專利名稱：利用生物發酵和固定化酶法制備蔗糖-6-乙酯的方法
技術領域：
本發明涉及ー種制備三氯蔗糖關鍵中間體蔗糖-6-こ酯的方法，尤其涉及ー種利用生物發酵和固定化酶法制備蔗糖-6-こ酯的方法。
背景技術：
三氯蔗糖(Sucralose)，是蔗糖的氯化衍生物，是迄今為止人類開發的最完美、最具競爭力、性能穩定、甜感好、安全性高的一種高強度非營養型甜味劑。目前，三氯蔗糖的合成方法不外乎化學法和酶法兩大類。就化學法來說，傳統的全基團保護法缺點在于合成路線冗長，エ藝流程復雜，導致產品成本較高。之后公開的單基團保護法明顯縮短了合成路線，但對反應條件和分離設備提出了更高的要求。因此在化學法的基礎上，又發展了合成三氯蔗糖的生物酶法。早在1958 年，Duff R. B 等[見 Biochem. Journal (生物化學雜志)1958 年 70卷520-528頁]就發現巨大芽孢桿菌NCIB 8508可利用葡萄糖為原料合成葡萄糖 _6_ こ酯(glucose-6-acetate,縮寫為 g-6-a)。之后 USP 4617269 和 JonesD.等[見Biotechnology and Bioengineering (生物技術與生物工程)1992年39卷第2期203-210頁]用生物法合成了三氯蔗糖，首先利用葡萄糖為原料，通過巨大芽胞桿菌的發酵作用合成葡萄糖-6-こ酷，隨后在枯草桿菌feci#心subtilis NCIB 11871分泌的特異果糖基轉移酶催化作用下，轉移蔗糖分子中的果糖基至g-6-a上生成蔗糖-6-こ酯(sucrose-6-acetate,縮寫為s_6_a)。s_6_a再經傳統的氯化、醇解就可獲得三氯鹿糖。由于氯化、醇解エ藝已經十分成熟，沒有技術障礙，因此，合成三氯蔗糖的關鍵中間體是蔗糖-6-こ酯(s_6_a),它的制備是合成ニ氯鹿糖的重要瓶頸。酶法合成s-6-a的最大優點在于其高效專ー性，可以省去大量有機溶劑，省去化學法的復雜エ藝，是化學法不可比擬的，它具有廣闊的應用前景。但現有的技術存在四個缺陷一、產g-6-a的菌株對發酵合成g-6-a的效率太低(最高產量只有15g/L發酵液)。ニ、產果糖轉移酶的枯草桿菌ガW1S subtilis NCIB 11871還處于專利保護期,不能隨意用于商業化生產。三、利用枯草桿菌NCIB 11871產生的果糖轉移酶是游離酶，只能一次性使用，利用率低；而且該酶將g-6-a轉化為s-6-a吋，由于受副產物葡萄糖的抑制，得率只有50%左右。四、s-6-a產品的分離純化采用制備型高效液相色譜法，其設備投資和運行成本太高，無法應用于生產實際。鑒于現有技術的上述缺陷，有必要提供ー種加以改進的制備蔗糖-6-こ酯的生物
學方法。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供ー種利用生物發酵和固定化酶法制備蔗糖-6-こ酯(s-6-a)的方法。
本發明以如下技術方案解決上述技術問題本發明的利用生物發酵和固定化酶法制備蔗糖-6-こ酯的方法エ藝步驟為
(1)對巨大芽胞桿菌megaterium NCIM 2087發酵葡萄糖的發酵培養基加以改進，増加培養基中葡萄糖的含量，并添加了こ酸鈉和氯化鈷成分；
⑵對枯草桿菌ガacWA/s subtilis CGMCC I. 1467進行誘導培養，提取特異性果糖基轉移酶EC 2. 4. I. 162，制成固定化果糖基轉移酶；
(3)將炭黑曲霉メcarbonarius CGMCC 3. 879制成固定化增通細胞；
⑷將炭黑曲霉制成的固定化增殖細胞和枯草桿菌產出的固定化果糖基轉移酶一起，以葡萄糖-6-こ酯和蔗糖為底物，將葡萄糖-6-こ酷轉化為蔗糖-6-こ酷；
(5)最后用DTF-Ol色譜分離、用樹脂柱純化蔗糖-6-こ酷，可以獲得85%純度產品。步驟⑴所述的巨大芽胞桿菌發酵葡萄糖的發酵培養基的質量百分比組成為葡萄糖4. 09T10. 0%，酵母粉0. 19T0. 3%，磷酸ニ氫鉀0. 1%，磷酸氫ニ鉀0. 05%,七水硫酸鎂0. 05%,磷酸氫ニ銨0. 1%，氯化鉀0. 02%，七水硫酸亞鐵0. 002%,三水こ酸鈉
