以用作 標準品或校準物質。SlpA對在克疫測定中需要作為校準物的有難度的 蛋白也是良好的融合配偶體。例如，我們克隆、表達和純化了與SlpA 融合的肌鉤蛋白I變體(含有1-209個殘基)。產生的融合多肽SlpA-肌 4丐蛋白I原來是可溶的和免疫反應性的，非常適合用作用于肌鉤蛋白 I免疫測定的標準校準物質。由于SlpA融合配偶體，肌鈣蛋白I部分 的穩定性在與分離的肌鈣蛋白I相比時顯著增加，分離的肌鈣蛋白I 僅臨界穩定 ，即便在有利的緩沖條件下也自發聚集。本發明的又一個 實施方案是，使用SlpA與有難度的蛋白復合，以產生可溶并且穩定 的校準物或標準物質。本發明的又一方面是使用SlpA作為添加劑， 以改善溶解性，并防止靶蛋白聚集。
本發明的又一個實施方案是用于檢測分離樣品中分析物的特異 性抗體的方法，所述方法包括a) 通過將體液樣品與融合蛋白混合形成免疫反應混合物，所述融 合蛋白包含至少一個對應于SlpA分子伴侶的多肽序列和至少一個對
應于靶多肽的多肽序列，
b) 將所述免疫反應混合物保持一定時間，該保持時間足以允許體 液樣品中存在的針對所述分析物的抗體與所述融合蛋白免疫反應，形 成免疫反應產物；和
c) 沖全測所述免疫反應產物的存在情況。
在優選的實施方案中，可通過^皮稱作雙抗原夾心測試(DAGS;也 叫作橋測試)進行特異性抗體的檢測，雙抗原夾心測試是一種異質形
成橋。可容易地使該形式適合于高通量自動化分析儀。更具體地說， 要測定的抗體與介導固定至固相的第 一抗原和攜帶標記(即發信號部 分，如本領域技術人員已知的發色標記、熒光標記、化學發光標記、 電化學發光標記或其它標記)的第二抗原形成免疫復合物或免疫反應 產物，由此允許在分離液相和固相后定量或定性檢測特異性結合的抗 體。因此，只有在所研究的抗體存在于樣品中時才形成橋，并可以檢 測信號。在該測定形式中，本發明的融合蛋白可用作結合配偶體，其 中固相結合的抗原或標記抗原或這二者為含有大腸桿菌SlpA分子伴 倡和靶多肽的融合蛋白。靶多肽構成了融合蛋白的抗原性部分。
本發明的優選實施方案是所謂的不對稱雙抗原夾心測試，其用于 檢測特異性抗體，其中使用各自含有分子伴倡和靶多肽的第一種融合 蛋白和第二種融合蛋白。該形式稱為不對稱的，因為兩種融合蛋白的 分子伴倡單元彼此不同。例如，第一種融合蛋白可以含有至少一個 SlpA分子伴倡單元和至少一個靶多肽單元，并可以攜帶介導與固相特 異性結合的部分，例如結合包^皮鏈霉抗生物素蛋白的固相的生物素。 笫二種融合蛋白可以包含至少一個不同于SlpA的分子伴倡單元和至 少一個與第 一種融合蛋白的靶多狀相同或相似的靶多肽單元。另外，
后一種融合蛋白可以攜帶發信號部分或用于信號讀出的報告基團。優選地，第二種融合蛋白的分子伴倡單元也是于環境溫度具有足 夠的內在柔性(即高度動力學結合活性)的熱穩定分子伴侶。用于第二 種融合蛋白的分子伴侶單元的適宜候選物為例如FkpA (解鏈溫度約
50。C)和來自多殺性巴氏桿菌(尸ayto/re〃a ww/toc/A)的SlyD直系同源 物的C-末端截短(無半胱氨酸)變體(解鏈溫度約49°C)。兩種分子伴倡 的氨基酸序列(優選在融合蛋白中用作分子伴侶單元的完整序列和部 分序列)示于SEQIDNO. 9至12。第一種和第二種融合蛋白的分子伴 侶單元可以交換，即SlpA可以為第二種融合蛋白的組成部分，在此 情況下，其它熱穩定的分子伴侶，例如FkpA或來自多殺性巴氏桿菌 的SlyD直系同源物，可以為第一種融合蛋白的組成部分。將第一種 和第二種融合蛋白同時或連續加至所研究的特異性抗體分析物的樣
品。樣品中存在抗體時，抗體結合第一種和第二種融合蛋白的乾多肽 單元，由此橋接所述第一種融合蛋白和所述第二種融合蛋白的靶多肽 部分，產生免疫反應產物或免疫復合物。
在形成免疫復合物之前、之后或同時，加入固相，如微珠或ELISA 板，使得第一種融合蛋白結合至固相。因而，含有所述第一種融合蛋 白、要檢測的抗體和所述第二種融合蛋白的完整免疫反應產物(即免疫 復合物)與固相結合。在將固相與液相分開后，可以檢測免疫反應產物 的存在情況。作為替代方案，在第一種融合蛋白中存在的分子伴侶單 元可以用作第二種融合蛋白的分子伴侶單元，反之亦然。然而，應優 選在兩種融合蛋白中的分子伴侶單元不同，因為由于在樣品中存在針 對這些分子伴侶的抗體，可能(不可預知)產生融合蛋白的非分析物特 異性的交聯。作為替代，高度特異性的DAGS免疫測定在測定的任一 側釆用相同的分子伴侶融合配偶體也應是可行的。在此情況下，測定
的開發者必須考慮很可能在人血清的實質性部分中存在針對所用融 合配偶體的抗體。這些抗體應將發信號多肽橋接至固相，產生信號， 由此引起假陽性結果。為了避免這樣的干擾，應將融合配偶體(即分子 伴侶單元)以高度聚合并未標記的形式作為抗干擾物質加至樣品。抗干擾物質設計用于有效捕獲針對融合配偶體、接頭區段、間隔物和標簽
用其高表位密度，化學聚合的(即交聯的)抗千擾物質能夠與標記的融 合多肽有效竟爭抗分子伴侶抗體的結合。這樣，可以方便可靠的方式 排除歸因于具有不需要的特異性的免疫球蛋白的干擾。所有的生物液 體如體液都可以用作樣品。優選使用血液、血清、血漿、尿或唾液。 標記或發信號基團可以選自任何已知的可檢測標記基團，例如染
料；發光標記基團，如化學發光基團，例如吖啶镥酯類或二氧雜環丁
烷類(dioxetanes);或熒光染料，例如熒光素、香豆素、羅丹明、嚼。秦、 試鹵靈、花青及其衍生物。標記基團的其它實例為發光金屬復合物， 例如釕或銪復合物；酶，例如用于ELISA的酶；或者^:射性同位素。
免疫復合物或免疫反應產物與固相的連接可以使用生物親和結 合對(例如生物素和鏈霉抗生物素蛋白)的一個配偶體進行。優選地， 生物素偶合至本發明的融合蛋白。該生物素-融合蛋白-綴合物以高親 和性結合鏈霉抗生物素蛋白包^^皮的固相。
分析物的實例是在"靶多肽"章節下提及的所有病原體和針對這 些病原體的抗體。例如，按照本發明，優選地，可特異性;險測針對 HIV (人免疫缺陷病毒)、HTLV-1/HTLV-II (人T-細胞淋巴細胞白血病 病毒I和II)、 HCV(丙肝病毒)、HBV(乙肝病毒)、HAV(甲肝病毒)、 HCMV (人巨細胞病毒)、HSV-1/-2 (單純皰滲病毒1和2)、 EBV (EB 病毒)、水痘-帶狀皰滲病毒、人皰滲病毒6、人皰滲病毒7、人皰滲病 毒8、風滲病毒、梅毒螺旋體(7ye/ 朋ewa pa〃/血m)、幽門螺桿菌 (//e//co/>(3cfer一on')、包柔氏螺旋體菌(J5orre"a 、(映e〃z)、
(ga〃'm7'))、 克氏錐蟲(77^/ owosomc( cmz/)譯口岡寸土也弓形蟲(Jb;co/7/aswa go"測的抗體。
本發明的又 一個實施方案是用于檢測針對分^f物的抗體的試劑 盒，所述分析物含有融合蛋白，所述融合蛋白含有至少一個對應于 SlpA的多肽序列和至少一個對應于靶肽的多肽序列。該試劑盒的其它
31部分是本領域技術人員已知的，包括緩沖液、防腐劑、標記物質和使 用說明書。
本發明的其它實施方案包括本發明的重組或合成產生的融合蛋 白在免疫測定中作為降低干擾的工具的用途，以及其用于免疫實驗動 物和生產疫苗的用途。
本發明的另一個實施方案涉及含有重組或合成產生的融合蛋白 和藥學上可接受的賦形劑的組合物，所述融合蛋白含有至少 一個對應
于SlpA的多肽序列和至少一個對應于靶肽的多肽序列。
按照本發明，通過將純化形式的SlpA加至耙多肽，包括將SlpA 作為穩定劑或溶解劑加至任何蛋白制品，SlpA可以用作靶多肽的折疊 輔助物。例如，可以在靶多肽的生物拔術生產過程當中或之后加入 SlpA和來自肽基脯氨酰順/反異構酶的FKBP家族的相關折疊輔助物， 由此賦予靶多肽溶解性或熱穩定性。這樣的生物技術應用包括例如大 規模工業化生產酶、肽激素，如胰島素，或者更一般地，有商業價值 的蛋白。
在本發明的又一個實施方案中，SlpA可以在免疫測定中用作添加 劑，以降低或抑制引起錯誤的陽性結果的免疫交叉反應或干擾，尤其 是在雙抗原夾心免疫測定形式中。
更具體地說，在免疫測定中，SlpA-X或SlpA-SlpA-X融合蛋白 可以用作檢測免疫球蛋白分析物的抗原，其中X為分析物特異性抗體 結合的靶多肽。為降低干擾，SlpA或SlpA-SlpA應作為抗干擾物質加 入，以通過分子伴倡單元避免免疫交叉反應。優選地，SlpA或 SlpA-SlpA應以化學聚合形式加入，以便增加表位密度，促進IgG和 IgM分子針對SlpA、接頭區段或六組氨酸標簽的結合。
SlpA賦予靶分子溶解性和穩定性，但其可能由于任何其它部分或 基團而與絕對的靶分子不同，引起損害對應免疫測定專屬性的免疫交 叉反應。為了克服該專屬性問題，將SlpA或SlpA-SlpA的未標記變 體以聚合形式作為免疫測定試劑。該SlpA或SlpA-SlpA多肽含有所有可能引起交叉反應的元件，例如SlpA單元自身、任何接頭或間隔 區段、六組氨酸標簽或其它標簽基序乃至標記部分，即使為失活形式。
由于化學交聯，這些潛在有干擾傾向的基序以高表位密度祐:提呈至交 叉反應抗體，該交叉反應抗體非常適合于結合并由此中和這些潛在的
干擾抗體。除了此抗干擾作用外，SlpA或SlpA-SlpA聚合物甚至可以 具有額外的有利作用與高度聚合的分子伴侶一樣，其應當能夠吸附 至任何固體表面(例如珠、微量滴定板和管或容器壁)的疏水表面區域， 由此降低必需的免疫組分的非特異性吸附。此外，其可能依靠其分子 伴侶特征促進其它免疫組分的溶解性，所述分子伴倡特征在其聚合形 式時甚至有可能更加顯著。
