專利名稱：超濾提取辣根過氧化物酶的方法
技術領域：
本發明屬于生物分離工程與技術領域，具體是應用超濾技術從辣根中分離提取辣根過氧化物酶的方法。
背景技術：
辣根過氧化物酶(HorseradishPeroxidase, HRP, E. C. I. 11. I. 7)是由酶蛋白和鐵卟啉結合而成的一種糖蛋白，該酶由多個同功酶組成，分子量為40kDa，等電點為PH3. 0-9. O。HRP的輔基和酶蛋白最大吸收光譜分別在403nm和275nm，所以人們通常采用RZ值卿OD403nm /OD275nm的比值)來表示該酶的純度，RZ值越大，純度越高。HRP是最重要的醫療診斷用酶之一(J. Chromat. B 2004，803:237-241 )，該酶不但用于多個生化檢測項目，還廣泛運用于免疫類試劑盒。除此之外，HRP還可用于工業廢水的脫色(Chem. Technol. Biotechnol. 2009，84:126 - 132),過氧化物的去除以及含酹污水的處理(Biotechnol. Bioprocess Eng. 2006，11:462 - 465)等。在自然界中，辣根是HRP含量最高的植物，因此也成為生產HRP最具吸引力的原料。目前，從辣根中分離提取HRP的主要方法有雙水相萃取技術(Appl. Biochem.Biotechnol. 1995, 53:147-154)、反膠束萃取技術(Enzyme Microb. Technol.1996，18:332-339)、電泳技術(J. Biol. Chem. 1966，241:2166-2172)及層析技術(J.Membr. Sci. 2003，211:101-111)等。然而這些技術均存在一定的缺陷，其中，雙水相萃取技術和反膠束萃取技術獲得的產品純度較低，且容易引起HRP的失活和變性；電泳技術和層析技術的成本昂貴，且難于工業放大。膜分離法通常指利用天然或人工合成的薄膜，以外界能量或化學位差為推動力，對雙組份或多組分的混合物進行分離、提純和富集的方法。膜分離技術是20世紀50年代發展起來的一項高效分離技術，與傳統的分離技術相比，具有分離效率高、能耗低、可連續操作、易于放大、無污染等優點。超濾膜是指膜孔徑在I-IOOnm之間，具有不對稱結構的復合膜。由于其孔徑尺寸與生物大分子的尺寸較為接近，故可用于生物大分子如蛋白質等的分離與純化(FoodChem. 2010, 122: 747-752)。超濾分離是分子級的，即可截留溶液中的大分子溶質，同時使小分子溶質透過；有時也可以通過調節溶液中微環境，使預分離的蛋白質分子和膜表面帶有不同性質的電荷，再通過蛋白質分子之間、蛋白質與膜表面之間的靜電作用，達到分離的目的。目前，在生物加工領域，超濾技術常用于蛋白質的純化與濃縮，在工業上已有較多應用，但由于自然體系中蛋白質種類復雜，且存在較多的同工酶，使用超濾法直接分離得到高純度的功能蛋白質的實例極少，且這方面的研究仍處于實驗室規模(J. Membr. Sci.2010，352:231-238)
發明內容
針對現有技術的缺陷，本發明的目的是提供一種操作簡單、易于放大、產品純度高的辣根過氧化物酶的超濾提取方法。本發明的技術方主要包括以下步驟
(1)、將辣根破碎、浸提、離心得到辣根過氧化物酶粗提液；
(2)、將辣根過氧化物酶粗提液用截留分子量為70kDa-100kDa的超濾膜進行超濾分離，得到辣根過氧化物酶超濾液；
(3)、將辣根過氧化物酶超濾液用截留分子量為l-30kDa的超濾膜進行超濾濃縮，得到辣根過氧化物酶濃縮液；
(4 )、將辣根過氧化物酶濃縮液脫水得到辣根過氧化物酶。為了達到最佳的提取效果，還包括以下技術方案