0.001% 0. 002%，六水氯化鈷 0. 001% 0. 002%，碳酸鈣 0. 5%。步驟⑵所述的對枯草桿菌進行誘導培養的培養基中含有質量百分比組成為蔗糖4. 0% 10. 0%、酵母粉0. 3% 0. 5%、氯化鉀0. 05% 0. 1%和六水氯化鈷0. 001% 0. 003%,于30 32°C、搖床轉速170 190 r/min和pH為6. 5 7. 0的培養條件下培養26 35h獲得菌體，按常規方法提取特異性果糖基轉移酶，再以殼聚糖凝膠為載體，以戊ニ醛為交聯劑，按常規化學交聯法制成固定化果糖基轉移酶。步驟⑶所述的將炭黑曲霉制成固定化増殖細胞，是按CGMCC推薦的該菌株培養基和培養條件培養而獲得菌體后，取25 28g濕菌體與50mL去離子水配制成菌體懸浮液,カロ入陽離子聚丙烯酰胺(PAM )質量百分比為0. 29T 0.4%水溶液200ml，攪拌2 3min，再加入質量百分比為39T3. 5%海藻酸鈉水溶液200ml，用磁力攪拌器攪拌混合均勻，用多頭造粒器向攪拌下的濃度為0. f 0.2 mol/L的無菌CaCl2溶液滴注，冰箱4で下固化24 h,制得直徑2. 5 3. 5mm的珠型固定化細胞，然后用去離子水洗:T5適；在無菌條件下移入含有250ml培養基的500 ml三角瓶中培養3(T32 h，使菌株進一步增殖，制成固定化增殖細胞。步驟⑷所述的將炭黑曲霉的固定化増殖細胞和固定化果糖基轉移酶一起，以葡萄糖-6-こ酯和蔗糖為底物，將葡萄糖-6-こ酷轉化為蔗糖-6-こ酷，是在500 ml三角瓶中，加入pH=6. 0 6. 5的磷酸鹽緩沖液200ml，加入蔗糖20克和葡萄糖-6-こ酷10克，在180^200 r/min搖床轉速下升溫至3(T32°C;然后加入128 150單位u的固定化果糖基轉移酶，同時按質量比為1:20的配比加入固定化増殖細胞，以及I. 5^2克食品級碳酸鈣粉末；在3(T32°C下反應，于1(T30 h時間段內每隔一定時間取出反應液50 yl，離心取上清液按第一歩的HPLC色譜法檢測底物和產物的含量；當蔗糖-6-こ酯的含量達到最高值后，停止反應，過濾，濾液旋轉減壓蒸發，真空干燥得到蔗糖-6-こ酷粗品。步驟(5)所述的用DTF-Ol色譜分離用樹脂柱純化蔗糖-6-こ酷，以樹脂為填料，該樹脂用無鹽水溶脹后，用I I. 5mol/L的鹽酸浸泡2h,水洗至中性；再用I I. 5mol/L的NaOH浸泡2h ，水洗至中性；再用I I. 5mol/L的CaCl2浸泡2h，水洗至中性；將水除去，用丙酮浸泡2h，將丙酮除去；用70%丙酮水溶液平衡，得到處理好的色譜分離樹脂；色譜柱的徑高比為1:331:38，濕法裝柱，用70%丙酮水溶液為洗脫液；蔗糖-6-こ酷粗品用少量洗脫液溶解后上柱，加樣量為5. (T6. 0g，洗脫速度為I. Oml/mirTl. 5ml/min，洗脫液用分流器按30:1分流，其中30份用自動部分收集儀收集，I份連接HPLC跟蹤測定流出液的ELSD信號，并記錄對應的流出液體積(ml);收集HPLC跟蹤顯示含蔗糖-6-こ酯的流出液部分，旋轉減壓蒸去溶劑，真空干燥得到蔗糖-6-こ酯產品，純度達到85%以上。與現有的技術比較，本發明的優點是
⑴由于對巨大芽胞桿菌megaterium NCIM 2087發酵葡萄糖的發酵培養基的改進，菌株發酵葡萄糖生產葡萄糖-6-こ酷，產量從15g/L (發酵液)提高到55g/L。⑵對枯草桿菌subtilis CGMCC I. 1467進行誘導培養,代替受專利保護飽Bacillus subtilis NCIB 11871，所生產的果糖基轉移酶屬于單糖專ー性的果糖基轉移酶(酶編號為EC 2. 4. I. 162),與 Joan D.等(見Biotechnology and Bioengineering, 1992年39卷第2期203-210頁)報道的酶特性一致，但產酶菌株不同，更重要的是本發明將果糖基轉移酶制成固定化酶，可以重復使用，提高了酶的使用率，可降低生產成本。本發明與毛多斌等(見《精細化工》2010年27卷第3期234-237頁)所報道的米曲霉所產的果糖基轉移酶不同，后者的酶編號為EC 2.4. I. 9，它要求大量的蔗糖參與反應，且易造成三糖、四糖等聚合產物，而本發明的產物只有s-6-a，沒有三糖以上聚合物。⑶本發明所用的炭黑曲霉carbonarius CGMCC 3. 879是一株能同時產葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶的菌株，當果糖基轉移酶將蔗糖分子的果糖基轉移到g-6-a而生成s-6-a時，副產物是葡萄糖，由于葡萄糖的抑制性競爭，影響了 s-6-a的產率，所以在Joan D的報道中s-6-a的產率只有50%左右。