實施例進一步闡明本發明。
實施例1
SlpA和SlvD融合多肽的克隆和純化 表達盒的克隆
基于Novagen (Madison, WI, USA)的pET24a表達質粒，獲得編碼 SlyD或SlpA融合多肽的表達盒。由SwissProt數椐庫取回即41胞外 域的序列。編碼具有富含甘氨酸的、按讀框與N-末端融合的接頭區的 gp41 (氨基酸536-681)的合成基因購自Medigenomix (Martinsried, Germany)。 Bam///和lo/限制位點分別位于編碼區的5，和3，末端。 編碼經由富含甘氨酸的接頭區連接的兩個SlpA單元(依據SEQ ID NO. 1的殘基1-146和2-149， SwissProt登錄號P0AEM0)并在C末端含有 另一接頭區的一部分的另一個合成基因同樣購自Medigenomix。 iV<ie/ 和Baw///限制位點分別位于該表達盒的5'和3'末端。所述基因和限 制位點設計用于使SlpA-SlpA和gp41胞外域片段能通過簡單的連接按 讀框融合。為了避免無意的重組過程和增加表達盒在大腸桿菌宿主中 的遺傳穩定性，編碼SlpA單元的核苷酸序列以及編碼延長的接頭區 的核苷酸序列是簡并的，即，使用不同的密碼子組合編碼相同的氨基酸序列。
用M/el和lol消化pET24a載體，插入含有按讀框與fflV-l gp41 胞外域片段536-681融合的串聯SlpA的表達盒。由此構建含有SlyD 或串聯的SlyD代替SlpA或串聯的SlpA的表達盒，以及含有的耙多 肽不同于gp41的表達盒。所有的重組融合多肽變體均含有C-末端六 組氨酸標簽，以利于Ni-NTA-輔助的純化和重折疊。使用QuikChange (Stratagene, La Jolla, CA, USA)和標準PCR技術在相應的表達盒中產 生點突變、缺失和延伸變體或限制位點。
下圖顯示了產生的HIV-1 gp41胞外域片段536-681的圖解，該片 段攜帶兩個按讀框與其N-末端融合的串聯SlpA分子伴^
1口<
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測序所產生質粒的插入片段，發現其編碼目標融合蛋白。完整的
氨基酸序列示于SEQ ID NO. 4。接頭L的氨基酸序列示于SEQ ED NO. 17。
SlpA、 SlvD以及含有SlpA、 SlvD和FkDA的融合蛋白的純化
使用實際上相同的方案純化SlyD、 SlpA和所有融合蛋白變體。 于37。C在LB培養基加卡那霉素(30 pg/ml)中將具有特定pET24a表達 質粒的大腸桿菌BL21 (DE3)細胞培養至OD6。o為1.5,通過加入1 mM 異丙基-(3-D-硫代半乳糖苷誘導胞質過表達。在誘導后3小時，通過離 心(20分鐘，5000g)收獲細胞，冷凍，并儲存于-20。C。對于細胞裂解， 將冷凍的沉淀重懸浮在冷卻的50mM磷酸鉀pH8.0、 7.0MGdmCl、 5 mM咪唑中，將懸浮液在冰上攪拌2小時，以完成細胞裂解。在離 心和過濾(硝酸纖維素膜，0.45 nm/0.2 jim)后，將裂解物加至用包含5.0 mM TCEP的裂解緩沖液平4纖的Ni-NTA柱上。隨后的洗滌步驟針對相應的耙蛋白修改，范圍為在50mM磷酸鉀pH8.0、 7.0MGdmCl、 5.0mMTCEP中的5-15 mM咪唑。應用至少10-15體積的洗滌緩沖液。 然后，通過50mM磷酸鉀pH7.8、 100mMKCl、 10mM咪唑、5.0mM TCEP替代GdmCl溶液，以誘導基質結合蛋白的構象重折疊。為了避 免共純化的蛋白酶的再活化，將蛋白酶抑制劑混合物(Complete⑧，無 EDTA， Roche)包含在重折疊緩沖液中。在過夜反應中應用總共15-20 個柱體積的重折疊緩沖液。然后，用3-5個柱體積的50 mM磷酸鉀 pH 7.8、 100 mM KC1、 10 mM咪唑洗涂除去TCEP和Complete 無 EDTA的抑制劑混合物。然后通過在相同緩沖液中的250 mM咪唑洗 脫天然蛋白。通過Tricine-SDS-PAGE評價含蛋白部分的純度，并合 并。最后，對蛋白進行大小排阻層析(Superdex HiLoad, Amersham Pharmacia),合并含蛋白級分，并在Amicon單元(YM10)中濃縮。
在偶合的純化和重折疊方案之后，根據相應的靶蛋白，可由1 g 大腸桿菌濕細胞獲得約5-20 mg的產量。
實施例2 光語檢測
圓二色性光譜(CD)是評價蛋白的二級結構和三級結構的精選方 法。芳香區(260-320 nm)中的橢圓率報告了蛋白中的三級接觸(即有規 則折疊的蛋白的球狀結構)，而酰胺區(190-250 nm)中的橢圓率反映出 蛋白骨架(即二級結構)中的有規則重復元件。
用Uvikon XL雙束分光光度計進行蛋白濃度檢測。使用Pace (1995), Protein Sci. 4, 2411-2423描述的程序測定摩爾消光系數(￡280)。
用帶有恒溫池架的Jasco-720分光偏振計記錄近-UV CD光譜，并 轉換為平均殘基橢圓率。緩沖液為50-150 mM磷酸鉀pH 7.5、 100 mM KC1、 1 mMEDTA。通^各長度為0.5 cm或1.0 cm，蛋白濃度為20-500 ^M。帶寬為2 nm，掃描速度為50 nm/分鐘，分辨率為0.5 nm,響應 為l或2s。為了改善信噪比，檢測光譜9次，并平均。用帶有恒溫池架的Jasco-720分光偏振計記錄遠-UV CD光譜，并 轉換為平均殘基橢圓率。緩沖液為10 mM磷酸鉀pH 7.5 、 25 mM KC1 、 0.5 mM EDTA。通路長度為0.2 cm,蛋白濃度在2.5-20 之間。帶 寬為2nm,掃描速度為50nm/分鐘，分辨率為0.5 nm，響應為1或2 s。為了改善信噪比，檢測光譜9次，并平均。
實施例3
生物素和釕部分與融合蛋白的偶聯
于10-20 mg/ml的蛋白濃度分別用N-輕基-琥珀酰亞胺活化的生 物素和釕標記修飾融合多肽的賴氨酸s-氨基。標記/蛋白比率由2:1至 5:1 (mol:mol)變化，取決于相應的融合蛋白。反應緩沖液為150 mM磷 酸鉀pH8.0、 100mMKCl、 lmMEDTA。反應于室溫進行15分鐘， 并通過加入緩沖的L-賴氨酸至10 mM終濃度終止。為避免標記的水 解失活，在無水DMSO (超低含水量(seccosolv)品質，Merck, Germany) 中制備相應母液。在反應緩沖液中直至15%的DMSO濃度凈皮所研究 的所有融合蛋白良好耐受。在偶聯反應后，通過使粗蛋白綴合物穿過 凝膠過濾柱(Superdex 200 HiLoad)除去未反應的游離標記。
實施例4
多肽融合蛋白的免疫反應性
在自動化的Elecsys 2010分析儀(Roche Diagnostics GmbH)中評 價不同融合蛋白的免疫反應性(即抗原性)。Elecsys⑧是Roche集團的 注冊商標。以雙抗原夾心形式進行4企測。
在Elecsys 2010中的單次檢測基于電化學發光。將生物素-綴合 物(即捕獲物-抗原)固定在包浮皮鏈霉抗生物素蛋白的磁珠表面上，而檢 測物-抗原攜帶復合的釕陽離子(在氧化還原態2+和3+之間切換)作為 發信號部分。在存在特異性免疫球蛋白分析物的情況下，發色釕復合 物與固相橋接，并在激發后于鉑電極處發射620 nm的光。信號輸出為任意光單位。
在用于捕獲物和檢測抗原的測定中使用含有HSV-1抗原gGl的 融合多肽(氨基酸26-189,參見SEQ ID NO. 7和8)作為HSV-1特異性 抗原序列。gGl抗原融合至SlpA或SlyD。在雙抗原夾心免疫測定中， 將SlpA-gGl (26-189)-生物素綴合物與SlpA-gGl (26-189)-釕復合綴合 物(本發明)以各100 ng/ml的濃度一起應用。同樣，將SlyD-gGl (26-189)-生物素綴合物與SlyD-gGl (26-189)-釘復合綴合物(比較)以各 100 ng/ml的濃度一起應用。
評價gGl(26-189)的融合多肽變體的生物素和釕綴合物以各100 ng/ml濃度針對抗HSV-1陽性血清的反應性。在所有沖企測中，未標記 的化學聚合SlyD-SlyD在反應緩沖液中作為抗干擾物質，以避免經由 分子伴倡融合單元發生的免疫交叉反應。11種抗HSV-1陰性人血清 用作對照。
為評i介融合蛋白的熱耐受性，如下對SlyD-gGl和SlpA-gGl實施 苛刻的溫度條件SlyD-gGl和SlpA-gGl (在50 mM磷酸鉀pH 7.5， 100 mM KC1, 1 mM EDTA中的蛋白)于60。C溫育過夜。gGl-生物素綴合 物的濃度各自約為1.3 mg/ml， gGl-釕綴合物的濃度各自約為0.6 mg/ml。隨后，在Elecsys⑧2010自動化分析儀中在上述實驗條件下評 價熱應激樣品的殘余免疫反應性。SlyD-gGl和SlpA-gGl的未挑戰樣 品(儲存于2-8。C)用作參比。
實驗結果示于表1 (圖9)。
