專利名稱：甲型副傷寒沙門菌的逆轉錄熒光pcr檢測用引物的制作方法
技術領域：
本發明涉及甲型副傷寒沙門菌的檢測，具體地說，涉及甲型副傷寒沙門菌的逆轉錄熒光PCR檢測用引物。
背景技術：
甲型副傷寒沙門菌(S. Paratyphi A)是腸道傳染病中最常見的病原菌之一，對甲型副傷寒沙門菌的快速、準確檢定是控制甲型副傷寒流行的重要手段。目前實驗室常規診斷甲型副傷寒的主要方法為細菌培養、肥達氏凝集反應、傷寒血球快速診斷方法。這些方法仍存在著陽性率相對較低，誘導H-a抗原費時，不利于早期診斷等缺陷，給流行病學追蹤、 早期控制及臨床早期診斷工作帶來一定難度，因此，有必要建立甲型副傷寒沙門菌的快速、準確的分子生物學檢測方法。
發明內容
本發明的目的是提供甲型副傷寒沙門菌的逆轉錄熒光PCR檢測用引物。本發明的另一目的是提供含有所述逆轉錄熒光PCR引物的用于檢測甲型副傷寒沙門菌的試劑盒。為了實現本發明目的，本發明的一種甲型副傷寒沙門菌的逆轉錄熒光PCR檢測用引物，其包括正向引物5’ -CCTGTTAGAAGTGTTTACAACTT-3，和反向引物5’ -GCTAAACCACCAAATTGTGT-3 ’。本發明進一步提供含有上述引物的用于檢測甲型副傷寒沙門菌的試劑盒。本發明針對甲型副傷寒沙門菌hsdM基因設計特異性引物，建立檢測該靶基因的逆轉錄熒光PCR方法，利用35個血清型的純培養甲型副傷寒和非傷寒沙門菌菌株、常見非沙門致腹瀉病原菌以及發熱為主要癥狀的8種常見病原菌RNA來評價該方法的特異性及敏感性，同時對甲型副傷寒沙門菌全血模擬標本進行檢測下限確定。結果表明，利用該方法檢測44株甲型副傷寒沙門菌均呈陽性，其余34種非傷寒沙門菌血清型、致腹瀉的其他5種腸道致病菌以及發熱為主要癥狀的8種常見非沙門菌擴增結果均為陰性，說明該方法的特異性、敏感性均較高，達100 %。在對純菌總RNA檢測中，逆轉錄熒光PCR的最低檢測限為5pg/反應，約為1900個拷貝/反應。在以全血模擬樣品提取核酸為模板的檢測中，最低檢測限達 40cfu/mL。
圖I為本發明逆轉錄熒光PCR擴增產物凝膠電泳圖；其中，I為陰性對照，2為傷寒沙門菌樣品，3為乙型副傷寒沙門菌，4為丙型副傷寒沙門菌，5為鼠傷寒沙門菌，6為腸炎沙門菌，7-29為甲型副傷寒沙門菌樣品，30為甲型副傷寒沙門菌陽性對照，M為DNA分子量Marker0
圖2為本發明逆轉錄熒光PCR檢測純菌RNA擴增曲線圖；其中，a h對應的模板濃度為，a :0.5 X 107pg/反應；b :0. 5 X 106pg/反應；c :0. 5 X 105pg/反應；d :0. 5 X 104pg/反應；e :0· 5 X 103pg/ 反應；f :0· 5 X 102pg/ 反應；g :0. 5 X IO1pg/ 反應；h :0. 5pg/ 反應；NC 陰性對照。圖3為本發明逆轉錄熒光PCR檢測血模擬標本擴增曲線圖；其中，a為陽性對照，b g 對應的模板濃度為，b 7X 105cfu/ml ；c 7X 104cfu/ml ；d 7X 103cfu/ml ；e 7X102cfu/ml ；f :7X lOcfu/ml ；g 7X10°cfu/ml ；NC :陰性對照。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。實施例甲型副傷寒沙門菌的逆轉錄熒光PCR檢測用引物的設計及檢測方法I材料與方法I. I實驗用菌株本實施例中使用的甲型副傷寒沙門菌44株，傷寒沙門菌、こ型和丙型副傷寒沙門菌以及其他31種非傷寒沙門菌血清型共57株(表I)，所有血清型均使用沙門菌抗血清(購自Statens Serum Institut, SSI,丹麥)進行血清型鑒定。另外，其他腸道常見病原菌及引起發熱并可在血液標本中分離到的肺炎鏈球菌、伯氏疏螺旋體、鉤端螺旋體、嗜肺軍團菌、腦膜炎奈瑟菌、立克次體、布魯氏菌等菌株(表I)用于特異性及敏感性評價，上述菌株均來自中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所。