而鄭建仙等報道“通過在反應體系中加入葡萄糖氧化酶來除去葡萄糖副產物以使反應正向進行，S-6-a的得率也未增加。”(《冷飲與速凍食品エ業》2002年8卷第3期7-16頁)，這是因為葡萄糖氧化酶在在氧化葡萄糖的過程中會產生H2O2,該體系中沒有過氧化氫酶存在，所產生的H2O2很快會把葡萄糖氧化酶也殺滅掉，所以沒有效果。本發明的反應體系中含有充足的過氧化氫酶，可以消除H2O2，保證葡萄糖氧化酶能把葡萄糖氧化成葡萄糖酸，在碳酸鈣的存在下，生成葡萄糖酸鈣沉淀，從體系中分離出來，因此，s-6-a的產率能夠提升到80%左右。⑷采用DTF-Ol色譜分離用樹脂柱代替Joan D.報道的制備型高效液相色譜法來純化s-6-a，并用HPLC跟蹤測定流出液的ELSD信號代替已公開的TLC法，具有投資成本和運行成本低廉、操作簡便、分離高效的特點。
具體實施例方式本發明對巨大芽胞桿菌發酵葡萄糖的發酵培養基加以改進，使其生產g-6-a的產量從15g/L (發酵液)提高到55g/L ;對枯草桿菌進行誘導培養，代替subtilisNCIB 11871提取特異性果糖基轉移酶(EC 2. 4. I. 162)，制成固定化果糖基轉移酶；將炭黑曲霉制成固定化増殖細胞；將固定化増殖細胞和固定化果糖基轉移酶一起，以g-6-a和蔗糖為底物，將g-6-a轉化為s-6-a ;最后以DTF-Ol色譜分離用樹脂柱代替制備型高效液相色譜法，純化s-6-a，可以獲得85%純度的產品。具體步驟如下
第一歩，改進培養基 的組成，優化發酵條件，利用巨大芽孢桿菌菌株發酵葡萄糖生產葡萄糖-6 -こ酯(g-6-a)，提高產量。出發菌株megaterium NCIB 2087購于印度浦那國家化學實驗室。
種子培養基葡萄糖2 3 g,蛋白胨fl. 5 g，NaCl 0. 5g,牛肉膏0. 05 g,去離子水100 mL, pH值7. O。改進發酵培養基的組成，通過提高葡萄糖的含量，添加適量こ酸鈉和氯化鈷等成分，可提高g-6-a的產量。該培養基的質量百分比組成為葡萄糖4. 09T10. 0%，酵母粉0. 19T0. 3%，磷酸ニ氫鉀0. 1%，磷酸氫ニ鉀0. 05%,，七水硫酸鎂0. 05%,，磷酸氫ニ銨
0.1%，氯化鉀0. 02%，七水硫酸亞鐵0. 002%,三水こ酸鈉0. 001%"0. 002%,六水氯化鈷
0.0019T0. 002%，碳酸鈣0. 5%，用去離子水配制。優化的培養條件為28 30°C，搖床轉速180 200 r/min, pH6. 5 7. O。巨大芽孢桿菌在上述以葡萄糖為主的發酵培養基中，于28 30°C、轉速180 200r/min的搖床中發酵4 7天。發酵液離心收集清液,旋轉減壓蒸發濃縮,真空干燥,用甲醇提取，提取液減壓濃縮至干，得到g-6-a的粗提物。g-6-a粗提物用色譜柱純化填料采用蘇青DTF-Ol色譜分離用樹脂，玻璃外殼的柱子，徑高比為1:33 1:40，以70%甲醇水溶液為洗脫劑，洗脫速度為I. 0 ml/mirTl. 5 ml/min0洗脫液用分流器按30:1分流，其中30份用自動部分收集儀收集，I份連接HPLC跟蹤測定流出液的蒸發光散射檢測器(ELSD )信號，并記錄對應的流出液體積(ml)。收集HPLC跟蹤顯示只含g-6-a的流出液部分，旋轉減壓蒸發濃縮得g-6-a，經HPLC檢測g_6_a含量后，供下一步制備s-6-a用。用于檢測葡萄糖、蔗糖、g-6-a和s-6-a含量的HPLC色譜法采用配置蒸發光散射檢測器(ELSD)的HPLC系統，色譜條件為DiamonsiI C18柱，柱溫25で，流動相為こ腈/水(75:25，V / V)，進樣量IOii L，以I ml/min的流速，在蒸發光散射檢測器于100°C下分析，氮氣流速為2. 5 ml/min。以葡萄糖、鹿糖、g_6_a和s_6_a的標準品(或對照品)定性，用峰面積歸ー化法作定量分析。第二步,對枯草桿菌進行誘導培養，提取果糖基轉移酶(fructosyltransferase,EC 2.4. I. 162)，并用化學交聯法制備固定化果糖基轉移酶。出發菌株枯草桿菌ガaci/A/s subtilis CGMCC I. 1467購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。