表1顯示了在自動化Elecsys⑧分析儀中SlpA-gG 1(26-189)和 SlyD-gGl(26-189)與人抗HSV-l陽性血清和抗HSV-1陰性血清的免疫 反應性，如在實施例4中所述。顯示了在60°C的苛刻過夜熱處理之 前和之后兩種抗原變體的效力。實驗結果清楚表明了熱應激的 SlpA-gGl (26-189)以雙重方式超越熱應激的SlyD-gGl (26-189)的優越 性。首先，采用抗-HSV-l陽性血清的特異性信號回收率(表1的上半 部分)對于熱挑戰的SlpA融合多肽顯著較高。其次，采用抗-HSV-l陰性血清的非特異性背景信號增加(表1的下半部分)對于熱挑戰的SlpA 融合多肽顯著較低。我們觀察到，在熱處理SlyD融合多肽之后，背 景信號有相當大的增加(參見右列，背景信號增加約100%-900%)。
然而，在使用本發明的SlpA融合多肽時，在熱應激后的背景信 號增加低得可以忽略，即在除一種情況以外的所有情況下都低于20%。 在該一種情況下，(血清樣品Trina 07/06-533)背景信號增加48%。完 全相同的樣品(Trina 07/06-533)表明，在使用SlyD融合多肽代替時， 背景信號增加800%以上。這表明，即便采用固有地引起背景信號稍 微增加的有難度樣品，SlpA融合多肽也可以顯著降低背景信號。在免 疫測定的開發中高度需要低背景信號，因為它們能使生產者設定低截 取值。 一般地講，就靈敏度而言，測定性能增加需要背景信號降低。 原因是產生截取值以上的信號的樣品被視為陽性(即假定樣品含有所 研究的分析物)；產生截取值以下的信號的樣品被視為陰性。因此，易 于理解為什么絕對需要低截取值截取值越低，含低分析物濃度(并伴 隨著產生低信號)的樣品被正確地發現為低陽性的概率就越高。因此， 可通過降低固有地源于其免疫組分的背景信號增加免疫測定的靈敏 度。因此，SlpA作為折疊輔助物的用途明顯有助于改善和保證免疫測 定的長期靈敏度。
總而言之，含有SlpA的融合多肽增加融合靶多肽的穩定性和溶 解性，尤其在臨界狀態(例如熱應激)下，所述臨界狀態經常會損害天 然折疊，并導致聚集過程。簡而言之，SlpA是極佳的折疊輔助物，其 即便在非常不利的條件下也保護其客戶蛋白的完整性，有利于其客戶 蛋白重折疊為活性構象，并將它們保持在溶液中。因此，與SlpA融 合，或者更簡單地講，加入SlpA，是穩定預期用于診斷和其它生物技 術用途的蛋白制品中的靶分子的極佳方法。序 歹IJ 表
<110> Roche Diagnostics GmbH (禾卩Hoffmann La-Roche AG) Roche Diagnostics GmbH (禾卩Hoffmann La-Roche AG)
<120>作為重組蛋白及酶技術的工具的SlpA
<130> 24705 EPl-IR
<150> EP 08009537.5 ' <151〉 2008-05-26
<160> 17
<170> Patentln version 3.2
<210> 1
<211> 149
<212> PRT <213〉大腸桿菌
<400〉 1
Met Ser Glu Ser Val Gin Ser Asn Ser Ala Val Leu Val His Phe Thr 15 10 15
Leu Lys Leu Asp Asp Gly Thr Thr Ala Glu Ser Thr Arg Asn Asn Gly 20 25 30
Lys Pro Ala Leu Phe Arg Leu Gly Asp Ala Ser Leu Ser Glu Gly Leu 35 40 45
Glu Gin His Leu Leu Gly Leu Lys Val Gly Asp Lys Thr Thr Phe Ser 50 55 60
Leu Glu Pro Asp Ala Ala Phe Gly Val Pro Ser Pro Asp Leu lie Gin65 70 75 80
Tyr Phe Ser Arg Arg Glu Phe Met Asp Ala Gly Glu Pro Glu lie Gly 85 90 95
Ala lie Met Leu Phe Thr Ala Met Asp Gly Ser Glu Met Pro Gly Val 100 105 110
lie Arg Glu lie Asn Gly Asp Ser lie Thr Val Asp Phe Asn His Pro 115 120 125
Leu Ala Gly Gin Thr Val His Phe Asp lie Glu Val Leu Glu lie Asp 130 135 140
Pro Ala Leu Glu Ala 145
〈210〉 2 <211〉 153 <212> PRT <213>人工的
〈220〉
<223>具有His標簽的大腸桿菌SlpA 2-148 <400> 2 .
Ser Glu Ser Val Gin Ser Asn Ser Ala Val Leu Val His Phe Thr Leu 15 10 15
Lys Leu Asp Asp Gly Thr Thr Ala Glu Ser Thr Arg Asn Asn Gly Lys 20 25 30
Pro Ala Leu Phe Arg Leu Gly Asp Ala Ser Leu Ser Glu Gly Leu Glu 35 40 45
Gin His Leu Leu Gly Leu Lys Val Gly Asp Lys Thr Thr Phe Ser Leu50 55 60
Glu Pro Asp Ala Ala Phe Gly Val Pro Ser Pro Asp Leu lie Gin Tyr 65 70 75 80
Phe Ser Arg Arg Glu Phe Met Asp Ala Gly Glu Pro Glu lie Gly Ala 85 90 95
lie Met Leu Phe Thr Ala Met Asp Gly Ser Glu Met Pro Gly Val lie 100 105 110
Arg Glu lie Asn Gly Asp Ser lie Thr Val Asp Phe Asn His Pro Leu 115 120 125
Ala Gly Gin Thr Val His Phe Asp lie Glu Val Leu Glu lie Asp Pro 130 135 140
Ala Leu Glu His His His His His His 145 150
<210> 3
<211> 323
<212> PRT <213>人工的
<220>
<223>融合多肽SlpA-gP41 (HIV) <400> 3
Met Ser Glu Ser Val Gin Ser Asn Ser Ala Val Leu Val His Phe Thr 15 10 15
Leu Lys Leu Asp Asp Gly Thr Thr Ala Glu Ser Thr Arg Asn Asn Gly 20 25 30
Lys Pro Ala Leu Phe Arg Leu Gly Asp Ala Ser Leu Ser Glu Gly Leu35 40 45
Glu Gin His Uu Leu Gly Leu Lys Val Gly Asp Lys Thr Thr Phe Ser 50 55 60
Leu Glu Pro Asp Ala Ala Phe Gly Val Pro Ser Pro Asp Leu lie Gin 65 70 75 80
Tyr Phe Ser Arg Arg Glu Phe Met Asp Ala Gly Glu Pro Glu lie Gly 85 90 95
Ala lie Met Leu Phe Thr Ala Met Asp Gly Ser Glu Met Pro Gly Val 100 105 110
lie Arg Glu lie Asn Gly Asp Ser lie Thr Val Asp Phe Asn His Pro 115 120 125
Leu Ala Gly Gin Thr Val His Phe Asp lie Glu Val Leu Glu lie Asp 130 135 140
Pro Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly 145 150 155 160
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Thr Leu Thr Val Gin Ala Arg 165 170 175
Gin Leu Leu Ser Gly lie Val Gin Gin Gin Asn Asn Glu Leu Arg Ala 180 185 190
lie Glu Ala Gin Gin His Leu Glu Gin Leu Thr Val Trp Gly Thr Lys 195 200 205
Gin Leu Gin Ala Arg Glu Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gin 210 215 220
Gin Leu Leu Gly lie Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu lie Cys Thr Thr 225 230 235 240Ala Val Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gin lie 245 250 255
