專利名稱：鴨新城疫病毒和鴨圓環病毒二重pcr檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種鴨新城疫病毒和鴨圓環病毒二重PCR檢測試劑盒。
背景技術：
鴨新城疫病是由鴨源新城疫病毒(Duck Newcastle Diseases duck NDV)引起的一類急性、高度接觸性和致死性的傳染病。早期研究發現，鴨對致病性APMV-I具有極強的抵抗力，僅表現為健康帶毒，即使強毒感染也不致病。但近年來發現引起高致病性和死亡性的鴨源新城疫病毒的自然流行，對養鴨業危害嚴重。河北、福州、浙江、山西、山東、河南等地陸續報道該病的發生和流行，上述研究表明，鴨源新城疫病毒的感染呈上升趨勢，將對我國的養鴨業產生巨大危害。鴨圓環病毒(Duck circo virus, DuCV)是圓環病毒科(Circoviridae)圓環病毒屬(Circovirus)的一成員，首次在德國報道。近年來，相繼有匈牙利、美國、中國臺灣及我國山東、遼寧、福建、廣東和廣西等地發現有鴨圓環病毒造成鴨感染或發病的報道。DuCV造成鴨發病的主要臨床表現為發育不良、體重下降及羽毛凌亂等，病理組織表現為法氏囊出現壞死淋巴細胞減少和組織細胞增多。織細胞增生現象感染動物的淋巴組織逐漸萎縮導致免疫功能下降或免疫反應抑制進而提高了二重或多重感染的幾率是圓環病毒感染的特征與其它病原菌或病毒的混合感染情形非常復雜。柴同杰對山東的櫻桃谷鴨群鴨圓環病毒及混合感染的調查表明，鴨圓環病毒與鴨I型肝炎、鴨疫里默氏桿菌及大腸桿菌的混合感染率較高。屈素潔等對廣西部分地區鴨圓環病毒感染情況進行調查，結果表明存在與鴨疫里氏桿菌、新城疫病毒、禽流感病毒和鴨肝炎病毒等病原混合感染現象。水禽圓環病毒不能在細胞和禽胚上生長，而且該病毒多以亞臨床感染形式出現，所以用傳統的分離病毒、動物試驗方法無法進行診斷。最初診斷圓環病毒主要靠病理組織和電鏡觀察，但這兩種方法都需要專業的技能和敏感性不高。混合感染給鴨疾病診斷帶來了許多困難，不能僅通過臨床表現做出診斷，需要借助于分子診斷技術。病毒的分離、瓊脂擴散試驗和酶聯免疫吸附試驗等這些方法耗時，不利于病毒的防治。PCR方法具有操作簡便、敏感性高、特異性強和重復性好等優點，已成為動物病原檢測的重要方法。特別是多重PCR具有可同時檢測、鑒別多種病原體突出的特點，在臨床多種病原混合感染的鑒別診斷上具有獨特的優勢和很高的實用價值。但是在一個PCR體系中由于存在多種模板和引物，需要防止引物和模板之間的非特異性結合，避免非特性條帶的出現，還要盡量避免引物二聚體的產生。同時，目的片段的大小有合適的梯度和各引物退火條件盡可能相同，以確保2種擴增產物量相對平衡，條件摸索十分重要。至今尚未見有應用二重PCR對新城疫病毒和鴨圓環病毒檢測和診斷的報道。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種檢測新城疫病毒和鴨圓環病毒的引物組。
本發明提供的引物組，由引物I、引物2、引物3和引物4組成；
所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分別依次為序列表中的序列I、序列2、序列3和序列4。上述引物組中，所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩爾比為
0.1-0. 5 0. 1-0. 5:1:1;上述引物組中，所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩爾比具體為
0.2 : 0. 2 : I : I。本發明的另一個目的是提供一種檢測新城疫病毒和鴨圓環病毒的PCR試劑。本發明提供的PCR試劑，由上述的引物組、PCR緩沖液和水組成；所述引物組中的引物I和引物2在所述PCR試劑中的終濃度均具體為0. Iumol/mL-0. 5 u mol/mL ;所述引物I和所述引物2在所述PCR試劑中的終濃度均進一步具體為