斜面和種子培養基按CGMCC推薦的32號培養基，以葡萄糖為碳源，以蛋白胨、酵母提取物為氮源，以氯化鈉為無機鹽。對發酵培養基加以改進蔗糖為碳源，酵母粉為氮源，氯化鉀和氯化鈷為無機鹽。其組成質量百分比是蔗糖4. 09T10. 0%，酵母粉0. 39TO. 5%，氯化鉀0. 059T0. 1%，六水氯化鈷0. 0019T0. 003%。試驗證明，在蔗糖為碳源的培養基中，該菌株對果糖基轉移酶有底物誘導物作用，能促進果糖基轉移酶的分泌。培養條件30 32°C，搖床轉速170 190 r/min, pH6. 5 7. O。上述提取果糖基轉移酶的方法是枯草桿菌菌株在上述發酵培養基培養26 35h獲得菌體。發酵液用濾布過濾，洗滌，收集菌體，用超聲波破碎儀破碎細胞，9000 r/min離心，去除細胞碎片，得到粗酶液。再用截留分子量30KD的超濾裝置超濾粗酶液，濃縮液經HPLC測定酶活力后供固定化之用。上述化學交聯法制備固定化果 糖基轉移酶的方法，是以殼聚糖凝膠為載體，以戊ニ醛為交聯劑，采用化學偶聯法將果糖基轉移酶固定在載體上。由于交聯劑戊ニ醛帶有兩個醛基，而殼聚糖和酶蛋白分別含有氨基(-NH2),因此可以利用戊ニ醛與氨基的Schiff反應將殼聚糖和果糖基轉移酶交聯起來，達到固定化的目的。固定化操作是果糖基轉移酶提取液經超濾濃縮后，用HPLC測定其酶活力，按每克載體需酶20 160u的比例，加入殼聚糖凝膠，混合，加入戊ニ醛使其終濃度為0. 05 0. 3%(質量百分比)，在p H 6. 0 7. 0,25 40°C的條件下，交聯反應4 12 h，充分洗滌，離心甩干，可得固定化果糖基轉移酶，于0 5°C保存。果糖基轉移酶酶的酶活定義是在40°C，pH6. 0磷酸鹽緩沖溶液條件下，每小時轉化I ymol的g-6-a所需的酶質量為I個活力單位(U)。第三步，將炭黑曲霉制成固定化增殖細胞。出發菌株carbonarius CGMCC 3. 879購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。種子培養基和發酵培養基去離子水1000 g,葡萄糖30 g,硝酸鈉3 g,蛋白胨5g，七水硫酸鎂0.5 g,氯化鉀0. 5 g,四水硫酸亞鐵0.01 g,碳酸I丐3 go發酵條件菌種加入發酵培養基后，在0 24小時內發酵溫度為3(T32°C，然后添加50g葡萄糖，在25 31小時內將發酵溫度降至28°C。發酵結束后，收集菌絲體，并用水洗將可溶性無機鹽和糖分洗去，置冰箱保存，供制備固定化細胞之用。以上所述將將炭黑曲霉制成固定化増殖細胞的方法是取陽離子聚丙烯酰胺(p0lyacrylamide，PAM)用去離子水配成質量百分數為0.29T 0. 4%的PAM溶液。取海藻酸鈉用去離子水配制成質量百分數為39T3. 5%海藻酸鈉溶液。取25 28g濕菌體與50mL去離子水配制成菌體懸浮液，加入上述PAM溶液200ml，攪拌2 3min，再加入上述海藻酸鈉溶液200ml，用磁力攪拌器攪拌混合均勻，用多頭造粒器向攪拌下的濃度為0. ro. 2 mol/L的無菌CaCl2溶液滴注，冰箱4で下固化24 h,制得直徑2. 5^3. 5mm的珠型固定化細胞，然后用去離子水洗3 5遍。在無菌條件下移入含有250 ml上述發酵培養基的500 ml三角瓶中，按上述發酵條件培養3(T32 h，使菌株進一歩増殖，制成固定化増殖細胞。第四歩，固定化果糖基轉移酶和固定化増殖細胞一起，以g-6-a和蔗糖為底物，將g-6-a 轉化為 s-6-a。在500 ml三角瓶中，加入pH=6. 0 6. 5的磷酸鹽緩沖液200ml，加入蔗糖20克和g-6-a 10克，置于搖床中，在180 200 r/min轉速下升溫至30 32°C。然后加入128 150單位(U)的固定化果糖基轉移酶，同時按質量比為1:20的配比加入固定化増殖細胞，以及I. 5^2克食品級碳酸鈣粉末。在3(T32°C下反應，于1(T30 h時間段內每隔一定時間取出反應液50 u 1，離心取上清液按第一歩的HPLC色譜法檢測底物和產物的含量。當s-6-a的含量達到最高值后，停止反應，用濾布抽濾，濾液旋轉減壓蒸發，真空干燥得到s-6-a粗品，供色譜樹脂柱純化s-6-a用，濾渣置冰箱保存供下次反應用。該固定化果糖基轉移酶和固定化增殖細胞可以重復使用10次以上。第五步，用DTF-Ol色譜分離用樹脂柱純化s-6-a產品。以DTF-Ol色譜分離用樹脂為填料，裝于玻璃柱中制成色譜分離柱，并以70%丙酮水溶液為洗脫液，用自動部分收集器收集流出液，HPLC跟蹤測定流出液的ELSD信號，收集HPLC跟蹤顯示含s-6-a的流出液部分，可得到純化的s-6-a。