Trp Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu lie Asn Asn Tyr 260 265 270
Thr Ser Leu lie His Ser Leu lie Glu Glu Ser Gin Asn Gin Gin Glu 275 280 285
Lys Asn Glu Gin Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp 290 295 300
Asn Trp Phe Asn lie Thr Asn Trp Leu Trp Tyr Leu Glu His His His 305 310 315 320
His His His
<210> <211> <212> <213〉
4
494 PRT 人工的
<220>
<223>融合多肽串聯的SlpA和gp41 <400> 4
Met Ser Glu Ser Val Gin Ser Asn Ser Ala Val Uu Val His Phe Thr 15 10 15
Leu Lys Leu Asp Asp Gly Thr Thr Ala Glu Ser Thr Arg Asn Asn Gly 20 25 ' 30
Lys Pro Ala Leu Phe Arg Leu Gly Asp Ala Ser Leu Ser Glu Gly Leu 35 40 45Glu Gin His Uu Leu Gly Leu Lys Val Gly Asp Lys Thr Thr Phe Ser 50 55 60
Leu Glu Pro Asp Ala Ala Phe Gly Val Pro Ser Pro Asp Leu lie Gin 65 70 75 80
Tyr Phe Ser Arg Arg Glu Phe Met Asp Ala Gly Glu Pro Glu lie Gly 85 90 95
Ala lie Met Leu Phe Thr Ala Met Asp Gly Ser Glu Met Pro Gly Val 100 105 110
lie Arg Glu lie Asn Gly Asp Ser lie Thr Val Asp Phe Asn His Pro 115 120 125
Leu Ala Gly Gin Thr Val His Phe Asp lie Glu Val Leu Glu lie Asp 130 135 140
Pro Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly 145 150 155 160
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Ser Val Gin Ser Asn 165 170 175
Ser Ala Val Leu Val His Phe Thr Leu Lys Leu Asp Asp Gly Thr Thr 180 185 190
Ala Glu Ser Thr Arg Asn Asn Gly Lys Pro Ala Leu Phe Arg Leu Gly 195 200 205
Asp Ala Ser Leu Ser Glu Gly Leu Glu Gin His Leu Leu Gly Leu Lys 210 215 220
Val Gly Asp Lys Thr Thr Phe Ser Leu Glu Pro Asp Ala Ala Phe Gly 225 230 235 240Leu lie Gin Tyr Phe Ser Arg Arg Glu Phe Met 245 250 255
Asp Ala Gly Glu Pro Glu lie Gly Ala lie Met Leu Phe Thr Ala Met 260 265 270
Asp Gly Ser Glu Met Pro Gly Val lie Arg Glu lie Asn Gly Asp Ser 275 280 285
lie Thr Val Asp Phe Asn His Pro Leu Ala Gly Gin Thr Val His Phe 290 295 300
Asp lie Glu Val Leu Glu lie Asp Pro Ala Leu Glu Ala Gly Gly Gly 305 310 315 320
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 325 330 335
Ser Gly Gly Gly Thr Leu Thr Val Gin Ala Arg Gin Leu Leu Ser Gly 340 345 350
lie Val Gin Gin Gin Asn Asn Glu Leu Arg Ala lie Glu Ala Gin Gin 355 360 365
His Leu Glu Gin Leu Thr Val Trp Gly Thr Lys Gin Leu Gin Ala Arg 370 375 380
Glu Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gin Gin Leu Leu Gly lie 385 390 395 400
Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu lie Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn 405 410 415
Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gin lie Trp Asn Asn Met Thr 420 425 430
Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu lie Asn Asn Tyr Thr Ser Leu lie His435 440 445
Ser Leu lie Glu Glu Ser Gin Asn Gin Gin Glu Lys Asn Glu Gin Glu 450 455 柳
Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe Asn lie 465 470 475 480
Thr Asn Trp Leu Trp Tyr Leu Glu His His His His His His 485 490
<210〉 5 <211〉 342 <212> PRT <213〉人工的
<220>
<223>融合多肽SlyD-gp41 (HIV) <400> 5
Met Lys Val Ala Lys Asp Leu Val Val Ser Leu Ala Tyr Gin Val Arg 15 10 15
Thr Glu Asp Gly Val Leu Val Asp Glu Ser Pro Val Ser Ala Pro Leu 20 25 30
Asp Tyr Leu His Gly His Gly Ser Leu lie Ser Gly Leu Glu Thr Ala 35 40 45
Leu Glu Gly His Glu Val Gly Asp Lys Phe Asp Val Ala Val Gly Ala 50 55 60
Asn Asp Ala Tyr Gly Gin Tyr Asp Glu Asn Uu Val Gin Arg Val Pro 65 70 75 80
Lys Asp Val Phe Met Gly Val Asp Glu Leu Gin Val Gly Met Arg PheLeu Ala Glu Thr Asp Gin Gly Pro Val Pro Val Glu lie Thr Ala Val 100 105 110
Glu Asp Asp His Val Val Val Asp Gly Asn His Met Leu Ala Gly Gin 115 120 125
Asn Leu Lys Phe Asn Val Glu Val Val Ala lie Arg Glu Ala Thr Glu 130 135 140
Glu Glu Leu Ala His Gly His Val His Gly Ala His Asp His His His 145 150 155 160
Asp His Asp His Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 165 170 175
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Thr Leu Thr Val 180 185 190
Gin Ala Arg Gin Leu Leu Ser Gly lie Val Gin Gin Gin Asn Asn Glu 195 200 205
Leu Arg Ala lie Glu Ala Gin Gin His Leu Glu Gin Leu Thr Val Trp 210 215 220
