枳mlo型抗白粉病基因快速鑒定的制作方法

專利名稱：枳mlo型抗白粉病基因快速鑒定的制作方法
技術領域：
本發明是借助于枳測序全基因組序列，利用植物比較基因組學、遺傳學、生物信息學和候選基因策略等方法快速鑒定枳白粉病基因，主要涉及到枳全基因組序列的下載，候選基因的鑒定，基因的比對，聚類等手段，進而鑒定出白粉病基因，屬于植物生物技術科學領域。
背景技術：
積(/7Oflcirw1S iri/b7iaia),又名鐵籬寨、臭橘、枸橘李、枸橘、臭杞。屬蕓香科金桔屬落葉灌木，在我國陜西、甘肅、河北、山東、江蘇、浙江、湖南、廣東等省份都有栽培，枳通體密布2cm左右的粗硬長刺，可隨意整形，是理想的果園防護籬或庭院綠籬材料。圓球形果，有香氣，泡茶、泡酒具有除風濕、順氣的功能。二至五年生苗木，可作為柑橘類的砧木，又可作綠籬，亦可作庭園觀賞樹種。生產上，枳樹容易感染各類細菌、真菌、病毒性病害，其中白粉病是蕓香科植物常見的一類真菌性病害，一旦感染此類病害，枳的葉片、嫩枝及幼果會逐漸形成白色的霉層，嚴重影響到了枳樹的光合作用，進而影響枳樹的生長發育。感染白粉病后，不僅使做為行道樹、綠籬的枳的美觀受到了影響，同時也使做為中藥成分幼果、種子，葉片等得經濟價值受到了影響。因此，有效地防治枳樹白粉病害，是促進枳產業順利發展、保障枳產業上新臺階的重要措施。近年來的研究表明，利用抗病基因選育抗病新品種是防治植物病害的一種有效手段。目前，將現代分子生物學技術應用于枳抗白粉病的研究，對抑制此類病害起著舉足輕重的作用。MLO型抗病基因是植物特異的一類抗病基因。研究者最早發現MLOresistance locus 2)基因對白粉病抗性是始于1937-1938年，由德國人在埃塞俄比亞采集了很多品種的大麥，其中的兩個株系對白粉病菌QUunwriei greiminis f. sp. hordei)所有己知的生理小種都具有高效抗性。進一步研究表明，大麥中MLO基因的隱性突變mlo可以使大麥對幾乎所有己知大麥白粉病菌的生理小種產生持久、廣譜的抗性。最近，研究者發現很多植物的抗白粉病基因都是MLO型基因控制，如番茄，豌豆、擬南芥、薔薇、辣椒、百脈根等等。因此挖掘植物中的MLO型抗病基因對植物抗白粉病育種具有重要的作用。目前，常用挖掘抗病基因常用的方法有圖位克隆，轉座子標簽等方法。但是由于枳的基礎研究不夠深入，因此利用這些方法不僅時間長而且很難準確地克隆這些基因。因此，如何快速鑒定枳中的MLO型抗病基因將成為枳抗白粉病育種的重要前提。植物比較基因組學(Comparative Genomics)是基于基因組圖譜和測序基礎上,對已知的基因和基因組結構進行比較，來了解基因的功能、表達機理和物種進化的學科。利用模式植物基因組與其它植物基因組之間編碼順序上和結構上的同源性，克隆其他植物基因，揭示基因功能和分子機制，闡明物種進化關系及基因組的內在結構。本專利所采用的方法及思路模式植物擬南芥基因組研究已經揭示了 MLO型基因的功能，利用基因其順序上的同源性克隆枳MLO型抗病基因，根據模式植物擬南芥實驗系統上的優越性和已知MLO型抗病基因的特點，快速“捕捉”枳抗白粉病基因。近年來，枳基因組測序的完成為我們快速挖掘枳白粉病基因提供了條件。本專利介紹了以枳全基因組序列為前提，結合比較基因組學、遺傳學、基因組學、生物信息學和候選基因策略等知識，快速挖掘白粉病基因。

發明內容
技術問題
本發明的目的是提供一種通過結合植物比較基因組學、植物遺傳學、基因組學和生物信息學等知識，快速挖掘枳抗白粉病基因。其結果一方面可用于枳白粉病基因緊密連鎖分子標記的開發，進行分子標記輔助選擇育種，另一方面也為其他作物白粉病基因鑒定提供參考依據。技術方案