樹脂處理用無鹽水溶脹后的色譜分離用樹脂，用I I. 5mol/L的鹽酸浸泡2h，水洗至中性；再用I I. 5mol/L的NaOH浸泡2h,水洗至中性；再用I I. 5mol/L的CaCl2浸泡2h，水洗至中性。將水除去，用こ醇浸泡2h，將こ醇除去。用70%丙酮水溶液平衡，得到處理好的色譜分離樹脂。色譜柱的徑高比為1:331:38，濕法裝柱，并用洗脫液平衡。第四步所得S_6_a粗品用少量洗脫液溶解后上柱，加樣量為5. (T6. 0g，用70%丙酮水溶液洗脫，洗脫速度為
I.Oml/mirTl. 5ml/min,洗脫液用分流器按30:1分流,其中30份用自動部分收集儀收集，I份連接HPLC跟蹤測定 流出液的ELSD信號，并記錄對應的流出液體積(ml)。收集HPLC跟蹤顯示含s-6-a的流出液部分，旋轉減壓蒸去溶劑，真空干燥得到s-6-a產品。不純的部分，但尚含s-6-a的洗脫液經旋轉減壓蒸發濃縮后待下次繼續上柱分離。實施例I
I、葡萄糖-6 -こ酯(g-6-a)的制備
出發菌株巨大芽孢桿菌菌株A/s megaterium NCIB 2087原購于印度浦那國家化
學實驗室。發酵培養基葡萄糖8%，酵母粉0. 2%，磷酸ニ氫鉀0. 1%，磷酸氫ニ鉀0. 05%,，七水硫酸鎂0.05%，，磷酸氫ニ銨0.1%，氯化鉀0.02%，七水硫酸亞鐵0.002%，三水こ酸鈉0. 0015%,六水氯化鈷0. 0012%,碳酸鈣0. 5%，用去離子水配制。培養條件30°C，搖床轉速180r/min, pH7. O。巨大芽孢桿菌菌株在上述以葡萄糖為主的發酵培養液中發酵，在30°C、轉速180r/min的搖床中發酵5天。發酵液離心收集清液,旋轉減壓蒸發濃縮,真空干燥,用甲醇提取，提取液減壓濃縮至干，得到g-6-a的粗提物。8-6-&粗提物用蘇青01 -01色譜分離用樹脂為填料的色譜柱純化，徑高比為1:33，以70%甲醇水溶液為洗脫劑，洗脫速度為I. 0 ml/min0洗脫液用分流器按30:1分流，其中30份用自動部分收集儀收集，I份連接HPLC跟蹤測定流出液的蒸發光散射檢測器(ELSD )信號，并記錄對應的流出液體積(ml)。收集HPLC跟蹤顯示只含g-6-a的流出液部分，旋轉減壓蒸發濃縮得g-6-a，經HPLC檢測g_6_a含量后，供下一步制備s-6-a用。2、果糖基轉移酶的提取和固定化果糖基轉移酶的制備
枯草桿菌feciパM subtilis CGMCC I. 1467在蔗糖為碳源的培養基中進行誘導培養蔗糖4. 0%，酵母粉0. 4%，氯化鉀0. 06%,六水氯化鈷0. 001%。培養條件是30°C、搖床轉速180r/min、pH7. O。培養32 35h獲得菌體。發酵液用濾布過濾，洗滌，收集菌體，用超聲波破碎儀破碎細胞，9000 r/min離心，去除細胞碎片，得到粗酶液。再用截留分子量30KD的超濾裝置超濾粗酶液，濃縮液經HPLC測定酶活力后按每克載體需酶160u的比例，加入殼聚糖凝膠，混合，加入戊ニ醛使其終濃度為0.03%，在p H7.0、25°C的條件下，交聯反應5 h，充分洗滌，離心甩干，得固定化果糖基轉移酶，于0 5°C保存。3、炭黑曲霉A carbonarius CGMCC 3. 879制成固定化增殖細胞
A. carbonarius CGMCC 3. 87的發酵培養基去離子水1000 g，葡萄糖30 g，硝酸鈉3g，蛋白胨5 g,七水硫酸鎂0. 5 g,氯化鉀0. 5 g,四水硫酸亞鐵0. 01 g,碳酸I丐3 go菌種加入上述發酵培養基后，在24h內發酵溫度為30°C，然后添加50g葡萄糖，24h以后將發酵溫度降至28°C。發酵結束后，收集菌絲體，并用水洗將可溶性無機鹽和糖分洗去，置冰箱備用。取陽離子聚丙烯酰胺用去離子水配成質量百分比為0. 25%的PAM溶液。取海藻酸鈉用去離子水配制成質量百分比為3%的海藻酸鈉溶液。取25g濕菌體與50mL去離子水配制成菌體懸浮液，加入上述PAM溶液200ml，攪拌2 3min，再加入上述海藻酸鈉溶液200ml,用磁力攪拌器攪拌混合均勻,用多頭造粒器向攪拌下的濃度為0. lmol/L的無菌CaCl2溶液滴注，冰箱4で下固化24 h,制得直徑2. 5 3. 5mm的珠型固定化細胞，然后用去離子水洗5遍。在無菌條件下移入含有250 ml上述發酵培養基的500 ml三角瓶中，按上述發酵條件培養30 h，使菌株進一歩増殖，制成固定化増殖細胞。4、固定化果糖基轉移酶和固定化增埴細胞一起，以g-6-a和鹿糖為底物,將g-6-a轉化為s-6-a