0.2 umol/mL ；所述弓丨物組中的引物3和引物4在所述PCR試劑中的終濃度均具體為0. 8 ii mol/mL-1.2umol/mL ;所述引物3和所述引物4在所述PCR試劑中的終濃度均進一步具體為Iu mol/mL。上述PCR緩沖液為2XTaq PCR Mix (購自天根 KT201)。本發明的第三個目的是提供一種檢測新城疫病毒和鴨圓環病毒的PCR試劑盒。本發明提供的PCR試劑盒，包括上述引物組或上述PCR試劑。上述引物組或上述PCR試劑或上述試劑盒在制備檢測和/或輔助檢測待測樣品中是否含有新城疫病毒和鴨圓環病毒產品中的應用也是本發明保護的范圍。上述檢測和/或輔助檢測待測樣品中是否含有新城疫病毒和鴨圓環病毒為用上述的引物組或上述PCR試劑或上述試劑盒對所述待測樣品進行二重PCR擴增。上述應用中，所述二重PCR擴增的退火溫度為50°C -65°C，所述二重PCR擴增的退火溫度具體為55 °C。本發明的第四個目的是提供一種檢測新城疫病毒的引物對A。本發明提供的引物對A，由上述的引物組中的所述引物I和所述引物2組成；本發明的第五個目的是提供一種檢測鴨圓環病毒的引物對B。本發明提供的引物對B，由上述的引物組中的所述引物3和所述引物4組成。上述的引物對A在制備檢測和/或輔助檢測待測樣品中是否含有新城疫病毒產品中的應用也是本發明保護的范圍；上述的引物對B在制備檢測和/或輔助檢測待測樣品中是否含有鴨圓環病毒產品中的應用也是本發明保護的范圍。上述新城疫病毒可以為鴨源也可以為非鴨源。本發明的實驗證明，本研究設計了 2對引物，建立了新城疫病毒和鴨圓環病毒的二重PCR的檢測方法，可以同時檢測和鑒別新城疫病毒和鴨圓環病毒兩種病原體的二重PCR技術，具有操作簡便、敏感性高、特異性強和重復性好等優點。因此，本研究建立的鴨圓環病毒和鴨新城疫病毒的二重PCR的檢測方法可用于鴨圓環病毒感染造成的免疫力減低導致的鴨源新城疫病毒的混合感染，既可以節約時間的成本，又可以減少污染。
圖I為二重PCR溫度優化試驗圖2為二重PCR的優化結果圖3為二重PCR特異性試驗圖4為二重PCR方法檢測DuCV和DuNDV的靈敏性圖5為二重PCR部分臨床樣品檢測圖6為常規PCR檢測臨床樣品中DuCV病毒圖7為常規PCR檢測臨床樣品中NDV病毒
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中所用的病毒、試劑具體如下鴨瘟病毒AV1221購自中國獸醫藥品監察所；新城疫病毒為鴨新城疫病毒、NDV-F48E9、NDV-Lasota，其中鴨新城疫病毒記載在“鴨源新城疫油乳劑滅活疫苗制備的研究”，山東農業大學碩士論文，公眾可從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得；NDV-F48E9和NDV-Lasota均購自中國獸醫藥品監察所；鴨I型肝炎病毒AV2111株(以下簡稱為DHV I)購自中國獸醫藥品監察所；番鴨細小病毒(MDPV)記載在“廣西番鴨細小病毒的分離和鑒定”，廣西畜牧獸醫，2002，18 (6) :5-7，公眾可從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得；鴨圓環病毒記載在“廣西部分地區鴨圓環病毒感染情況調查”，中國畜牧獸醫，2010,37(11) : 156-158，公眾可從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得；小鵝瘟病毒記載在“小鵝瘟病毒熒光定量PCR檢測方法的建立”，上海畜牧獸醫通訊，2008，160 (06) :30-31，公眾可從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得；H9亞型禽流感病毒記載在“多重反轉錄聚合酶鏈反應快速檢測鑒別H9亞型禽流感病毒方法的建立”，中國人獸共患病學報，2006，(09) :858-860，公眾可從廣西壯族自治區 獸醫研究所獲得；禽多殺性巴氏桿菌記載在“應用聚合酶鏈反應檢測禽多殺性巴氏桿菌的研究”，中國預防獸醫學報，1999，(06)公眾可從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得；大腸桿菌0157 :H7記載在“廣西畜禽大腸桿菌0157 :H7流行病學調查”，中國人獸共患病學報，2011，27 (12) :1151-1155，公眾可從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得；鴨疫里默氏桿菌記載在“鴨疫里默氏桿菌實時熒光定量PCR快速檢測方法的建立與應用研究”，生物技術，2010，37 (10) :87-91，公眾可從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得；試劑2 X Taq PCR Mix購自北京天根生物技術公司；TIANamp血液/細胞/組織基因DNA提取試劑盒購自天根公司；RNA提取試劑TRIzol LS Reagent購自Invitrogen公司。 