Gly Thr Lys Gin Leu Gin Ala Arg Glu Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu 225 230 235 240
Lys Asp Gin Gin Leu Leu Gly lie Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu lie 245 250 255
Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu 260 265 270
Glu Gin lie Trp Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu lie 275 280 285Asn Asn Tyr Thr Ser Leu lie His Ser Leu lie Glu Glu Ser Gin Asn 290 295 300
Gin Gin Glu Lys Asn Glu Gin Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala 305 310 315 320
Ser Leu Trp Asn Trp Phe Asn lie Thr Asn Trp Leu Trp Tyr Leu Glu 325 330 335
His His His His His His 340
<210〉 6 <211> 535 <212> PRT <213〉人工的
〈220〉
<223>融合多肽串聯的SlyD-gP41 <400〉 6
Met Lys Val Ala Lys Asp Leu Val Val Ser Leu Ala Tyr Gin Val Arg 15 10 15
Thr Glu Asp Gly Val Leu Val Asp Glu Ser Pro Val Ser Ala Pro Leu 20 25 30
Asp Tyr Leu His Gly His Gly Ser Leu lie Ser Gly Leu Glu Thr Ala 35 40 45
Leu Glu Gly His Glu Val Gly Asp Lys Phe Asp Val Ala Val Gly Ala 50 55 60
Asn Asp Ala Tyr Gly Gin Tyr Asp Glu Asn Leu Val Gin Arg Val Pro 65 70 75 80Lys Asp Val Phe Met Gly Val Asp Glu Leu Gin Val Gly Met Arg Phe 85 90 95
Leu Ala Glu Thr Asp Gin Gly Pro Val Pro Val Glu lie Thr Ala Val 100 105 110
Glu Asp Asp His Val Val Val Asp Gly Asn His Met Leu Ala Gly Gin 115 120 125
Asn Leu Lys Phe Asn Val Glu Val Val Ala lie Arg Glu Ala Thr Glu 130 135 140
Glu Glu Leu Ala His Gly His Val His Gly Ala His Asp His His His 145 150 155 160
Asp His Asp His Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 165 170 175
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Lys Val Ala Lys 180 185 190
Asp Leu Val Val Ser Leu Ala Tyr Gin Val Arg Thr Glu Asp Gly Val 195 200 205
Leu Val Asp Glu Ser Pro Val Ser Ala Pro Leu Asp Tyr Leu His Gly 210 215 220
His Gly Ser Leu lie Ser Gly Leu Glu Thr Ala Leu Glu Gly His Glu 225 230 235 240
Val Gly Asp Lys Phe Asp Val Ala Val Gly Ala Asn Asp Ala Tyr Gly 245 250 255
Gin Tyr Asp Glu Asn Leu Val Gin Arg Val Pro Lys Asp Val Phe Met 260 265 270Gin Gly Pro Val Pro Val Glu lie Thr Ala Val Glu Asp Asp His Val 290 295 300
Val Val Asp Gly Asn His Met Leu Ala Gly Gin Asn Leu Lys Phe Asn 305 310 315 320
Val Glu Val Val Ala lie Arg Glu Ala Thr Glu Glu Glu Leu Ala His 325 330 335
Gly His Val His Gly Ala His Asp His His His Asp His Asp His Asp 340 345 350
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 355 360 365
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Thr Leu Thr Val Gin Ala Arg Gin Leu 370 375 380
Leu Ser Gly lie Val Gin Gin Gin Asn Asn Glu Leu Arg Ala lie Glu 385 390 395 400
Ala Gin Gin His Leu Glu Gin Leu Thr Val Trp Gly Thr Lys Gin Leu 405 410 415
Gin Ala Arg Glu Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gin Gin Leu 420 425 430
Leu Gly lie Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu lie Cys Thr Thr Ala Val 435 440 445
Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gin lie Trp Asn 450 455 460
Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu lie Asn Asn Tyr Thr Ser465 470 475 480
Leu lie His Ser Leu lie Glu Glu Ser Gin Asn Gin Gin Glu Lys Asn 485 490 495
Glu Gin Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp 500 505 510
Phe Asn lie Thr Asn Trp Leu Trp Tyr His Gly His Asp His Asp His 515 520 525
Asp His His His His His His 530 535
<210〉 7
<211> 343
<212> PRT <213〉人工的
<220〉
<223>融合多肽SlpA-gGl (HSV) <400〉 7
Met Ser Glu Ser Val Gin Ser Asn Ser Ala Val Leu Val His Phe Thr 15 10 15
Leu Lys Leu Asp Asp Gly Thr Thr Ala Glu Ser Thr Arg Asn Asn Gly 20 25 30
Lys Pro Ala Leu Phe Arg Leu Gly Asp Ala Ser Leu Ser Glu Gly Leu 35 40 45
Glu Gin His Leu Leu Gly Leu Lys Val Gly Asp Lys Thr Thr Phe Ser 50 55 60
Leu Glu Pro Asp Ala Ala Phe Gly Val Pro Ser Pro Asp Leu lie Gin65 70 75 80
Tyr Phe Ser Arg Arg Glu Phe Met Asp Ala Gly Glu Pro Glu lie Gly 85 90 95
Ala lie Met Leu Phe Thr Ala Met Asp Gly Ser Glu Met Pro Gly Val 100 105 110
lie Arg Glu lie Asn Gly Asp Ser lie Thr Val Asp Phe Asn His Pro 115 120 125
Leu Ala Gly Gin Thr Val His Phe Asp lie Glu Val Leu Glu lie Asp 130 135 140