在500 ml三角瓶中，加入pH=6. 0的磷酸鹽緩沖液200ml，加入蔗糖20克和g-6-a 10克，置于搖床中，在180 r/min轉速下升溫至30 °C。然后加入130單位(U)的固定化果糖基轉移酶，同時按質量比為1:20的配比加入固定化増殖細胞，以及I. 5克食品級碳酸鈣粉末。在30°C下反應，于1(T30 h時間段內每隔一定時間取出反應液50 Ul，離心取上清液按第一歩的HPLC色譜法檢測底物和產物的含量。當s-6-a的含量達到最高值后，停止反應，用濾布抽濾，濾液旋轉減壓蒸發，真空干燥得到s-6-a粗品。5、用色譜樹脂柱純化s-6-a產品
DTF-Ol色譜分離用樹脂的處理用無鹽水溶脹后的，用I. Omol/L的鹽酸浸泡2h，水洗至中性；再用I. Omol/L的NaOH浸泡2h，水洗至中性；再用I. 0mol/L的CaCl2浸泡2h，水洗至中性。將水除去，用丙酮浸泡2h，將丙酮除去。用70%丙酮水溶液平衡，得到處理好的色譜分離樹脂。以DTF-01樹脂為填料，裝于玻璃柱中，徑高比為1:33，濕法裝柱，并用70%丙酮水溶液平衡。s-6-a粗品用少量70%丙酮水溶液溶解后上柱，加樣量為5. Og,用70%丙酮水溶液洗脫，洗脫速度為I. Oml/min。洗脫液用分流器按30:1分流，其中30份用自動部分收集儀收集，I份連接HPLC跟蹤測定流出液的ELSD信號，并記錄對應的流出液體積(ml )。收集HPLC跟蹤顯示含s-6-a的流出液部分，旋轉減壓蒸去溶劑，真空干燥得到s-6-a產品。不純的部分，但尚含s-6-a的洗脫液經旋轉減壓蒸發濃縮后待下次繼續上柱分離。實施例2
I、葡萄糖-6 -こ酯(g-6-a)的制備 出發菌株同實施例I。發酵培養基葡萄糖6%，酵母粉0. 25%，磷酸ニ氫鉀0. 1%，磷酸氫ニ鉀0. 05%,，七水硫酸鎂0.05%，，磷酸氫ニ銨0.1%，氯化鉀0.02%，七水硫酸亞鐵0.002%，三水こ酸鈉
0.0018%,六水氯化鈷0. 0012%,碳酸鈣0. 5%，用去離子水配制。培養條件31°C，搖床轉速200r/min, pH7. O。巨大芽孢桿菌菌株在上述以葡萄糖為主的發酵培養液中發酵，在31°C、轉速200r/min的搖床中發酵4天。發酵液離心收集清液,旋轉減壓蒸發濃縮,真空干燥,用甲醇提取，提取液減壓濃縮至干，得到g-6-a粗提物。8-6-&粗提物用蘇青01 -01色譜分離用樹脂為填料的色譜柱純化，徑高比為1:35，以70%甲醇水溶液為洗脫劑，洗脫速度為I. 5ml/min。洗脫液用分流器按30:1分流，其中 30份用自動部分收集儀收集，I份連接HPLC跟蹤測定流出液的蒸發光散射檢測器(ELSD )信號，并記錄對應的流出液體積(ml)。收集HPLC跟蹤顯示只含g-6-a的流出液部分，旋轉減壓蒸發濃縮得g-6-a，經HPLC檢測g_6_a含量后，供下一步制備s-6-a用。2、果糖基轉移酶的提取和固定化果糖基轉移酶的制備
枯草桿菌ガ.subtilis CGMCC I. 1467在蔗糖為碳源的培養基中進行誘導培養蔗糖
5.0%，酵母粉0. 35%，氯化鉀0. 06%,六水氯化鈷0. 001%。培養條件是31°C、搖床轉速200 r/min、pH7.0。培養32h獲得菌體。發酵液用濾布過濾，洗滌，收集菌體，用超聲波破碎儀破碎細胞，9000 r/min離心，去除細胞碎片，得到粗酶液。再用截留分子量30KD的超濾裝置超濾粗酶液，濃縮液經HPLC測定酶活力后按每克載體需酶150u的比例，加入殼聚糖凝膠，混合，加入戊ニ醛使其終濃度為0.05%，在p H6.8、20°C的條件下，交聯反應5 h，充分洗滌，離心甩干，得固定化果糖基轉移酶，于0 5°C保存。3、炭黑曲霉A ca/ふmariW1S CGMCC 3. 879制成固定化增通細胞