實施例I、引物的設計和合成 GenBank中新城疫病毒F基因和鴨圓環病毒的Vl/rep基因序列，利用Lasergene軟件進行多序列比對，在保守區運用在線軟件Primer Premier 5.0設計引物。引物由上海Invitrogen公司合成。引物序列見表I。表I為二重PCR引物序列
權利要求
1.檢測新城疫病毒和鴨圓環病毒的引物組，由引物I、引物2、引物3和引物4組成； 所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分別依次為序列表中的序列I、序列2、序列3和序列4。
2.根據權利要求I所述的引物組，其特征在于 所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩爾比為0. 1-0. 5 0. 1-0. 5:1:1; 所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩爾比具體為0.2 : 0.2 : I : I。
3.檢測新城疫病毒和鴨圓環病毒的PCR試劑，由權利要求I或2所述的引物組、PCR緩沖液和水組成； 所述引物組中的引物I和引物2在所述PCR試劑中的終濃度均具體為0. Iumol/mL-0. 5 u mol/mL ;所述引物I和所述引物2在所述PCR試劑中的終濃度均進一步具體為0.2 umol/mL ； 所述引物組中的引物3和引物4在所述PCR試劑中的終濃度均具體為0. 8iimol/mL-1. 2 u mol/mL ;所述引物3和所述引物4在所述PCR試劑中的終濃度均進一步具體為Iu mol/mL。
4.檢測新城疫病毒和鴨圓環病毒的PCR試劑盒，包括權利要求I或2所述的引物組或權利要求3所述PCR試劑。
5.權利要求I或2所述的引物組或權利要求3所述PCR試劑或權利要求4所述試劑盒在制備檢測和/或輔助檢測待測樣品中是否含有新城疫病毒和鴨圓環病毒產品中的應用。
6.根據權利要求5所述應用，其特征在于所述檢測和/或輔助檢測待測樣品中是否含有新城疫病毒和鴨圓環病毒為用權利要求I或2所述的引物組或權利要求3所述PCR試劑或權利要求4所述試劑盒對所述待測樣品進行二重PCR擴增。
7.根據權利要求5或6所述應用，其特征在于 所述二重PCR擴增的退火溫度為50°C _65°C，所述二重PCR擴增的退火溫度具體為55。。。
8.—種檢測新城疫病毒的引物對A，由權利要求I或2所述的引物組中的所述引物I和所述引物2組成； 或一種檢測鴨圓環病毒的引物對B，由權利要求I或2所述的引物組中的所述弓丨物3和所述引物4組成。
9.權利要求8所述的引物對A在制備檢測和/或輔助檢測待測樣品中是否含有新城疫病毒產品中的應用； 或權利要求8所述的引物對B在制備檢測和/或輔助檢測待測樣品中是否含有鴨圓環病毒產品中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種鴨新城疫病毒和鴨圓環病毒二重PCR檢測試劑盒。本發明提供了一種檢測新城疫病毒和鴨圓環病毒的引物組，由引物1、引物2、引物3和引物4組成；所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分別依次為序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。本發明的實驗證明，本研究設計了2對引物，建立了新城疫病毒和鴨圓環病毒的二重PCR的檢測方法，可以同時檢測和鑒別新城疫病毒和鴨圓環病毒兩種病原體的二重PCR技術，具有操作簡便、敏感性高、特異性強和重復性好等優點。
文檔編號C12N15/11GK102618668SQ201210084010
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月27日 優先權日2012年3月27日
發明者劉加波, 龐耀珊, 范晴, 許宗麗, 謝麗基, 謝志勤, 謝芝勛, 鄧顯文 申請人:廣西壯族自治區獸醫研究所