專利名稱：輔助鑒定抗白粉病植物的方法及其專用引物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種輔助鑒定抗白粉病植物的方法及其專用引物。
背景技術：
小麥是我國的重要糧食作物，與國家糧食安全、國民經濟發展、社會穩定和人民生活水平的提高有著密切的關系。小麥白粉病是一種世界性的小麥病害。隨著矮桿和半矮稈小麥品種的推廣和水肥條件的改善，種植密度的加大，造成麥田郁閉，使得白粉病在我國造成的危害日益嚴重，發病面積和范圍不斷擴大，已由次要病害上升為主要病害，對我國的糧食生產及安全造成了嚴重威脅。選育并推廣抗病品種已被公認為是防治小麥白粉病最為經濟、有效和安全的途徑，而選育抗病品種的關鍵在于不斷發掘和有效利用新的抗源。培育含有多個抗白粉病基因的小麥品種是拓寬抗譜、提高抗性和維持抗性的有效途徑之一。因此，發掘新的抗病基因及其緊密連鎖的分子標記，及時開展新抗病基因的定位工作，對于分子輔助育種具有重要
眉、οSSR標記又稱微衛星(Microsatellite)標記，是由一組1 6個核苷酸串聯在一起的、重復次數介于5 10之間的簡單重復序列。它們普遍存在于高等生物中，并隨機分布于整個基因組中，由于其重復次數不同而形成DNA序列的多態性。每個SSR座位的兩側一般是相對保守的單拷貝序列，因此這種串聯重復序列的多態性可以十分容易地通過兩端的保守序列設計特異引物進行PCR擴增檢測。SSR分子標記技術具有以下特點(1)位點多、數量豐富，覆蓋整個染色體組；(2) 每個位點均有許多等位形式，多態性高；C3)多數是共顯性標記，能夠區分純合及雜合基因型，從而提供單個位點上較完整的遺傳信息；⑷對模板DNA的質量要求不高，DNA用量少， 易于利用PCR技術分析；(5)操作簡單，結果重復性好；(6)多數SSR標記染色體位置已知， 可以方便地應用到基因定位、外源遺傳物質鑒定等研究中。小麥SSR標記具有小麥近緣種屬間、屬內的可轉移性，即大部分根據普通小麥的序列信息設計的SSR引物也可以在小麥的近緣種屬中發揮作用，擴增出正常的DNA片段。Li等Q009)利用SSR標記對來自野生二粒小麥材料IW2的抗白粉病基因進行分析，發現該抗白粉病基因位于SSR標記)(barC84和Xwmc687之間，遺傳距離分別為3. 2cM和 2. OcM，利用中國春缺體-四體系、雙端體系、缺失系材料將該基因定位于染色體3BL上，將抗白粉病基因命名為Pm41。Hua等Q009)利用SSR標記對來自于野生二粒小麥的普通小麥抗白粉病品系P63中進行分析，發現該抗白粉病基因位于SSR標記Xwmc257和Xgwml48 之間，遺傳距離分別為16cM和6. 7cM，并將該基因定位于染色體2BS上，該抗白粉病基因被命名為Pm42。
發明內容
本發明的目的是提供一種輔助鑒定抗白粉病植物的方法及其專用引物。
本發明提供了引物對甲OCcfd50引物對)在制備輔助鑒定白粉病抗病植物的試劑盒中的應用；所述引物對甲是由序列表的序列1所示單鏈DNA和序列表的序列2所示單鏈 DNA組成的引物對。所述植物為小麥。所述小麥具體可為小麥材料87-1、小麥材料IW132、 小麥材料農大212、小麥材料農大211、以小麥材料87-1與小麥材料IW132為初始親本獲得的后代(包括雜交后代、回交后代)、所述后代與小麥材料農大212(或小麥材料農大211) 的雜交后代及其自交子代。本發明還保護所述引物對甲和引物對乙(XMag633引物對)在制備輔助鑒定白粉病抗病植物的試劑盒中的應用；所述引物對乙是由序列表的序列3所示單鏈DNA和序列表的序列4所示單鏈DNA組成的引物對。所述植物為小麥。所述小麥具體可為小麥材料87-1、 小麥材料IW132、小麥材料農大212、小麥材料農大211、以小麥材料87_1與小麥材料IW132 為初始親本獲得的后代(包括雜交后代、回交后代)、所述后代與小麥材料農大212(或小麥材料農大211)的雜交后代及其自交子代。本發明還保護一種輔助鑒定白粉病抗病植物的試劑盒，包括所述引物對甲。所述試劑盒還可包括所述引物對乙。本發明還保護所述引物對甲在輔助鑒定白粉病抗病植物中的應用。本發明還保護所述引物對甲和所述引物對乙在輔助鑒定白粉病抗病植物中的應用。本發明還保護一種輔助鑒定白粉病抗病植物的方法，包括步驟甲；所述步驟甲包括如下步驟以待測植物的基因組DNA為模板，用所述引物對甲進行PCR擴增；如果PCR擴增產物中具有兩條特異性片段，待測植物為候選的白粉病抗病植物；如果PCR擴增產物中不具有所述兩條特異性片段，待測植物為候選的白粉病感病植物；所述兩條特異性片段中的一條為 505-5Mbp，另一條為 485-4%bp。