炭黑曲霉的發酵培養基去離子水IOOOg,葡萄糖35 g,硝酸鈉3 g,蛋白胨5 g,七水硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，四水硫酸亞鐵0.01 g，碳酸鈣3 g。菌種加入上述發酵培養基后，在24h內發酵溫度為31°C，然后添加50g葡萄糖，24h以后將發酵溫度降至29°C。發酵結束后，收集菌絲體，并用水洗將可溶性無機鹽和糖分洗去，置冰箱備用。取陽離子聚丙烯酰胺用去離子水配成質量百分比為0. 3%的PAM溶液。取海藻酸鈉用去離子水配制成3. 5%海藻酸鈉溶液。取26g濕菌體與50mL去離子水配制成菌體懸浮液，加入上述PAM溶液200ml，攪拌2 3min，再加入上述海藻酸鈉溶液200ml，用磁力攪拌器攪拌混合均勻，用多頭造粒器向攪拌下的濃度為0. 2mol/L的無菌CaCl2溶液滴注,冰箱4で下固化24 h,制得直徑2. 5 3. 5mm的珠型固定化細胞，然后用去離子水洗3遍。在無菌條件下移入含有250 ml上述發酵培養基的500 ml三角瓶中，按上述發酵條件培養32 h，使菌株進一歩増殖，制成固定化増殖細胞。4、固定化果糖基轉移酶和固定化增埴細胞一起，以g-6-a和鹿糖為底物,將g_6_a轉化為s-6-a
在500 ml三角瓶中，加入pH=6. 0的磷酸鹽緩沖液200ml，加入蔗糖24克和g-6-a 10克，置于搖床中，在200 r/min轉速下升溫至30 °C。然后加入150單位(U)的固定化果糖基轉移酶，同時按質量比為1:20的配比加入固定化増殖細胞，以及2. 0克食品級碳酸鈣粉末。在30°C下反應，于1(T30 h時間段內每隔一定時間取出反應液50 Ul，離心取上清液按第一歩的HPLC色譜法檢測底物和產物的含量。當s-6-a的含量達到最高值后，停止反應，用濾布抽濾，濾液旋轉減壓蒸發，真空干燥得到s-6-a粗品。 5、譜樹脂柱純化s-6-a產品
DTF-Ol色譜分離用樹脂的處理用無鹽水溶脹后的，用I. 5mol/L的鹽酸浸泡2h，水洗至中性；再用I. 5mol/L的NaOH浸泡2h，水洗至中性；再用I. 5mol/L的CaCl2浸泡2h，水洗至中性。將水除去，用丙酮浸泡2h，將丙酮除去。用70%丙酮水溶液平衡，得到處理好的色譜分離樹脂。以DTF-Ol樹脂為填料，裝于玻璃柱中，徑高比為1:35，濕法裝柱，并用70%丙酮水溶液平衡。s-6-a粗品用少量70%丙酮水溶液溶解后上柱，加樣量為5. 2g，用70%丙酮水溶液洗脫，洗脫速度為I. 2ml/min。洗脫液用分流器按30:1分流，其中30份用自動部分收集儀收集，I份連接HPLC跟蹤 測定流出液的ELSD信號，并記錄對應的流出液體積(ml )。收集HPLC跟蹤顯示含s-6-a的流出液部分，旋轉減壓蒸去溶劑，真空干燥得到s-6-a產品。
權利要求
1.ー種利用生物發酵和固定化酶法制備蔗糖-6-こ酯的方法，其特征是エ藝步驟為 (1)對巨大芽胞桿菌Bacillusmegaterium NCIM 2087發酵葡萄糖的發酵培養基加以改進，増加培養基中葡萄糖的含量，并添加こ酸鈉和氯化鈷等成分； (2)對枯草桿菌Bacillussubtilis CGMCC I. 1467進行誘導培養，提取特異性果糖基轉移酶EC 2. 4. I. 162，并制成固定化果糖基轉移酶； (3)將炭黑曲霉Aspergilluscarbonarius CGMCC 3. 879制成固定化增通細胞； (4)將炭黑曲霉制成的固定化增殖細胞和枯草桿菌產出的固定化果糖基轉移酶一起，以葡萄糖-6-こ酯和蔗糖為底物，將葡萄糖-6-こ酷轉化為蔗糖-6-こ酷； (5)最后用DTF-Ol色譜分離、用樹脂柱純化蔗糖-6-こ酷，可以獲得85%純度產品。
2.如權利要求I所述的利用生物發酵和固定化酶法制備蔗糖-6-こ酯的方法，其特征是步驟(I)所述的巨大芽胞桿菌發酵葡萄糖的發酵培養基的質量百分比組成為葡萄糖4. 0 % 10. 0 %，酵母粉0. I % 0. 3 %，磷酸ニ氫鉀0.1%，磷酸氫ニ鉀0.05%，七水硫酸鎂0. 05%，磷酸氫ニ銨0. 1%，氯化鉀0. 02%，七水硫酸亞鐵0. 002%，三水こ酸鈉0. 001% 0. 002%，六水氯化鈷0. 001% 0. 002%，碳酸鈣0. 5%0