I. 2引物設計根據GenBank中hsdM基因的序列設計引物4289F 5’ -CCTGTTAGAAGTGTTTACAACTT-3’ 和 4289R :5’ -GCTAAACCACCAAATTGTGT-3’，用于逆轉錄熒光PCR反應。I. 3血模擬標本的制備及RNA提取取新鮮培養4-6小時的甲型副傷寒沙門菌(最終菌落計數為8. OX 108cfu/ml)，進行十倍梯度系列稀釋，取各稀釋度菌液3. 3ml分別與同體積新鮮人抗凝血混勻，室溫放置30分鐘后，作為全血模擬標本。利用QIAamp UCP PurePathogen Blood fieldtestKit(QIAGEN公司)對上述模擬標本進行甲型副傷寒沙門菌RNA的提取，具體操作步驟嚴格按照說明書進行。同時以不加菌的血液作為陰性對照平行進行RNA提取。最終提取的RNA溶解到50 μ I不含RNase的無菌純水中，取其中5 μ I作模板，進行逆轉錄熒光PCR反應。同時，取系列稀釋菌液進行菌落計數，測定模擬標本中準確細菌含量。I. 4純培養細菌RNA提取純菌RNA提取使用RNeasy Minikit (QIAGEN公司)，操作步驟均嚴格按照說明書進行。
I. 5逆轉錄熒光PCR使用One Step SYBR Primerscript RT-PCR Kit II (TaKaRa)進行逆轉錄突光PCR反應，以提取的病原菌RNA為模板，取5 μ I加入反應體系中，兩條引物各5pmol/L，使用CFX96熒光PCR儀，擴增條件為42°C 30分鐘；94°C 30秒，60°C 15秒，共45個循環。繪制溶解曲線，Ct值< 35的擴增結果判定為陽性。2 結果2. I甲型副傷寒沙門菌逆轉錄熒光PCR的特異性及敏感性檢測本實施例中一共對48種132株細菌進行了逆轉錄熒光PCR檢測(見表I)，其中44株甲型副傷寒沙門菌均呈陽性。沙門菌屬其他34種血清型擴增結果均為陰性。對其他常見腹瀉病原(霍亂弧菌、副溶血弧菌、志賀菌、致瀉性大腸埃希菌)擴增結果亦為陰性。而且，臨床其他常見發熱病原菌包括金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、伯氏疏螺旋體、鉤端螺旋體、嗜肺軍團菌、腦膜炎奈瑟氏菌、立克次體、布魯氏菌擴增結果均為陰性，表明本發明的逆轉錄熒光PCR引物具有較高的菌種和血清型特異性及敏感性，特異性及敏感性均達100%。逆轉錄熒光PCR反應后的凝膠電泳圖如圖I所示，陽性擴增產物大小為177bp。表I甲型副傷寒沙門菌逆轉錄熒光PCR特異性及敏感性檢測
權利要求
1.甲型副傷寒沙門菌(SalmonellaParatyphi A)的逆轉錄突光PCR檢測用引物,其特征在于，包括 正向引物5 ’ -CCTGTTAGAAGTGTTTACAACTT-3，和 反向引物5 ’ -GCTAAACCACCAAATTGTGT-3，。
2.含有權利要求I所述引物的用于檢測甲型副傷寒沙門菌(S.Paratyphi A)的試劑盒。
全文摘要
本發明提供一種甲型副傷寒沙門菌的逆轉錄熒光PCR檢測用引物，其包括5’-CCTGTTAGAAGTGTTTACAACTT-3’和5’-GCTAAACCACCAAATTGTGT-3’。本發明還提供含有所述引物的用于檢測甲型副傷寒沙門菌的試劑盒。本發明是針對甲型副傷寒沙門菌hsdM基因設計的特異性引物，用于檢測該靶基因的逆轉錄熒光PCR反應中，利用該方法檢測44株甲型副傷寒沙門菌均呈陽性，其余34種非傷寒沙門菌血清型、致腹瀉的其他5種腸道致病菌以及發熱為主要癥狀的8種常見非沙門菌擴增結果均為陰性，說明該方法的特異性、敏感性均較高，逆轉錄熒光PCR的最低檢測限為5pg/反應。
文檔編號C12Q1/68GK102634577SQ20121008368
公開日2012年8月15日 申請日期2012年3月27日 優先權日2012年3月27日
發明者樊粉霞, 閆梅英, 闞飆 申請人:中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所