所述方法還可包括步驟乙；所述步驟乙包括如下步驟以待測植物的基因組DNA 為模板，用所述引物對乙進行PCR擴增；如果PCR擴增產物中具有一條特異性片段，待測植物為候選的白粉病抗病植物；如果PCR擴增產物中不具有所述一條特異性片段，待測植物為候選的白粉病感病植物；所述一條特異性片段為565-57^p的DNA片段。所述植物為小麥。所述小麥具體可為小麥材料87-1、小麥材料IW132、小麥材料農大212、小麥材料農大211、以小麥材料87-1與小麥材料IW132為初始親本獲得的后代(包括雜交后代、回交后代)、所述后代與小麥材料農大212(或小麥材料農大211)的雜交后代及其自交子代。將所述步驟甲和所述步驟乙的鑒定結果可進行相互驗證。如果同一所述待測植物在所述步驟甲和所述步驟乙中的鑒定結果一致，該待測植物為進一步確定的候選的白粉病抗病植物或進一步確定的候選的白粉病感病植物。如果同一所述待測植物在所述步驟甲和所述步驟乙中的鑒定結果不一致，可結合其它現有方法確定該待測植物對白粉病的抗感性。野生二粒小麥(Triticumdicoccoides, 2n = 4X = 28，AABB)是普通小麥的二級基因源，對小麥葉銹病、稈銹病和白粉病具有良好的抗性，在小麥抗病性遺傳改良中有著巨大的應用潛力。野生二粒小麥是普通小麥的四倍體祖先種，與普通小麥雜交容易成功，雜種Fl部分或完全可育，其抗病性可以通過雜交和回交等方法便捷地轉移到普通小麥中。因此，充分發掘野生二粒小麥的白粉病抗源，并將其導入到普通小麥中，對于提高小麥抗病基因的多樣性及基因累加，具有重要的現實意義。抗白粉病基因M17K65的發現也進一步證實了野生二粒小麥在普通小麥抗白粉病上的作用，也為小麥新品種的選育提供了依據。本發明篩選到了 2個與抗白粉病基因M17K65緊密連鎖的分子標記)(Cfd50和Xmag633。該兩個標記可有效地用于M17K65基因的標記輔助選擇。以該標記為路標，可以進行M17K65基因的精細定位或通過染色體步移法接近M17K65基因，從而為M17K65基因的克隆打下基礎。應用本發明提供的引物組合物和方法，可以輔助鑒定白粉病抗性植物，具有操作簡便、成本低廉、可以實現早期選育的優點。本發明的引物組合物和方法可以用于植物遺傳育種，對于培育抗白粉病植物新品種具有重大價值。
圖1為應用)(cfd50引物對PCR鑒定7K65/農大211-F2代植株的結果。圖2為應用)(Cfd50引物對PCR鑒定7K65/農大212-F2代植株的結果。圖3為應用XMag633引物對PCR鑒定7K65/農大211-F2代植株的結果。圖4為應用XMag633引物對PCR鑒定7K65/農大212-F2代植株的結果。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。小麥材料87-1(易感染小麥白粉病的普通小麥)河北省邯鄲農科院；公眾可以從中國農業大學獲得；參考文獻張連松，華為，關海英，李根橋，張宏濤，解超杰，楊作民，孫其信，劉志勇野生二粒小麥導入普通小麥的抗白粉病基因MlffE^分子標記定位，作物學報 2009，35(6) :998-1005。小麥材料IW132(高抗白粉病的野生二粒小麥)以色列海法大學；公眾可以從中國農業大學獲得；參考文獻解超杰，孫其信，楊作民以色列野生二粒小麥苗期抗病性鑒定。麥婁作物學報2003，23 (2) :39 42。小麥材料Morocco (易感染小麥白粉病的普通小麥)公眾可以從中國農業大學獲得；參考文獻劉慧遠，K Suenaga，何中虎，王竹林，梁閃閃，馬均，M Bernard, PSourdille， 夏先春普通小麥白粉病成株抗性的QTL分析。作物學報2006,32( :197_202。小麥材料農大212(易感染小麥白粉病的普通小麥)中國農業大學農學與生物技術學院小麥組培育小麥新品種，公眾可從北京市通州區種子公司購得。小麥材料農大211(易感染小麥白粉病的普通小麥)中國農業大學農學與生物技術學院小麥組培育小麥新品種，公眾可從北京市通州區種子公司購得。小麥材料薛早(易感染小麥白粉病的普通小麥)北京市農科院作物所；公眾可以從中國農業大學獲得；參考文獻張連松，華為，關海英，李根橋，張宏濤，解超杰，楊作民， 孫其信，劉志勇野生二粒小麥導入普通小麥的抗白粉病基因MlTO^分子標記定位。作物學報 2009，35(6) :998-1005。