Pro Ala Leu Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Pro Thr Asn Val Ser 165 170 175
Ser Thr Thr Gin Pro Gin Leu Gin Thr Thr Gly Arg Pro Ser His Glu 180 185 190
Ala Pro Asn Met Thr Gin Thr Gly Thr Thr Asp Ser Pro Thr Ala lie 195 200 205
Ser Leu Thr Thr Pro Asp His Thr Pro Pro Met Pro Ser lie Gly Leu 210 215 220
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Ala Gly Asp Gly Glu His Leu Glu 225 230 235 240
Gly Gly Asp Gly Thr Arg Asp Thr Leu Pro Gin Ser Pro Gly Pro Ala 245 250 255
Phe Pro Leu Ala Glu Asp Val Glu Lys Asp Lys Pro Asn Arg Pro Val 260 265 270Pro Asn Asn Ser Pro Ala Arg Pro Glu Thr Ser 275 280 285
Arg Pro Lys Thr Pro Pro Thr lie lie Gly Pro Leu Ala Thr Arg Pro 290 295 300
Thr Thr Arg Leu Thr Ser Lys Gly Arg Pro Leu Val Pro Thr Pro Gin 305 310 315 320
His Thr Pro Leu Phe Ser Phe Leu Thr Ala Ser Pro Ala Leu Asp Leu 325 330 335
Glu His His His His His His 340
<210〉 8 <211> 360 <212> PRT 〈213〉人工的
〈220〉
<223>融合多肽SlyD-gGl (HSV) <400〉 8
Met Lys Val Ala Lys Asp Leu Val Val Ser Leu Ala Tyr Gin Val Arg 15 i0 15
Thr Glu Asp Gly Val Leu Val Asp Glu Ser Pro Val Ser Ala Pro Leu 20 25 30
Asp Tyr Leu His Gly His Gly Ser Leu lie Ser Gly Leu Glu Thr Ala 35 40 45
Leu Glu Gly His Glu Val Gly Asp Lys Phe Asp Val Ala Val Gly Ala 50 55 60Asn Asp Ala Tyr Gly Gin Tyr Asp Glu Asn Leu Val Gin Arg Val Pro 65 70 75 80
Lys Asp Val Phe Met Gly Val Asp Glu Leu Gin Val Gly Met Arg Phe 85 90 95
Leu Ala Glu Thr Asp Gin Gly Pro Val Pro Val Glu lie Thr Ala Val 100 105 110
Glu Asp Asp His Val Val Val Asp Gly Asn His Met Leu Ala Gly Gin 115 120 125
Asn Leu Lys Phe Asn Val Glu Val Val Ala lie Arg Glu Ala Thr Glu 130 135 140
Glu Glu Leu Ala His Gly His Val His Gly Ala His Asp His His His 145 150 155 160
Asp His Asp His Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 165 170 175
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 180
Ser Ser Thr Thr Gin Pro Gin Leu
195 200
Ser Gly Gly Gly Pro Thr Asn Val 185 190
Gin Thr Thr Gly Arg Pro Ser His 205
Glu Ala Pro Asn Met Thr Gin Thr Gly Thr Thr Asp Ser Pro Thr Ala 210 215 220
lie Ser Leu Thr Thr Pro Asp His Thr Pro Pro Met Pro Ser lie Gly 225 230 235 240
Leu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Ala Gly Asp Gly Glu His Leu 245 250 255Glu Gly Gly Asp Gly Thr Arg Asp Thr Leu Pro Gin Ser Pro Gly Pro 260 265 270
Ala Phe Pro Leu Ala Glu Asp Val Glu Lys Asp Lys Pro Asn Arg Pro 275 280 285
Val Val Pro Ser Pro Asp Pro Asn Asn Ser Pro Ala Arg Pro Glu Thr 290 295 300
Ser Arg Pro Lys Thr Pro Pro Thr lie lie Gly Pro Leu Ala Thr Arg 305 310 315 320
Pro Thr Thr Arg Leu Thr Ser Lys Gly Arg Pro Leu Val Pro Thr Pro 325 330 335
Gin His Thr Pro Leu Phe Ser Phe Leu Thr Ala Ser Pro Ala Leu Asp 340 345 350
Leu Glu His His His His His His 355 360
<210> 9 <211〉 199 <212> PRT
<213> 多殺性巴氏桿菌眾^.好.被，.3"19... !^.$.9. 丄扭). <400> 9
Met Lys lie Ala Lys Asn Val Val Val Ser lie Ala Tyr Gin Val Arg 15 10 15
Thr Glu Asp Gly Val Leu Val Asp Glu Ala Pro Val Asn Gin Pro Leu 20 25 ' 30
Glu Tyr Leu Gin Gly His Asn Asn Leu Val lie Gly Leu Glu Asn Ala 35 40 45Leu Glu Gly Lys Ala Val Gly Asp Lys Phe Glu Val Arg Val Lys Pro 50 55 60
Glu Glu Ala Tyr Gly Glu Tyr Asn Glu Asn Met Val Gin Arg Val Pro 65 70 75 80
Lys Asp Val Phe Gin Gly Val Asp Glu Leu Val Val Gly Met Arg Phe 85 90 95
lie Ala Asp Thr Asp lie Gly Pro Leu Pro Val Val lie Thr Glu Val 100 105 110
Ala Glu Asn Asp Val Val Val Asp Gly Asn His Met Leu Ala Gly Gin 115 120 125
Glu Leu Leu Phe Ser Val Glu Val Val Ala Thr Arg Glu Ala Thr Leu 130 135 140
Glu Glu lie Ala His Gly His lie His Gin Glu Gly Gly Cys Cys Gly 145 150 155 160
Gly His His His Asp Ser A印Glu Glu Gly His Gly Cys Gly Cys Gly 165 170 175
Ser His His His His Glu His Glu His His Ala His Asp Gly Cys Cys 180 185 190
Gly Asn Gly Gly Cys Lys His 195
<210> 10
<211> 156
<212〉 PRT
<213〉 多殺性巴氏桿菌
<400> 10Thr Glu Asp Gly Val Leu Val Asp Glu Ala Pro Val Asn Gin Pro Leu 20 25 30
Glu Tyr Leu Gin Gly His Asn Asn Leu Val lie Gly Leu Glu Asn Ala 35 40 45
Leu Glu Gly Lys Ala Val Gly Asp Lys Phe Glu Val Arg Val Lys Pro 50 55 60
