一種來源于惡臭假單胞菌的抗hppd抑制劑基因及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物基因工程領域和植物遺傳工程學領域，具體涉及一種來源于惡臭假單胞菌的抗HPro抑制劑基因及其在轉基因植株中的應用。
【背景技術】
[0002]對羥苯基丙酮酸雙氧化酶(4一HPPD，ECl.13.11.27)是大部分生物體內催化酪氨酸代謝的重要的酶 lknder D A.Amino Acid Metabolism(2nd ed) [M].Lon一don: JohnWiley & Sons，1985: 208—221.它可催化酪氨酸降解產物對羥苯基丙酮酸轉化為尿黑酸，尿黑酸是植物體內一種重要物質，它可以進一步脫酸、聚戊二烯基化和烷基化，從而生成光合作用中電子傳遞所需要的質體醌和生育酸(Crouch N.P.等人1997,Tetrahedron,53,20,6993-7010,Fritze等人，2004,Plant Phys1logy 134:1388-1400)自從HPPD酶在20世紀30年代被發現以來，已不斷從鼠、雞、豬、狗及人類的肝臟中以及假單細胞菌、玉米、胡蘿卜、小麥等體內提取出來Barta 1.C.&P.B oger，Purificat1n and Characterizat1n of4-HydroxyphenyIpyruvate D1xygenase from Maixe,Pestic.Sc1., 1996， 48: 109-116.[5]0
[0003]已經證明HPPD抑制劑作用于靶酶HPPD，可有效抑制對羥苯基丙酮酸轉化為尿黑酸，從而導致質體醌和生育酚的合成受阻。質體醌和生育酚是光合作用中電子傳遞所需要的重要物質，因而HPro抑制劑同時起著光合作用電子傳遞抑制劑的角色。此外，質體醌還是八氫番茄紅素去飽和酶的關鍵輔助因素，質體醌的減少使八氫番茄紅素去飽和酶的催化作用受阻，從而影響類胡蘿卜素的生物合成。類胡蘿卜素既可作為光吸收體，又可作為保護性物質，降低三線態葉綠體或單線態氧的激發，類胡蘿卜素的生物合成被抑制將導致植物最終死亡。這樣HPro抑制劑同時又起著八氫番茄紅素去飽和酶抑制劑的角色，是一類很有前途的除草劑。
[0004]早在1985年就有報道指出，HPH)可能是開發除草劑新品種的新靶標；1992年發現，三酮類化合物是HPro的潛在抑制劑;到目前為止，除了 80年代開發的吡唑類品種外，新近又開發出若干廣譜高活性新品種，即三酮類的磺草酮與甲基磺草酮以及異惡唑類的百農思。這表明，HPro作為靶標，涉及的化合物類型不斷增多，成為今后開發除草劑新品種的重要領域之一。目前，已經商業化的HPro抑制型除草劑主要屬于四個化學家族:三酮類(例如磺草酮、甲基磺草酮)、二酮腈類、異噁唑類(例如異噁氟草)、吡唑類(例如吡唑特、吡草酮和芐草唑)。
[0005]目前，HPro抑制劑型除草劑被廣泛應用到對其具有代謝耐受性的植物中(例如玉米可迅速代謝掉HPPD抑制劑)，用以防治雜草。為了能擴大HPPD抑制劑型除草劑的應用范圍，迫切需要對植物(特別是沒有代謝耐受性的植物)進行改造，以賦予其對HPro抑制劑的耐受性。
[0006]已有很多報道通過向植物中轉入外源的HPro抑制劑抗性基因以賦予植物對HPPD抑制劑的耐受性，例如，Dufourmantel等人將假單胞菌屬的HPPD抑制劑抗性基因轉入煙草和大豆中，獲得了對異惡卩坐草酮的耐受性(DuDufourmanteI等人，2007,Plant B1technolJ.5(l):118-33)o
[0007]在W099/24585中，公開了一個突變的ΗΡΗ)核苷酸序列及其獲得對某些ΗΡΗ)抑制劑具有耐受性的植物。
[0008]為了提高轉基因農作物的抗性水平和增加抗性基因的多樣性，生產應用中仍然需要新的HPro抑制劑抗性基因和以此為基礎的抗HPro抑制劑轉基因植物。