E09號生理小種中國農科院植保所；公眾可以從中國農業大學獲得；參考文獻 張連松，華為，關海英，李根橋，張宏濤，解超杰，楊作民，孫其信，劉志勇野生二粒小麥導入普通小麥的抗白粉病基因MlTO^分子標記定位。作物學報2009，35 (6) :998_1005。植物對小麥白粉病致病菌的抗性和感性的劃分依據于接種小麥白粉病致病菌后植物的苗期反應型，分級標準見表1。表1接種小麥白粉病致病菌后植物的苗期反應型分級標準(Liu et al. 1999)
權利要求
1.引物對甲在制備輔助鑒定白粉病抗病植物的試劑盒中的應用；所述引物對甲是由序列表的序列1所示單鏈DNA和序列表的序列2所示單鏈DNA組成的引物對。
2.引物對甲和引物對乙在制備輔助鑒定白粉病抗病植物的試劑盒中的應用；所述引物對甲是由序列表的序列1所示單鏈DNA和序列表的序列2所示單鏈DNA組成的引物對； 所述引物對乙是由序列表的序列3所示單鏈DNA和序列表的序列4所示單鏈DNA組成的引物對。
3.一種輔助鑒定白粉病抗病植物的試劑盒，包括引物對甲；所述引物對甲是由序列表的序列1所示單鏈DNA和序列表的序列2所示單鏈DNA組成的引物對。
4.如權利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括引物對乙；所述引物對乙是由序列表的序列3所示單鏈DNA和序列表的序列4所示單鏈DNA組成的引物對。
5.引物對甲在輔助鑒定白粉病抗病植物中的應用；所述引物對甲是由序列表的序列1 所示單鏈DNA和序列表的序列2所示單鏈DNA組成的引物對。
6.引物對甲和和引物對乙在輔助鑒定白粉病抗病植物中的應用；所述引物對甲是由序列表的序列1所示單鏈DNA和序列表的序列2所示單鏈DNA組成的引物對；所述引物對乙是由序列表的序列3所示單鏈DNA和序列表的序列4所示單鏈DNA組成的引物對。
7.一種輔助鑒定白粉病抗病植物的方法，包括步驟甲；所述步驟甲包括如下步驟以待測植物的基因組DNA為模板，用引物對甲進行PCR擴增；如果PCR擴增產物中具有兩條特異性片段，待測植物為候選的白粉病抗病植物；如果 PCR擴增產物中不具有所述兩條特異性片段，待測植物為候選的白粉病感病植物；所述兩條特異性片段中的一條為505-5Mbp，另一條為485-4%bp ；所述引物對甲是由序列表的序列1所示單鏈DNA和序列表的序列2所示單鏈DNA組成的引物對。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于所述方法還包括步驟乙；所述步驟乙包括如下步驟以待測植物的基因組DNA為模板，用引物對乙進行PCR擴增；如果PCR擴增產物中具有一條特異性片段，待測植物為候選的白粉病抗病植物；如果 PCR擴增產物中不具有所述一條特異性片段，待測植物為候選的白粉病感病植物；所述一條特異性片段為5635-575bp的DNA片段；所述引物對乙是由序列表的序列3所示單鏈DNA 和序列表的序列4所示單鏈DNA組成的引物對。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于如果同一所述待測植物在所述步驟甲和所述步驟乙中的鑒定結果一致，該待測植物為進一步確定的候選的白粉病抗病植物或進一步確定的候選的白粉病感病植物。
10.如權利要求1或2或5或6所述的應用，或如權利要求 3或4所述的試劑盒，或如權利要求7至9中任一所述的方法，其特征在于所述植物為小麥。
全文摘要
本發明公開了一種輔助鑒定抗白粉病植物的方法及其專用引物。本發明提供的專用引物包括序列表的序列1和序列2所示DNA組成的Xcfd50引物對，還可包括序列表的序列3和序列4所示DNA組成的XMag633引物對。本發明提供的專用引物可用于輔助鑒定白粉病抗病植物。應用本發明提供的引物組合物和方法，可以輔助鑒定白粉病抗性植物，具有操作簡便、成本低廉、可以實現早期選育的優點。本發明的引物組合物和方法可以用于植物遺傳育種，對于培育抗白粉病植物新品種具有重大價值。
文檔編號C12Q1/68GK102559911SQ20121003503
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月16日 優先權日2012年2月16日
發明者倪中福, 劉志勇, 孫其信, 楊作民, 沈紅霞, 解超杰, 辛明明 申請人:中國農業大學