專利名稱：二化螟魚尼丁受體基因CsRyR及其編碼的蛋白和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學、細胞生物學以及農藥學領域，主要是一種在二化螟中表達的魚尼丁受體基因(核酸序列)及其編碼蛋白。本發明還涉及該蛋白和受體基因(核酸序列)的制備方法和用途。
背景技術：
魚尼丁受體(RyR)的命名來自于從南美的一種大風子科的豆科植物Ryaniaspeciosa中分離出來的植物堿殺蟲劑魚尼丁(ryanodine)。研究證明，魚尼丁是通過作用于RyR而產生殺蟲效果的(Fill and Copello，2002)。但 由于其結構復雜，難于改造，成本高和毒性高等因素，因而限制了其作為殺蟲劑的使用。經過長期研究，日本農藥終于(NihonNohyaku)發現了鄰苯二甲酰胺類化合物(phthalic diamides)的殺蟲活性,并從中商品化了氟蟲酰胺(Tohnishi et al.，2005)。幾乎同時美國杜邦對也該類化合物做了較大結構改變和修飾，發現了一類新的鄰甲酰氨基苯甲酰胺類(anthranilic diamides)殺蟲劑,并從中商品化了氯蟲酰胺(Lahm et al.，2005)。該化合物不僅在結構上與氟蟲酰胺相似，即都具有二酰胺基元，故稱它們為二酰胺類殺蟲劑，而且都作用于RyR。這類殺蟲劑是一類對鱗翅目等害蟲高效，對哺乳動物低毒、安全，作用機理獨特，無交互抗性和對環境友好的新型殺蟲劑。在農藥發展史上，該類殺蟲劑是繼以吡蟲啉為代表的新煙堿類殺蟲劑后的又一個新的突破(Nauen，2006)。所以目前包括杜邦、拜耳等在內的農化巨頭們正在繼續加緊開發二酰胺類殺蟲劑，同時試圖篩選更多作用于RyR的新穎化學結構的殺蟲活性物質(Lahm etal. ,2009)。細胞內游離Ca2+濃度的改變是細胞生理功能的重要物質基礎，它的變化是Ca2+跨膜轉運和細胞內鈣庫釋放、攝取Ca2+等動態平衡的結果。RyR和三磷酸肌醇受體(IP3R)(Berridge,1993)共同組成了兩類主要的位于細胞內質網/肌漿網(SR/ER)上的調節胞內鈣庫釋放Ca2+的通道蛋白(Berridge et al.，2000)。哺乳動物體內共有三種不同基因編碼的RyR =RyRl主要在骨骼肌中表達，參與骨骼肌的興奮-收縮，中樞神經中也有少量表達；RyR2主要表達于心肌中，是心肌收縮偶聯不可或缺的成分；RyR3表達于一些特定的肌肉及非肌肉組織中，包括腦、神經等組織。RyR由4個分子量約為560kD的相同亞單位組成，是分子量很大的膜蛋白，包含了大量伸入胞漿的決定其特性的N末端結構域，這些結構域分布著通道調節物的結合位點(Fill and Copello，2002)。雖然人們很早就通過生理生化等方法等發現昆蟲的肌肉細胞中存在著大量的RyR位點(Vazquez-Martinez et al.，2003)，但是相對于哺乳動物RyR較為系統完整的研究，昆蟲RyR分子水平的研究在很長時間內幾乎是一篇空白，只有果蠅(Drosophilamelanogaster)的 RyR 基因全長 cDNA 被克隆(Takeshima et al. , 1994)并且進行了通道動力學的研究(Xu et al.，2000)。隨著二酰胺類殺蟲劑的發現和上市，昆蟲RyR也逐漸成為研究熱點。杜邦公司在Sf9細胞系中對不同種屬昆蟲的功能性RyR的全長基因進行了克隆與表達并申請了專利(W02004027042)，這些昆蟲包括鱗翅目煙芽夜蛾(Heliothis virescens)、同翅目桃蟲牙(Myzus persicae)、棉蟲牙(Aphis gossypii)和玉米飛風(Peregrinus maidis)。京都大學和日本農藥公司克隆了家蠶(Bombyx mori)的RyR基因并且成功在HEK293細胞系獲得穩定高效表達(W02007094408)。這些被注冊專利的基因序列具有廣泛的用途，如可用于大量化合物殺蟲活性篩選方法的建立，用于該受體蛋白抗體的制備，用于生物農藥的開發以及用于轉基因作物研究等。參考文獻具體如下I、Berridge MJ. 1993. Inositol trisphosphate and calcium signalling.Nature 361 :315-325 (磷酸肌醇和鈣信號，《自然》)。2λBerridge MJ,Lipp P，Bootman MD. 2000. The versatility and universalityof calcium signalling. Nat. Rev. Mo I. Cell Biol. I :11-21 (I丐信號的多樣性和普遍性，《自然分子生物學綜述》)。3、Fill M，Copello JA. 2002. Ryanodine receptor calcium release channels.Physiol. Rev. 82 :893-922 (鈣離子釋放的魚尼丁受體通道，《生理學綜述》)。4λLahm GP,Cordova D，Barry JD. 2009. New and selective ryanodine receptoractivators for insect control. Bioorg. Med. Chem. 17 :4127-4133 (新型用于害蟲控制的選擇性魚尼丁激活劑，《生物有機和醫學化學》)。5λLahm GP,Selby TP,Freudenberger JH,Stevenson TMiMyers BJ,Seburyamo G，Smith BK，Flexner L，Clark CE，Cordova D.2005.Insecticidal anthranilic diamides a new class of potent ryanodine receptor activators. Bioorg. Med. Chem. Lett. 15 4898-4906 (鄰甲酰氨基苯甲酰胺類殺蟲劑一類新的潛在魚尼丁受體激活劑，《生物有機和醫學化學》)。