Glu Glu Ala Tyr Gly Glu Tyr Asn Glu Asn Met Val Gin Arg Val Pro 65 70 , 75 80
Lys Asp Val Phe Gin Gly Val Asp Glu Leu Val Val Gly Met Arg Phe 85 90 95
lie Ala Asp Thr Asp lie Gly Pro Leu Pro Val Val lie Thr Glu Val 100 105 110
Ala Glu Asn Asp Val Val Val Asp Gly Asn His Met Leu Ala Gly Gin 115 120 125
Glu Leu Leu Phe Ser Val Glu Val Val Ala Thr Arg Glu Ala Thr Leu 130 135 140
Glu Glu lie Ala His Gly His lie His Gin Glu Gly 145 150 155
<210> 11
<211> 270
<212> PRT <213>大腸桿菌
<400> 11Met Lys Ser Leu Phe Lys Val Thr Leu Leu Ala Thr Thr Met Ala Val 15 10 15
Ala Leu His Ala Pro lie Thr Phe Ala Ala Glu Ala Ala Lys Pro Ala 20 25 30
Thr Ala Ala Asp Ser Lys Ala Ala Phe Lys Asn Asp Asp Gin Lys Ser 35 40 45
Ala Tyr Ala Leu Gly Ala Ser Leu Gly ^rg Tyr Met Glu Asn Ser Leu 50 55 60
Lys Glu Gin Glu Lys Leu Gly lie Lys Leu Asp Lys Asp Gin Leu lie 65 70 75 80
Ala Gly Val Gin Asp Ala Phe Ala Asp Lys Ser Lys Leu Ser Asp Gin 85 90 95
Glu lie Glu Gin Thr Leu Gin Ala Phe Glu Ala Arg Val Lys Ser Ser 100 105 110
Ala Gin Ala Lys Met Glu Lys Asp Ala Ala Asp Asn Glu Ala Lys Gly 115 120 125
Lys Glu Tyr Arg Glu Lys Phe Ala Lys piu Lys Gly Val Lys Thr Ser 130 135 140
Ser Thr Gly Leu Val Tyr Gin Val Val Glu Ala Gly Lys Gly Glu Ala 145 150 155 160
Pro Lys Asp Ser Asp Thr Val Val Val Asn Tyr Lys Gly Thr Leu lie 165 170 175
Asp Gly Lys Glu Phe Asp Asn Ser Tyr Thr Arg Gly Glu Pro Leu Ser 180 185 190
Phe Arg Leu Asp Gly Val lie Pro Gly Trp Thr Glu Gly Leu Lys Asn195 200 205
lie Lys Lys Gly Gly Lys lie Lys Leu Val lie Pro Pro Glu Leu Ala 210 215 220
Tyr Gly Lys Ala Gly Val Pro Gly lie Pro Pro Asn Ser Thr Leu Val 225 230 235 240
Phe Asp Val Glu Leu Leu Asp Val Lys Pro Ala Pro Lys Ala Asp Ala 245 250 255
Lys Pro Glu Ala Asp Ala Lys Ala Ala Asp Ser Ala Lys Lys
265 270
260
<210〉12
<211>245
<212>PRT
<213>大腸桿菌
<400>12
Ala Glu Ala Ala Lys Pro Ala Thr Ala Ala Asp Ser Lys Ala Ala Phe 15 10 15
Lys Asn Asp Asp Gin Lys Ser Ala Tyr Ala Leu Gly Ala Ser Leu Gly 20 25 30
Arg Tyr Met Glu Asn Ser Leu Lys Glu Gin Glu Lys Leu Gly lie Lys 35 40 45
Leu Asp Lys Asp Gin Leu lie Ala Gly Val Gin Asp Ala Phe Ala Asp 50 55 60
Lys Ser Lys Leu Ser Asp Gin Glu lie Glu Gin Thr Leu Gin Ala Phe 65 70 75 80
Glu Ala Arg Val Lys Ser Ser Ala Gin Ala Lys Met Glu Lys Asp Ala85 90 95
Ala Asp Asn Glu Ala Lys Gly Lys Glu Tyr Arg Glu Lys Phe Ala Lys 100 105 110
Glu Lys Gly Val Lys Thr Ser Ser Thr Gly Leu Val Tyr Gin Val Val 115 120 125
Glu Ala Gly Lys Gly Glu Ala Pro Lys Asp Ser Asp Thr Val Val Val 130 135 140
Asn Tyr Lys Gly Thr Leu lie Asp Gly Lys Glu Phe Asp Asn Ser Tyr 145 150 155 160
Thr Arg Gly Glu Pro Leu Ser Phe Arg Leu Asp Gly Val lie Pro Gly 165 170 175
Trp Thr Glu Gly Leu Lys Asn lie Lys Lys Gly Gly Lys lie Lys Leu 180 185 190
Val lie Pro Pro Glu Leu Ala Tyr Gly Lys Ala Gly Val Pro Gly lie 195 200 205
Pro Pro Asn Ser Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Asp Val Lys 210 215 220
Pro Ala Pro Lys Ala Asp Ala Lys Pro Glu Ala Asp Ala Lys Ala Ala 225 230 235 240
Asp Ser Ala Lys Lys 245
<210> 13 <211〉 241 <212> PRT <213>人工的〈220〉
<223〉 EBVNA-1 401-641,半胱氨酸變為丙氨酸 <400> 13
Gly Arg Arg Pro Phe Phe His Pro Val Gly Glu Ala Asp Tyr Phe Glu 15 10 15
Tyr His Gin Glu Gly Gly Pro Asp Gly Glu Pro Asp Val Pro Pro Gly 20 25 30
Ala lie Glu Gin Gly Pro Ala Asp Asp Pro Gly Glu Gly Pro Ser Thr 35 40 45
Gly Pro Arg Gly Gin Gly Asp Gly Gly Arg Arg Lys Lys Gly Gly Trp 50 55 60
Phe Gly Lys His Arg Gly Gin Gly Gly Ser Asn Pro Lys Phe Glu Asn 65 70 75 80
lie Ala Glu Gly Leu Arg Ala Leu Leu Ala Arg Ser His Val Glu Arg 85 90 95
Thr Thr Asp Glu Gly Thr Trp Val Ala Gly Val Phe Val Tyr Gly Gly 100 105 110
Ser Lys Thr Ser Leu Tyr Asn Leu Arg Arg Gly Thr Ala Leu Ala lie 115 120 125
Pro Gin Ala Arg Leu Thr Pro Leu Ser Arg Leu Pro Phe Gly Met Ala 130 135 140
Pro Gly Pro Gly Pro Gin Pro Gly Pro Leu Arg Glu Ser lie Val Ala 145 150 155 160
Tyr Phe Met Val Phe Leu Gin Thr His lie Phe Ala Glu Val Leu Lys 165 170 175Asp Ala lie Lys Asp Leu Val Met Thr Lys Pro Ala Pro Thr Ala Asn 180 185 190