[0009]本發明所提供的新的HPPD抑制劑抗性基因，是發明人用PCR的方法從發明人篩選的高HPro抑制劑抗性菌株中克隆得到。本發明進一步在擬南芥、水稻、玉米等植物中證明了這個HPH)抑制劑抗性基因的抗HPH)抑制劑能力及其在發展轉基因抗HPPD抑制劑農作物中的用途。
【發明內容】
[0010]本發明所要解決的技術問題在于提供新的使植物具有HPPD抑制劑抗性的基因及其編碼蛋白。另外，本發明還提供了這個基因的基因工程中間體(如表達盒、載體和細胞等)，獲得具有HPPD抑制劑抗性的植物的方法和應用，并提供了判斷植物是否具有HPro抑制劑抗性的鑒定方法。
[0011]具體而言，在第一方面，本發明提供了一種對HPro抑制劑具有高抗性的新基因，本發明所提供的HPro抑制劑抗性基因，是發明人篩選并克隆到的一種新的抗HPro抑制劑基因(以下稱為Pp-HPro基因)?ρ-HPro基因是用PCR方法從發明人篩選的高HPro抑制劑抗性菌株惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)中克隆得到的。惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida) H-6為本發明人從噴灑HPPD抑制劑的試驗田土壤中經初篩和復篩等大量的實驗得至Ij的對HPPD抑制劑具有高耐受活性的菌株。菌株H-6于2015年12月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.11896，保藏單位的地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所。Pp-HPPD基因是下述核苷酸序列之一:
1)序列表中SEQID NO:1所示的核苷酸序列；
2)與SEQID N0:1序列具有90%以上相似性且編碼相同功能蛋白質的DNA序列；
3)與SEQID NO:1相比，具有SEQ ID NO:1序列的部分、區段和/或片段(包括臨近片段和與全長分子相比內部和/或末端缺失)、其變體、突變體、嵌合體和融合物且可編碼賦予HPH)抑制劑抗性活性的蛋白質的核苷酸序列；
4)根據SEQID NO:1，利用同一個氨基酸的不同密碼子而獲得的不同的核苷酸序列，這些序列編碼高HPH)抑制劑抗性活性的蛋白質多肽；
5)通過導入SEQID NO:1所示的核苷酸序列的其他變異但是仍然編碼具有抗HPH)抑制劑能力的蛋白質的核苷酸序列。
[0012]本發明第一方面的HPro抑制劑抗性基因的核苷酸序列可以有多種不同的變異，包括但不限于:I)利用同一個氨基酸的不同密碼子而獲得的不同的核苷酸序列，這些序列編碼相同活性的蛋白質多肽;2)通過導入核苷酸序列的其他變異但是仍然編碼具有抗HPPD抑制劑能力的蛋白質的核苷酸序列。這種變異可以是隨機的變異，也可以是針對性的點變異，還可以是插入或者缺失的變異。本領域的一般技術人員就能夠通過分子生物學的方法產生上述變異。
[0013]在第二方面，本發明提供對HPro抑制劑具有高抗性的一種新的HPro抑制劑抗性基因的編碼蛋白，由本發明第一方面的基因編碼，該蛋白是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質:
1)由SEQID No:2代表的氨基酸序列組成的蛋白質，
2)與SEQID No:2代表的蛋白序列相比，由具有替代、缺失或添加一個或幾個氨基酸的氨基酸序列組成且賦予高HPH)抑制劑抗性活性的蛋白質。
[0014]3)與SEQ ID No:2代表的蛋白序列相比，有具有SEQ ID No:2序列的部分、區段和/或片段(包括臨近片段和與全長分子相比內部和/或末端缺失)、其變體、突變體、嵌合體和融合物且賦予高HPro抑制劑抗性活性的蛋白。
[0015]在知曉具體序列的前提下，通過常規技術，如PC