主要原理第一個植物抗白粉病基因(MLO)是從大麥中克隆的，研究發現此基因是一類特殊的抗病基因，不同于先前克隆的大多數NBS (nucleotide-binding site)類型抗病 基因；隨后，研究者相繼從番茄、擬南芥、豌豆、辣椒、百脈根等植物中克隆了白粉病基因，研究發現這些基因編碼的都是MLO型抗病基因。隨后，眾多研究者通過多次試驗證實MLO型抗病基因已經成為植物特有的一類抗白粉病基因。進一步發現，植物MLO類型基因是一個基因家族；而且對來源于不同物種的MLO基因家族進行系統發育關系分析發現，不同物種中抗白粉病基因總是聚類一起，成為一類，這一類MLO基因都具有抗白粉病基因序列的典型特征。枳基因組測序的完成為挖掘白粉病基因提供了一條便利途徑。因此，可以借助于已經測序的枳全基因組中MLO基因家族和已經克隆的MLO白粉病基因的系統發育關系以及對于維持白粉病基因MLO重要功能的氨基酸保守性來鑒定枳白粉病基因。主要步驟如下
O枳全基因組序列的下載及其MLO型基因的采集
首先從積測序基因組數據庫(http://www. phytozome. net/search, php)下載積全基因組序列；使用“DNAT00LS”軟件對獲得的枳全基因組氨基酸序列數據建立數據庫，然后用pfam 數據庫(蛋白家族數據庫，http://pfam.janelia.org/search/sequence)中的隱馬爾可夫模型(HMM)對MLO結構域的氨基酸序列與已建立的枳全基因組氨基酸序列數據庫進行Blastp (E_value=0. 001)序列比對,初步篩選出候選基因序列。其次，利用已經公布的MLO型基因序列，對枳基因組數據庫進行BLAST比對，獲得候選基因序列。2)枳MLO型基因家族的鑒定
將上述結果中得到的同源核苷酸序列的候選基因，通過Pfam(E-Value=LO)進行分析，去除無‘ML0’結構域的基因序列(圖I)。再將候選抗病基因序列通過MEGA3. I軟件提供的ClustalW工具(多序列比對程序)進行多序列比對，去除重復序列。3)通過植物MLO型基因的系統發育關系鑒定候選的枳MLO型白粉病基因
由于先前的研究已經證明，雙子葉植物MLO型白粉病基因位于植物MLO基因系統發育樹同一區組，因此在系統發育關系研究中，我們把擬南芥的MLO型基因家族和一些其他作物的MLO型抗白粉病基因和枳MLO型基因一起聚類分析，以獲得候選的枳抗白粉病基因(圖2)。4)枳白粉病基因與已知的植物MLO白粉病基因的比對
利用BioXM 2.6軟件將枳候選的MLO型白粉病基因和擬南芥、番茄、豌豆、大麥的MLO白粉病基因的氨基酸序列轉換成Fasta格式的文件，將這些文件導入BioEdit 7. O軟件，運用此軟件中Clustal軟件進行多序列比對，揭示候選白粉病基因重要氨基酸殘基及區域的保守性。從而進一步鑒定枳候選的白粉病基因(圖3)。本發明的積極效果
O縮短了枳白粉病基因挖掘周期，有利于白粉病基因的快速鑒定。采用常規方法(圖位克隆、轉座子標簽等)挖掘抗白粉病基因不僅耗時耗力、效率低，且難以成功。本發明基于植物比較基因組學、遺傳學、生物信息學方法快速挖掘枳白粉病基因，不僅可以縮短時間，還可以提聞白粉病基因鑒定效率。2)積(CYtras是全世界重要果樹之一。由于積遺傳基礎狹窄,種質資源多樣性低，因此通過常規的分子標記(RAPD、ISSR、SSR、AFLP等)鑒定枳白粉病基因比較困難。通過鑒定的候選白粉病基因開發相應的共分離功能性標記(SNP、SCAR等)，可以快速的用于抗病基因的分子標記輔助選擇，準確性高。 3)多抗性育種材料的創制。基于新鑒定的白粉病基因開發的功能性分子標記，結合已經定位的其他抗病基因的分子標記，進行多抗性育種材料的創制，可以縮短育種年限，提聞育種效率。4)為闡述枳抗白粉病分子機制奠定了基礎。枳抗白粉病基因的鑒定，通過轉基因技術、RNAi、病毒誘導的基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)技術等研究抗白粉病的分子機制提供了基因資源，有利于快速闡述枳抗白粉病的作用機理。


圖I枳MLO基因的鑒定；
本圖顯示的是15個MLO型基因鑒定結果，每一個基因都含有一個‘ML0’保守結構域。圖2植物MLO基因家族的系統發育關系分析及其枳MLO型白粉病基因的鑒定； 擬南芥是植物科學研究的模式植物，在構建系統發育樹中，擬南芥的15個MLO型基因