6、Nauen R. 2006. Insecticide mode of action return of the ryanodinereceptor. Pest Manag. Sci. 62 :690-692 (殺蟲劑作用機理魚尼丁受體的回歸，《有害生物治理科學》)。7、Takeshima H,Nishi M,Iwabe N,Miyata T,Hosoya TiMasai I,Hotta Y. 1994.Isolation and characterization of a gene for a ryanodine receptor/calciumrelease channel in Drosophila melanogaster. FEBS Lett. 337 :81-87 (分離和解析一種果蠅的魚尼丁受體/鈣離子釋放通道，《歐洲生物化學學會通信》)。8、Tohnishi M，Nakao H，Furuya T，Seo A，Kodama H，Tsubata K，Fujioka S，Kodama H，Hirooka T，Nishimatsu T. 2005. Flubendiamide,a novel insecticide highlyactive against lepidopterous insect pests. J. Pestic. Sci. 30 :354-360 (氟蟲苯甲酉先胺，一種新型針對鱗翅目害蟲的高效殺蟲劑，《農藥科學雜志》)。9、 Vazquez-Martinez 0， Canedo-Merino R， Diaz-Munoz M， Riesgo-EscovarJR. 2003. Biochemical characterization,distribution and phylogenetic analysis ofDrosophila melanogaster ryanodine and IP3 receptors，and thapsigargin-sensitiveCa2+ ATPase. J. Cell Sci. 116 :2483-2494(對果蠅魚尼丁受體、三磷酸肌醇受體和毒胡蘿卜素敏感型鈣泵的生化，分布和系統發育分析，《細胞科學雜志》)。10、Xu X，Bhat MB, Nishi M，Takeshima H，Ma J. 2000. Molecular cloning ofcDNA encoding a drosophila ryanodine receptor and functional studies of the、carboxyl-terminal calcium release channel. Biophys. J. 78 :1270-1281 (分子克隆一種果蠅魚尼丁受體并對其羧基端的鈣釋放通道的功能研究，《生物物理雜志》)。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種魚尼丁受體蛋白CsRyR及其編碼的基因，以及利用該受體表達細胞系進行殺蟲活性物質篩選的技術。為了解決上述技術問題，本發明提供一種二化螟魚尼丁受體基因CsRyR，編碼具有 二化螟魚尼丁受體蛋白CsRyR的核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQ ID NO :I中的核苷酸序列有至少70%的同源性。作為本發明的二化螟魚尼丁受體基因CsRyR的改進該二化螟魚尼丁受體基因CsRyR為SEQ ID NO : I所示的核苷酸序列。本發明還同時提供了上述二化螟魚尼丁受體基因CsRyR編碼的蛋白質，該蛋白質具有SEQ ID No :2所不的氣基酸序列。本發明還同時提供了一種重組載體，該重組載體包含上述二化螟魚尼丁受體基因CsRyR0本發明還同時提供了用上述重組載體轉染的宿主細胞，宿主細胞為HEK_293，CH0，COS, Sf9, S2 或 Sm。本發明還同時提供了上述二化螟魚尼丁受體基因CsRyR的用途用來篩選和/或評價調控魚尼丁受體活性的物質。作為本發明的二化螟魚尼丁受體基因CsRyR的用途的改進用來篩選和/或評價調控魚尼丁受體活性的物質的方法包括如下步驟I)、將上述重組載體轉染宿主細胞系；2)、用候選物質處理步驟I)所得的細胞；3)、檢測步驟2)所得的細胞內鈣離子濃度的變化；當鈣離子濃度出現變化時，說明候選物質能調控魚尼丁受體活性。—般而言只要和對照(如只加入溶劑時)的反應相比有顯著差異即可，即，只要確認有鈣離子濃度的信號變化即可。在本發明中，發明人在二化螟中克隆到魚尼丁受體基因CsRyR。在本發明之前，尚未有任何公開或報道過本發明中提及的二化螟魚尼丁受體蛋白CsRyR序列及其編碼的基因(核酸序列)。本發明的目的在于提供二化螟魚尼丁受體蛋白CsRyR及其編碼的基因(核酸序列)，并可以用該序列來轉染構建穩定表達該受體的細胞系，通過該細胞系可以對針對該受體靶標的殺蟲活性物質進行篩選。在本發明所分離出的DNA分子包括編碼具有二化螟魚尼丁受體蛋白CsRyR活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO :1中從核苷酸第1-15387位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55攝氏度條件下與SEQID NO :1中從核苷酸第1-15387位的核苷酸序列雜交。較佳的，所述的序列編碼具有SEQID NO :2所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ IDNO :1中從核苷酸第1-15387位的核苷酸序列。備注說明在SEQ ID NO 1的末尾含有終止碼。