3.如權利要求I所述的利用生物發酵和固定化酶法制備蔗糖-6-こ酯的方法，其特征是步驟(2)所述的對枯草桿菌進行誘導培養的培養基中含有質量百分比組成為蔗糖4. 0 % 10. 0 %、酵母粉0. 3 % 0. 5 %、氯化鉀0. 05 % 0. I %和六水氯化鈷0. 001 % 0.003%，于30 32°C、搖床轉速170 190r/min和pH為6. 5 7. 0的培養條件下培養26 35h獲得菌體，按常規方法提取特異性果糖基轉移酶，再以殼聚糖凝膠為載體，以戊ニ醛為交聯劑，按常規化學交聯法制成固定化果糖基轉移酶。
4.如權利要求I所述的利用生物發酵和固定化酶法制備蔗糖-6-こ酯的方法，其特征是步驟(3)所述的將炭黑曲霉制成固定化増殖細胞，是該菌株按CGMCC推薦的培養基和培養條件培養而獲得菌體后，取25 28g濕菌體與50mL去離子水配制成菌體懸浮液，加入陽離子聚丙烯酰胺PAM質量百分比為0. 2% 0. 4%水溶液200ml，攪拌2 3min，再加入質量百分比為3% 3. 5%海藻酸鈉水溶液200ml，用磁力攪拌器攪拌混合均勻，用多頭造粒器向攪拌下的濃度為0. I 0. 2mol/L的無菌CaCl2溶液滴注，冰箱4°C下固化24h，制得直徑2. 5 3. 5mm的珠型固定化細胞，然后用去離子水洗3 5遍；在無菌條件下移入含有250ml培養基的500ml三角瓶中培養30 32h，使菌株進一步增殖，制成固定化增殖細胞。
5.如權利要求I所述的利用生物發酵和固定化酶法制備蔗糖-6-こ酯的方法，其特征是步驟(4)所述的將炭黑曲霉的固定化増殖細胞和固定化果糖基轉移酶一起，以葡萄糖-6-こ酯和蔗糖為底物，將葡萄糖-6-こ酷轉化為蔗糖-6-こ酷，是在500ml三角瓶中，加入pH = 6. 0 6. 5的磷酸鹽緩沖液200ml，加入蔗糖20克和葡萄糖-6-こ酷10克，在180 200r/min搖床轉速下升溫至30 32°C ;然后加入128 150單位u的固定化果糖基轉移酶，同時按質量比為I : 20的配比加入固定化増殖細胞，以及1.5 2克食品級碳酸鈣粉末；在30 32°C下反應，于10 30h時間段內每隔一定時間取出反應液50iU，離心取上清液按第一歩的HPLC色譜法檢測底物和產物的含量；當蔗糖-6-こ酯的含量達到最高值后，停止反應，過濾，濾液旋轉減壓蒸發，真空干燥得到蔗糖-6-こ酷粗品。
6.如權利要求I所述的利用生物發酵和固定化酶法制備蔗糖-6-こ酯的方法，其特征是步驟(5)所述的用DTF-Ol色譜分離用樹脂柱純化蔗糖-6-こ酷，以樹脂為填料，該樹脂用無鹽水溶脹后，用I I. 5mol/L的鹽酸浸泡2h,水洗至中性；再用I I. 5mol/L的NaOH浸泡2h，水洗至中性；再用I I. 5mol/L的CaCl2浸泡2h，水洗至中性；將水除去，用丙酮浸泡2h，將丙酮除去；用70%丙酮水溶液平衡，得到處理好的色譜分離樹脂；色譜柱的徑高比為I : 33 I : 38，濕法裝柱，用70%丙酮水溶液為洗脫液；蔗糖-6-こ酷粗品用少量洗脫液溶解后上柱，加樣量為5. 0 6. 0g，洗脫速度為I. Oml/min I. 5ml/min，洗脫液用分流器按30 I分流，其中30份用自動部分收集儀收集，I份連接HPLC跟蹤測定流出液的ELSD信號，并記錄對應的流出液體積(ml);收集HPLC跟蹤顯示含蔗糖-6-こ酯的流出液部分，旋轉減壓蒸去溶劑，真空干燥得到蔗 糖-6-こ酯產品，純度達到85 %以上。
全文摘要
一種利用生物發酵和固定化酶法制備蔗糖-6-乙酯的方法，工藝步驟為對巨大芽胞桿菌的發酵培養基加以改進；對枯草桿菌進行誘導培養，提取特異性果糖基轉移酶并制成固定化果糖基轉移酶；將炭黑曲霉制成固定化增殖細胞；固定化增殖細胞和固定化果糖基轉移酶一起以葡萄糖-6-乙酯和蔗糖為底物，將葡萄糖-6-乙酯轉化為蔗糖-6-乙酯；最后用色譜分離樹脂柱純化蔗糖-6-乙酯。用本發明方法生產葡萄糖-6-乙酯，產量從15g/L發酵液提高到55g/L，提供了可以重復使用的固定化酶，蔗糖-6-乙酯的產率能夠提升到80％左右，并以色譜分離樹脂柱代替制備型高效液相色譜法來純化蔗糖-6-乙酯，大幅降低了成本。
文檔編號C12P19/12GK102618601SQ20121011262
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月17日 優先權日2012年4月17日
發明者姚評佳, 梁錦添, 魏遠安, 黃廣君 申請人:廣西大學