(其中3個基因是白粉病基因AtML002，AtML006和AtML012)、番茄抗白粉病基因(SlMLO)、大麥白粉病基因(HvMLO和HvML002)和豌豆的白粉病基因(PsMLO)被選擇用來和枳MLO型基因聚類分析。共鑒定出2個枳候選的MLO型白粉病基因。圖中斜體標記的基因就是候選枳白粉病基因。圖3枳MLO型白粉病基因的比對分析；
2個枳白粉病基因與大麥(HvMLO)、番茄(SlMLO)、豌豆(PsMLO)、擬南芥白粉病基因(AtML002, AtML006和AtML012)進行比對，鑒定白粉菌侵染有重要作用的氨基酸殘基和區域的保守型。圖中TM1-TM7表示枳MLO型白粉病基因的7個轉模區域；黑色圓點表示白粉菌侵染重要的氨基酸殘基；CaMBD表示鈣調蛋白結合區；1和II表示對白粉菌侵染重要的氨基酸區域。
具體實施例方式抗病基因的鑒定在作物抗病遺傳理論研究和抗病品種選育中具有重要的作用。本方法可以快速鑒定出枳白粉病基因。具體實施過程如下
I)枳MLO型基因的采集及鑒定為了獲得枳全部的MLO型基因家族成員，我們首先以擬南芥的MLO型基因，番茄、豌豆、辣椒、薔薇、辣椒、百脈根的抗白粉病MLO基因序列構建HMM模型，從枳基因組序列中收索MLO型基因；其次以不同作物中已經發表的MLO基因序列作為靶序列(來自DFCI數據庫TC171015, TC267529, DFCI: TC327983, TC289653, TC312087, TC132500,TC133436, TC317623, TC317025, TC315947, TC325903, TC315944, TC315912,TC322759, TC322059, TC330654, TC282713, TC293173, TC281861, TC283253, TC283383,TC285032, TC290021, TC302716, TC283487, TC282866, TC283441, TC281428, TC285118,TC285090;來自 GenBank 數據庫AY967408, AF384145, AF384144, AY029312-AY029315,AY029317-AY029319, Z95352, AF369563-AF369565, AF369567, AF369569-AF369576，Z83834, Z95496, AY581255),對積數據庫(http://www. phytozome. net/search, php)進行BLAST比對，選擇相似度最高的序列進行下載，共獲得了 15條候選的MLO型基因(clementineO.9_006901m. g; clementineO. 9_006033m. g; clementineO.9_012720m.g; clementineO.9_008824m. g; clementineO. 9_006619m. g; clementineO. 9_033633m.、g; clementineO. 9_006879m. g; clementineO. 9_005881m. g; clementineO. 9_035489m.g; clementineO. 9_029589m. g; clementineO. 9_034343m. g; clementineO. 9_007893m. g;clementineO. 9_006207m. g; clementineO. 9_007846m. g; clementineO. 9_007868m. g;)。2)枳MLO型基因家族的鑒定
為了進一步驗證這些MLO基因準確性，我們對這15個候選的MLO基因進行了保守結構域“ML0”的鑒定。以每一個候選的MLO型基因的氨基酸序列為基準，在PFAM(http://pfam.sanger. ac.uk/)網站上進行‘ML0’保守結構域的鑒定,具體結果見圖I。3)枳MLO型基因的系統發育關系分析