本發明分離出的二化螟魚尼丁受體蛋白CsRyR包括具有SEQ ID NO 2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或者其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO: 2序列的多肽。本發明DNA分子轉化的宿主細胞是真核細胞。在本發明中，“分離的”、“純化的” DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態下位于其兩側的序列中分離出來，還指該DNA片段已經與天然狀態下伴隨核苷酸的組分分開，而且已經與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。在本發明中，二化螟魚尼丁受體蛋白CsRyR編碼的核酸序列指編碼具有二化螟魚尼丁受體蛋白CsRyR活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO 1中第1-15387位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO :I序列編碼框第1-15387位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子取代后產 生的序列。由于密碼的簡并性，所以與SEQ ID NO :1中第1-15387位核苷酸序列同源性低至約70%的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO :I所述的序列。還包括能在中度嚴緊條件下，更佳的在高度嚴緊條件下與SEQ ID NO:中從核苷酸第1-15387位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。還包括與SEQ ID NO :1中從核苷酸第1-15387位的核苷酸序列的同源性至少70 %，較佳地至少80 %，更佳地至少90 %，最佳地至少95%的核苷酸序列。還包括能編碼具有天然的二化螟魚尼丁受體蛋白CsRyR相同功能的蛋白的SEQ ID NO :1中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入/或取代，以及在5’和/或3’端添加數個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。在本發明中二化螟魚尼丁受體蛋白CsRyR指具有二化螟魚尼丁受體蛋白CsRyR活性的SEQ ID NO :2序列的多肽。該術語還包括具有與天然二化螟魚尼丁受體蛋白CsRyR相同功能的、SEQ ID NO :2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入/或取代，以及在C末端和/或N端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地以5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又別如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括二化螟魚尼丁受體蛋白CsRyR的活性片段和活性衍生物。在本發明中二化螟魚尼丁受體蛋白CsRyR保守性變異多肽指與SEQ ID NO 2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個氨基酸性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表I進行替換而產生。表I
最初的殘基代表性的取代優選的取代
Ala(A)Val ；Leu ；IleVal
權利要求
1.ニ化螟魚尼丁受體基因CsRyR，其特征在于編碼具有ニ化螟魚尼丁受體蛋白CsRyR的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO 1中的核苷酸序列有至少70%的同源性。
2.根據權利要求I所述的ニ化螟魚尼丁受體基因CsRyR，其特征是所述ニ化螟魚尼丁受體基因CsRyR為SEQ ID NO :I所示的核苷酸序列。
3.如權利要求I或2所述的ニ化螟魚尼丁受體基因CsRyR編碼的蛋白質，其特征在于該蛋白質具有SEQ ID No :2所不的氣基酸序列。
4.ー種重組載體，其特征在于所述重組載體包含權利要求I或2所述的ニ化螟魚尼丁受體基因CsRyR。
5.用如權利要求4所述的重組載體轉染的宿主細胞，其特征在干所述宿主細胞為HEK-293, CHO, COS, Sf9, S2 或 Sm。
6.如權利要求I或2所述的ニ化螟魚尼丁受體基因CsRyR的用途，其特征在于用來篩選和/或評價調控魚尼丁受體活性的物質。
7.根據權利要求6所述的ニ化螟魚尼丁受體基因CsRyR的用途，其特征在于用來篩選和/或評價調控魚尼丁受體活性的物質的方法包括如下步驟 .1)、將如權利要求4所述的重組載體轉染宿主細胞系； .2)、用候選物質處理步驟I)所得的細胞； .3)、檢測步驟2)所得的細胞內鈣離子濃度的變化；當鈣離子濃度出現變化時，說明候選物質能調控魚尼丁受體活性。
全文摘要
本發明公開了一種二化螟魚尼丁受體基因CsRyR，其編碼具有二化螟魚尼丁受體蛋白CsRyR的核苷酸序列，核苷酸序列與SEQ ID NO1中的核苷酸序列有至少70％的同源性。本發明還同時公開了上述二化螟魚尼丁受體基因CsRyR編碼的蛋白質，該蛋白質具有SEQ ID No2所示的氨基酸序列。本發明的二化螟魚尼丁受體基因CsRyR的用途為用來篩選和/或評價調控魚尼丁受體活性的物質。
文檔編號C12N5/10GK102628049SQ20121009794
公開日2012年8月8日 申請日期2012年4月5日 優先權日2012年4月5日
發明者葉恭銀, 吳順凡, 黃佳 申請人:浙江大學