步驟(I)中的浸提為將破碎后辣根的在水或TriS-HCl緩沖溶液下勻漿，緩沖液的濃度可以選擇不大于5M，并調節ph為4-11，離子強度不大于1M，然后在0-10°C攪拌3小時；步驟(I)中的最佳離心溫度為4°C，離心力大于5000g，離心時間大于10分鐘。步驟(2)和
(3)中的過氧化物酶粗提液和超濾液在超濾處理前調節ph為4-11，離子強度不超過1M。步驟(4 )中的脫水為冷凍干燥。在本發明的步驟(2)和(3)中超濾膜的組件形式選擇為中空纖維素膜、平板膜或卷式膜，超濾效果較好。本發明具有操作簡單、分離濃縮同步進行、產品回收率高、產品純度達85%以上、并利于工業放大等特點，具有良好的應用前景。
具體實施例方式下面結合實施例進一步描述本發明。實施例I
從辣根中提取辣根過氧化物酶的方法，步驟
(1)取I.Okg新鮮的辣根，用蒸餾水洗凈，切成5mm左右的小塊，在I.5L IOOmM的Tris-HCl緩沖溶液下勻漿，用IM的HCl調勻漿液pH值為5. O ；
(2)將步驟(I)得到的勻漿液在4°C下充分攪拌8小時，離心取上清液I.21L。離心條件為4°C,8000g,25min ；
(3)利用截留分子量為70kDa的平板式超濾膜(聚醚砜材質，O.09m2)對步驟(2)獲得的I. 21L上清液進行超濾分離，獲得濾出液O. 96L。分離條件進口壓力O. 3MPa，出口壓力O. 2MPa，流速 I. 4L/h ；
(4)利用截留分子量為30kDa的平板式超濾膜(聚醚砜材質，O.09m2)對步驟(3)獲得的O. 96L濾出液進行超濾濃縮，獲得截留液O. 24L。分離條件進口壓力O. 4MPa，出口壓力O. 5MPa，流速 I. lL/h ；
(5)將步驟(4)獲得O.24L截留液冷凍干燥后，得HRP1. 63g，經SDS-PAGE電泳分析，HRP純度為91%。實施例2
從辣根中提取辣根過氧化物酶的方法，步驟
(I)取I. 5kg新鮮的辣根，用蒸餾水洗凈，切成5mm左右的小塊，在2. 5L 2OmM的Tris-HCl緩沖溶液下勻漿，用IM的HCl調勻漿液pH值為5. 5 ;(2)將步驟(I)得到的勻漿液在4°C下充分攪拌8小時，離心取上清液2.27L。離心條件為4°C,8000g,20min ；
(3)利用截留分子量為IOOkDa的平板式超濾膜(聚醚砜材質，O.09m2)對步驟(2)獲得的2. 27L上清液進行超濾分離，獲得濾出液I. 84L。分離條件進口壓力O. 3MPa，出口壓力O. 2MPa，流速 I. 8L/h ；
(4)利用截留分子量為30kDa的平板式超濾膜(聚醚砜材質，O.09m2)對步驟(3)獲得的I. 84L濾出液進行超濾濃縮，獲得截留液O. 25L。分離條件進口壓力O. 4MPa，出口壓力O. 5MPa，流速 I. 4L/h ；
(5)將步驟(4)獲得O.25L截留液冷凍干燥后，得HRP2. 52g，經SDS-PAGE電泳分析，HRP純度為89. 3%。實施例3
從辣根中提取辣根過氧化物酶的方法，步驟
(1)取I.Okg新鮮的辣根，用蒸餾水洗凈，切成5mm左右的小塊，在I. 5L水下勻漿，用IM的HCl調勻漿液pH值為4. O ;
(2)將步驟(I)得到的勻漿液在10°C下充分攪拌3小時，離心取上清液I.ISL0離心條件為4°C,5000g,30min ；
(3)利用截留分子量為70kDa的平板式超濾膜(聚醚砜材質，O.09m2)對步驟(2)獲得的I. 18L上清液進行超濾分離，獲得濾出液O. 94L。分離條件進口壓力O. 3MPa，出口壓力O. 2MPa，流速 I. 4L/h ；