在先前的研究中，發現雙子葉植物白粉病基因聚合成一個區組；因此，在構建系統發育樹中，我們選擇了模式植物擬南芥的15個MLO型基因(其中3個基因是白粉病基因AtML002，AtML006和AtMLOl2 )、番茄抗白粉病基因、大麥白粉病基因和豌豆的白粉病基因和枳MLO型基因聚類分析一起聚類分析。將枳MLO型基因和其他作物白粉病基因蛋白質序列進行多序列聯配(采用Clustal X I. 83軟件進行),并利用Genedoc軟件(http://www.nrbsc. org/gfx/genedoc/index, html)顯示多序列聯配的結果。將Clustal多序列聯配的結果輸出到MEGA 4.0軟件中，并利用此軟件分別構建了鄰接樹(neighbor-joining, NJ),利用Bootstrapping方法對這些進化樹進行了評估。結果發現在雙子葉植物抗白粉病基因區組內，存在2個枳候選的MLO型白粉病基因(見圖2 )。4)枳MLO型抗病基因的比對
在大麥MLO型白粉病基因研究中，研究中相繼發現了一些重要區域和單個氨基酸，它們對大麥白粉菌侵染有著不可替代的作用。為了鑒定2個候選的枳白粉病基因中，這些重要區域和氨基酸是否高度保守，我們對來自擬南芥的3個抗白粉病基因(AtML002、AtML06和AtML012)、番茄白粉病基因(S1ML0)、豌豆白粉病基因(PsMLO)進行了比對分析。發現枳2個候選的白粉病基因與已知的MLO型白粉病基因7個跨膜區，30個重要的氨基酸，I個鈣調蛋白結合區(CaMBD)和兩個重要的區域(I和II)高度保守(圖3)。
權利要求
1.枳抗白粉病基因，其特征在于選自下列2個基因或其之一 clementineO. 9—006033m. g 氨基酸MAGASGGRSLEETPTWAVAVVCFVLVTISIIIEHIIHLIGKWLTKKHKRALYEALEKIKSELMLLGFISLLLTVAGSWISKICIPESVANTWHPCDKEREAELNNEKETTEQETTEHENRRRLLAAVAASGGSIRRALAAGSTTDKCSKGKVPFVSEDGLHQLHIFIFVLALFHVLYSILTMALSRAKMKKWKKWEKETRTIEYQFSHDPERFRFARETSFGRRHLSSWTKTPVLIWIVCFFRQFVRSVPKVDYLTLRHGFVTAHLAPQSHTQFNFQKYINRSLEEDFKVVVGISPLIWFFAVVFLLFNTHGWYAYLWLPFIPLIVILLVGTKLQVIITKMGIRIQERGEVLKGVPVVQLGDDLFWFSQPRLILYLINFVLFQNAFQLAFFAWSWFEFGIESCFHEHTEDIVIRITMGVLIQILCSYVTLPLYALVTQMGSNMKPTIFNERVAAALKNWHHTAKKHIKQNKGSVTPLSSRPSTPSYNMSPVHLLRHYRGEMDSVQTSPRRSMEQYLDSESPSPSHTFHGEGSSPHHIEQGFYIEYNKGANDPGPSQQHEIDIVTTKEFSFDKRTIT核苷酸ATGGCCGGAGCTAGCGGAGGAAGATCTTTGGAGGAGACGCCGACATGGGCCGTTGCGGTCGTTTGTTTTGTTTTGGTTACGATTTCAATAATTATCGAGCACATAATCCATCTTATCGGAAAGTGGCTGACAAAGAAACACAAGAGAGCTTTATACGAAGCACTCGAAAAGATCAAATCAGAGTTGATGCTACTGGGGTTCATATCGTTGCTACTAACAGTAGCAGGTAGTTGGATATCAAAAATATGCATACCAGAAAGTGTAGCAAATACATGGCATCCATGCGATAAGGAAAGAGAAGCAGAGCTAAACAATGAGAAGGAGACTACTGAACAAGAAACGACAGAACACGAAAACCGCCGGAGGCTTCTGGCGGCGGTGGCCGCCTCGGGTGGAAGTATCCGAAGAGCTTTGGCGGCGGGATCAACAACCGACAAATGTTCCAAGGGCAAAGTTCCATTTGTGTCTGAGGACGGTCTCCATCAACTCCATATTTTCATCTTTGTCTTAGCACTTTTCCATGTCCTTTACAGTATCCTTACAATGGCCTTGAGCAGAGCCAAGATGAAGAAGTGGAAGAAATGGGAAAAGGAAACAAGAACCATTGAGTATCAGTTCTCTCACGATCCTGAGAGGTTCAGATTTGCAAGAGAGACATCGTTTGGCAGGAGGCATTTGAGTTCGTGGACCAAGACACCTGTCCTCATTTGGATAGTTTGTTTCTTCAGGCAATTTGTTCGGTCGGTTCCCAAGGTTGATTACTTAACTCTCAGGCATGGATTTGTCACGGCACATTTGGCACCACAAAGCCATACCCAATTTAACTTCCAAAAATACATCAATAGGTCACTGGAAGAGGATTTCAAGGTGGTTGTGGGAATCAGTCCATTAATCTGGTTCTTCGCAGTGGTGTTTCTGCTTTTCAACACTCATGGCTGGTATGCTTATCTATGGCTACCCTTTATCCCATTAATTGTGATCTTGCTGGTGGGAACCAAGCTGCAAGTGATCATAACCAAAATGGGAATTAGAATTCAAGAAAGAGGAGAAGTTCTAAAGGGAGTTCCAGTAGTTCAGCTTGGTGATGACCTGTTTTGGTTCAGTCAGCCTCGCCTCATTCTTTATCTCATCAACTTTGTTCTCTTTCAGAACGCCTTTCAGCTAGCTTTCTTTGCATGGAGTTGGTTTGAGTTCGGGATCGAATCTTGTTTCCATGAGCATACAGAGGACATAGTCATCAGAATCACAATGGGGGTCCTCATTCAGATACTTTGCAGCTATGTCACTCTCCCACTCTATGCCCTGGTAACTCAGATGGGTTCAAATATGAAACCAACCATATTCAACGAAAGAGTAGCAGCAGCTCTAAAGAATTGGCATCATACAGCCAAAAAACACATTAAACAAAACAAAGGGTCTGTGACACCTTTGTCCAGCAGGCCATCCACCCCATCCTACAACATGTCTCCGGTGCACCTCCTCCGCCATTACCGGGGCGAAATGGACAGCGTCCAGACGTCACCGAGAAGATCCATGGAGCAGTATTTGGACTCCGAGTCACCGTCTCCGTCGCACACGTTCCACGGCGAAGGCTCATCGCCACACCACATTGAACAAGGTTTCTACATAGAATATAACAAGGGTGCAAATGACCCGGGGCCTAGCCAACAACATGAGATCGATATTGTAACAACGAAAGAATTTTCGTTTGATAAGAGGACAATTACATAAclementineO. 9_012720m. g氨基酸MKKWKAWENETKTIEYQYYNDPERFRFARDTSFGRRHLNIffSKSSISLWIVCFFRQFLGSVNKIDYHTLRHGFIMAHLAPGSETKFDFQKYISRSLEEDFKDVVGITPILWFIATLFLLTNTHGWFAYLffLPFIPLFIILLVGAKLQVIITKLGLRIQERGDVVKGAPVVQP⑶DLFWFGRPRFILFLIHLVLFQNAFQLAFFSffSTYEFALKSCFHKKTEDIAIRISMGVLIQILCSYVTLPLYALVTQMGSTMKPTIFNDRVAAALKNWHHIAKKHTKQGRLSGSNTPMSSRPQTPTHGMSPVHLLHNYPNSSYHSNFEHEHWDPENQIRSPRHHREIMNESPPHYAESSEQEVAALEEPRQIEMQLPPGPGFIHTHHEFSFGK 