lie Arg Val Thr Val Ala Ser Phe Asp Asp Gly Val Asp Leu Pro Pro 195 200 205
Trp Phe Pro Pro Met Val Glu Gly Ala Ala Ala Glu Gly Asp Asp Gly 210 215 220
Asp Asp Gly Asp Glu Gly Gly Asp Gly A印Glu Gly Glu Glu Gly Gin 225 230 235 240
Glu
<210> 14
<211> 176
<212> PRT <213>人工的
<220>
<223〉 EBV P18, 1-176,半胱氨酸變為丙氨酸 <400〉 14
Met Ala Arg Arg Leu Pro Lys Pro Thr Leu Gin Gly Arg Leu Glu Ala 15 10 15
Asp Phe Pro Asp Ser Pro Leu Leu Pro Lys Phe Gin Glu Leu Asn Gin 20 25 30
Asn Asn Leu Pro Asn Asp Val Phe Arg Glu Ala Gin Arg Ser Tyr Leu 35 40 45
Val Phe Leu Thr Ser Gin Phe Ala Tyr Glu Glu Tyr Val Gin Arg Thr 50 55 60Phe Gly Val Pro Arg Arg Gin Arg Ala lie Asp Lys Arg Gin Arg Ala 65 70 75 80
Ser Val Ala Gly Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala 85 90 95
Thr Pro Val Gin Gin Ala Gin Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala 100 105 110
Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gin Ser Ala Thr Pro 115 120 125
Ser Val Ser Ser Ser lie Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala 130 135 140
Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly 145 150 155 160
Gly Gly Gin Pro His Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gin 165 170 175
<210〉15
<211〉72
<212>PRT
<213〉人皰疹病毒4
<400> 15
Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr 15 10 15
Ala Val Ala Gin Ser Ala Thr Pro Ser Val Ser Ser Ser lie Ser Ser 20 25 30
Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala 35 40 45Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gin Pro His Asp Thr Ala 50 55 60
Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gin 65 70
<210〉 16
〈211〉 162
<212〉 PRT <213>人工的
<220〉
<223〉 EBV p23， 1-162,半胱氨酸變為丙氨酸 <400> 16
Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp 15 10 15
Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu 20 25 30
Asn Lys Ala Leu Lys Gin Gin Val Leu Arg Gly Gly Ala Ala Ala Ser 35 40 45
Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro Pro Glu Pro Leu Thr 50 55 60
Ala Arg Gin Arg Glu Val Met lie Thr Gin Ala Thr Gly Arg Leu Ala 65 70 75 80
Ser Gin Ala Met Lys Lys lie Glu Asp Lys Val Arg Lys Ser Val Asp 85 90 95
Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Asn lie Leu Gin Asn Leu Thr 100 105 110Leu Arg lie Gin Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly Gin Pro Ser Pro 115 120 125
Gly Glu Gly Thr Arg Pro Arg Glu Ser Asn Asp Pro Asn Ala Thr Arg 130 135 140
Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gin lie 145 150 155 160
Ser Asp
<210> 17
<211> 23
<212〉 PRT <213>人工的
<220>
<223>用于融合蛋白表達盒的人工接頭 <400> 17
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 15 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 20
權利要求
1.一種編碼融合蛋白的重組DNA分子，所述重組DNA分子含有至少一個編碼靶多肽的核苷酸序列以及在所述核苷酸序列上游或下游的至少一個編碼SlpA分子伴侶的核苷酸序列，其中所述靶多肽不包括人FK506結合蛋白(FKBP)。
2. —種含有有效連接的權利要求1的重組DNA分子的表達載體。
3. —種用權利要求2的表達載體轉化的宿主細胞。
4. 一種生產融合蛋白的方法，所述方法包括以下步驟a) 培養權利要求3的宿主細胞，b) 表達所述融合蛋白，c) 純化所述融合蛋白，和d) 重折疊成可溶性的免疫反應性的構象。
5 —種重組產生的融合蛋白，所述融合蛋白^^有至少一個對應于 SlpA分子伴倡的多肽序列和至少一個對應于耙多肽的多肽序列，其中 人FK506結合蛋白(FKBP)被排除作為靶多肽。
6. 權利要求5的重組產生的融合蛋白的用途，其用作免疫測定中 的結合配偶體。
7. 權利要求5的重組產生的融合蛋白的用途，其用作降低免疫測 定中的干擾的工具。
8. 權利要求5的重組產生的融合蛋白的用途，其作為免疫原用于 產生抗所述靶多肽的抗體。
9. 權利要求5的重組產生的融合蛋白在生產疫苗中的用途。
10. —種包含權利要求5的重組產生的融合蛋白和藥學上可接受 的i 武形劑的組合物。
11. 一種用于檢測分離樣品中的分析物特異性抗體的方法，所述 方法包括a) 通過將體液樣品與權利要求5的融合蛋白混合形成免疫反應混 合物，b) 將所述免疫反應混合物保持一定時間，所述保持時間足以允許 針體液樣品中存在的抗所述分析物的抗體與所述融合蛋白發生免疫反應，形成免疫反應產物；和c) -險測所述免疫反應產物的存在情況。
12. 權利要求5的融合蛋白在檢測分離樣品中的針對被分析物的 抗體的方法中的用途。
13. —種試劑盒，其用于檢測針對被分析物的抗體，所述試劑盒 包含權利要求5的融合蛋白。
14. SlpA在免疫測定中作為添加劑的用途，其用于降低干擾和減 少免疫交叉反應。
15. SlpA作為添加劑的用途，其用于改善溶解性和防止靶蛋白聚集。
全文摘要
本發明涉及作為重組蛋白和酶技術工具的SlpA。具體來說，本發明涉及編碼含有SlpA分子伴侶和靶多肽的融合蛋白的重組DNA分子，編碼所述融合蛋白的相應表達載體以及用所述表達載體轉化的宿主細胞，其中人FK506結合蛋白(FKBP)被排除作為靶多肽；還涉及生產所述融合蛋白的方法；所述融合蛋白作為結合配偶體的用途，或作為在免疫測定中降低干擾的工具的用途；所述融合蛋白用于產生抗體的用途和在疫苗生產中的用途；所述融合蛋白在免疫測定中檢測分析物的方法，以及含有所述融合蛋白的試劑盒；SlpA在免疫測定中降低干擾的用途，及其在蛋白制品中作為添加劑和在生物技術應用中作為折疊輔助物的用途。
文檔編號C12P21/02GK101591665SQ200910142690
公開日2009年12月2日 申請日期2009年5月25日 優先權日2008年5月26日
發明者C·肖爾茨, E·法茨, P·沙爾施米特, U·施米特 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司