(4)利用截留分子量為30kDa的平板式超濾膜(聚醚砜材質，O.09m2)對步驟(3)獲得的O. 94L濾出液進行超濾濃縮，獲得截留液O. 23L。分離條件進口壓力O. 4MPa，出口壓力
O.5MPa，流速 I. lL/h ；
(5)將步驟(4)獲得O.23L截留液冷凍干燥后，得HRP1. 60g，經SDS-PAGE電泳分析，HRP純度為88. 7%。實施例4
從辣根中提取辣根過氧化物酶的方法，步驟
(1)取I.Okg新鮮的辣根，用蒸餾水洗凈，切成5_左右的小塊，在1.5L水下勻漿，用氫氧化鈉調勻衆液pH值為11 ；
(2)將步驟(I)得到的勻漿液在OV下充分攪拌3小時，離心取上清液I.15L。離心條件為4°C,6000g,30min ；
(3)利用截留分子量為70kDa的平板式超濾膜(聚醚砜材質，O.09m2)對步驟(2)獲得的I. 15L上清液進行超濾分離，獲得濾出液O. 93L。分離條件進口壓力O. 3MPa，出口壓力
O.2MPa，流速 I. 4L/h ；
(4)利用截留分子量為IkDa的平板式超濾膜(聚醚砜材質，O.09m2)對步驟(3)獲得的O. 93L濾出液進行超濾濃縮，獲得截留液O. 27L。分離條件進口壓力O. 4MPa，出口壓力
O.5MPa，流速 I. lL/h ；
(5)將步驟(4)獲得O.23L截留液冷凍干燥后，得HRP1. 64g，經SDS-PAGE電泳分析，HRP純度為88. 5%。 實施例1-4中步驟(3)和(4)中超濾膜的組件形式為中空纖維素膜、平板膜或卷式膜。本發明經操作條件改進及超濾膜 優化，也可用于分離和純化其它過氧化物酶。
權利要求
1.一種超濾提取辣根過氧化物酶的方法，其特征在于，主要包括以下步驟 (1)、將辣根破碎、浸提、離心得到辣根過氧化物酶粗提液； (2)、將辣根過氧化物酶粗提液用截留分子量為70kDa-100kDa的超濾膜進行超濾分離，得到辣根過氧化物酶超濾液； (3)、將辣根過氧化物酶超濾液用截留分子量為l-30kDa的超濾膜進行超濾濃縮，得到辣根過氧化物酶濃縮液； (4 )、將辣根過氧化物酶濃縮液脫水得到辣根過氧化物酶。
2.根據權利要求I所述的超濾提取辣根過氧化物酶的方法，其特征在于，所述的步驟(O中的浸提為將破碎后辣根的在水或Tris-HCl緩沖溶液下勻漿，并調節ph為4-11，然后在0-10°C攪拌3小時；所述步驟(I)中的離心溫度為4°C，離心力大于5000g，離心時間大于10分鐘。
3.根據權利要求I或2所述的超濾提取辣根過氧化物酶的方法，其特征在于，所述步驟(2)和(3)中超濾膜的組件形式為中空纖維素膜、平板膜或卷式膜。
4.根據權利要求3所述的超濾提取辣根過氧化物酶的方法，其特征在于，所述步驟(4)中的脫水為冷凍干燥。
全文摘要
本發明屬于生物分離工程與技術領域，具體是應用超濾技術從辣根中分離提取辣根過氧化物酶的方法。本發明的技術方主要包括以下步驟(1)、將辣根破碎、浸提、離心得到辣根過氧化物酶粗提液；(2)、將辣根過氧化物酶粗提液用截留分子量為70kDa-100kDa的超濾膜進行超濾分離，得到辣根過氧化物酶超濾液；(3)、將辣根過氧化物酶超濾液用截留分子量為1-30kDa的超濾膜進行超濾濃縮，得到辣根過氧化物酶濃縮液；(4)、將辣根過氧化物酶濃縮液脫水得到辣根過氧化物酶。本發明具有操作簡單、分離濃縮同步進行、產品回收率高、產品純度達85%以上、并利于工業放大等特點，具有良好的應用前景。
文檔編號C12N9/08GK102618514SQ201210112799
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月18日 優先權日2012年4月18日
發明者孫海霞 申請人:孫海霞