核苷酸 ATGAAGAAATGGAAGGCATGGGAGAATGAGACAAAGACAATTGAGTACCAATACTACAATGATCCAGAAAGGTTTCGGTTTGCAAGGGACACTTCATTTGGTCGTAGGCATTTGAATATTTGGAGTAAATCATCAATCAGCTTGTGGATTGTTTGCTTCTTCAGGCAATTCCTTGGATCTGTTAACAAAATTGATTACCACACACTGAGACATGGATTCATCATGG CTCATTTGGCTCCTGGAAGTGAAACAAAATTCGATTTTCAGAAATACATCAGCAGATCGCTTGAAGAAGATTTCAAAGATGTTGTGGGAATAACTCCAATTCTATGGTTCATTGCAACGTTGTTCTTGCTCACCAATACACATGGATGGTTTGCTTACTTGTGGTTACCATTTATCCCCTTATTTATAATTCTGTTGGTGGGGGCTAAGCTACAAGTGATCATAACGAAACTGGGGCTGAGAATTCAAGAGAGAGGTGATGTGGTGAAGGGGGCACCTGTGGTTCAGCCTGGTGATGACCTTTTCTGGTTCGGACGCCCGCGGTTCATTCTCTTTCTCATTCACTTGGTTCTTTTTCAGAATGCATTTCAGCTGGCATTTTTCAGTTGGAGCACGTATGAATTTGCGCTTAAATCTTGCTTCCACAAGAAAACTGAGGATATAGCTATCAGAATCTCAATGGGGGTGCTCATTCAGATTCTATGCAGTTATGTGACACTACCTCTATATGCCTTAGTGACACAGATGGGATCTACAATGAAACCAACAATATTTAATGATAGAGTGGCAGCAGCACTGAAAAACTGGCACCATATTGCCAAAAAACACACAAAACAGGGCAGGCTTTCTGGGAGTAACACACCAATGTCAAGCAGGCCACAAACTCCTACACATGGAATGTCACCGGTCCATCTCTTGCATAATTACCCGAACAGCAGCTACCACTCGAACTTCGAGCACGAGCATTGGGATCCCGAGAATCAGATTCGTTCGCCGCGCCACCACCGCGAGATCATGAATGAGTCTCCTCCACATTATGCAGAATCTAGTGAACAAGAAGTGGCAGCACTTGAAGAGCCTAGGCAAATTGAAATGCAGCTGCCTCCAGGTCCCGGATTCATTCATACACATCACGAATTTTCATTTGGGAAATGAo
2.權利要求I所述快速鑒定枳白粉病基因的應用，包括 1)育種材料的創制； 2)抗白粉病的育種實踐； 3)抗白粉病基礎理論研究。
全文摘要
本發明是快速鑒定枳抗白粉病基因；涉及到植物比較基因組學，遺傳學和生物信息學等學科知識，屬于植物生物技術科學領域。該發明主要步驟為1)枳全基因組序列的下載及MLO型基因的采集；2)MLO型基因的鑒定；3)MLO型基因系統發育關系；4)MLO型白粉病基因的比對。該發明有效的縮短了枳白粉病基因挖掘周期，有利于白粉病基因的快速鑒定；通過鑒定的候選白粉病基因開發相應的共分離功能性標記(SNP、SCAR等)，還可以快速的用于抗白粉病基因的分子標記輔助選擇，準確性高；結合其它抗病基因分子標記可進行多抗性育種材料的創制，縮短育種年限，提高育種效率；為闡述枳抗白粉病分子機制奠定了基礎。
文檔編號C12Q1/68GK102703464SQ20121009515
公開日2012年10月3日 申請日期2012年3月31日 優先權日2012年3月31日
發明者袁偉, 錢孝英 申請人:常熟市支塘鎮新盛技術咨詢服務有限公司