專利名稱：在轉基因苜蓿植株中的蛋白生產的制作方法
技術領域：
本發明涉及在苜蓿植株中生產轉基因蛋白。更具體地講，本發明涉及轉基因苜蓿植株中生產多聚體蛋白，以用于諸如診斷測定的多種應用。
用于多種藥物相關應用的蛋白的使用要符合政府確立的嚴格管理要求。例如，在美國，生物制品評價和研究中心(CBER)公布了一套文件，概述了關于轉基因生產的蛋白的生產和監測的要求(參見fttp∥www．fda．gov／cberftp／html)，在加拿大，有一套相似的與生物制品生產的應用相關的管理條例。CBER文件指出，應該由可靠的持續的資源生產生物制品，以確保獲得一致的制品(ftp∥ftp．fda．gov／cber／ptc／ptc_mab．txt)。這是因為在批準所述制品使用之前，必須對所述制品進行多方面測試和驗證，并且所述制品必須可以以同樣的形式得到以用于未來的銷售。有幾個建立成熟的表達系統用以生產生物制品，包括用于細胞培養物的主細胞庫、轉基因植物的種子庫、用于轉基因表達系統的病毒種子原種和用于轉基因動物的建立者品系。為使用瞬時表達系統必須產生主載體種子原種，并且定期測試所述表達構成物的穩定性。如果要由細胞系生產諸如單克隆抗體的蛋白，則主細胞庫和工作細胞庫均需要關于親代細胞系的特征鑒定、細胞生產方案、純化和質量控制的文件。尤其是如果開始臨床試驗，對生產或配制的任何改變則需要對主細胞庫和工作細胞庫以及制品進行廣泛的再特征鑒定，因為這些改變可能導致生物活性的顯著改變。CBER文件“用于人類用途的單克隆抗體制品的生產和測試中考慮的要點”(1997年2月28日)中陳述“建議用于臨床前研究的材料的生產采用的方法應該與用于或計劃用于生產臨床試驗的材料的方法相同”。而且，如果將進行任何擴大生產，例如用于2期研究，則“可能必須證明制品的可比性…這可能需要或不需要額外的臨床研究”(ftp∥ftp．fda．gov／cber／ptc／ptc_mab．txt)、已經用植物來生產轉基因蛋白，然而，以上討論的適用于主細胞系的維持的考慮同樣適用于植物相當物(參見Miele，1997)。由于種子不可能無限貯存，因此用于轉基因植物的種子庫需要定期擴增。種子原種的貯存必須減少對所述目的轉基因(the transgene of interest)的潛在的遺傳損害。可能影響種子庫的任何其它因素也必須加以控制，包括昆蟲、真菌或細菌對種子的污染。此外，必須檢測所述轉基因的穩定性以及產物在一批給定種子的代表植株中的表達水平、或在再擴增種子庫后產物在各批種子之間的表達水平。也可能需要比較由不同種子庫生產的制品的額外的資料。這后一特征鑒定也適用于鑒定在收獲種子原種中年與年之間的變異。一般而言，制品的研制需要持續檢測轉基因產物的生化特性和生物特性(Miele，1997)。當這些標準與用以生產多聚體蛋白植物系統結合時，問題復雜化了，因為為了生產能夠生產多聚體蛋白的雜交種子，得自各批同源種子、如上概述需要再擴增和維持的轉基因植株需要雜交，以生產最終的雜交種子，這又必須如上所述進行維持。顯然，需要穩定的并且導致持續供應蛋白、而不需廣泛維持多個種子庫的替代的轉基因蛋白的資源。
在文獻中，充分確立了用植物制備轉基因蛋白，并且已經建立了幾個成功的轉化系統。已經通過煙草植株的有性雜交子代生產多聚體蛋白(Hiatt 1990，Hiatt和Pinney，1992；Ma等1995)，然而，迄今為止，在藥學應用方面已經用于轉基因蛋白生產的所有植物來源都利用一年生植物。這必需不斷地如上所述擴增并且再檢驗種子庫原種。顯然，如果利用多年生植物物種來產生轉基因蛋白，則可能大大降低總體維持費用和各批之間的變異性。而且，如果收獲多年生植物的營養體結構作為轉基因蛋白的來源，則更降低了管理上的要求。為了確保轉基因蛋白多年生來源的生產，必須考慮涉及上述關于得自穩定、持續來源的制品的可靠性一致性的要求的許多因素。
最重要的血液分組試劑之一是用以檢測不凝集型抗體的抗人IgG試劑。已經獲得了具有合適抗人IgG特異性的小鼠mAb，并用其逐漸取代傳統用于Coombs試劑的兔多克隆抗人IgG(St Laurent等1993)。這些mAb用B細胞雜交瘤的大規模培養物生產。盡管該方法可靠，但該方法很昂貴，因為它需要復雜的設備、昂貴的培養基和受過訓練的人員。與mAb其它診斷應用相比，用于血庫測試的蛋白的市場是高度競爭性的；因此蛋白的價格相對低，并且mAb生產的成本效率已成為關鍵的問題。
編碼mAb輕鏈和重鏈的cDNA克隆的分離，已經允許抗體基因在各種異源系統中表達，所述異源系統包括細菌、真菌、昆蟲細胞、植物和非淋巴類哺乳動物細胞(Wang等1995；Wright等1992)。在這些系統中，植物看來是成本效率方面最有前途的系統之一。然而，根據煙草中的初步證明，重要的是發現使該技術可以滿足市場性的現代要求的作物。Hiatt等(WO 96／21012，1996年7月11日公開)公開了用于在植物中制備用于抗真菌病原體的治療免疫球蛋白(“保護蛋白”)的方法。在EP 0 657 538中，Galeffi和Natali公開了用于治療或診斷應用、識別乳房腫瘤和卵巢腫瘤中存在的HER-2癌基因的抗體的生產。重要的是發現可以生產重組蛋白、且可以滿足對市場性的現代要求的作物。這些要求不僅包括生產成本的競爭性，而且包括可靠性，這暗示除非可以建立長期穩定的純化重組分子的供應，否則必須開發一些方法，確保可以衍生克隆群體的認可的源材料的持久性(perenniality)。對于B細胞雜交瘤，通過建立主細胞庫確保持久性，所述主細胞庫包括取自同源庫并在液氮中冷藏的等份細胞。Hiatt(1990)提出，苜蓿、大豆、番茄和馬鈴薯作為繁殖抗體的宿主可能是有用的供替代的選擇。苜蓿是在目前農業生態系統中生產的最便宜的植物生物質之一，在大多數氣候條件下的其多年生性使得它成為持續農業的有吸引力的作物。而且，苜蓿(Medicago sativa L．)不需要每年耕種和栽種，并且建立成熟了殘留植物組織用于動物飼料的用途(Austin和Bingham，1997)。然而，幾項研究已經檢查了青貯飼料物種中蛋白水解的程度，已知蛋白水解在豆科植物飼料物種中比禾本科植物物種中更加廣泛，而苜蓿顯示最高水平和程度的蛋白水解(Jones等1995；Papadopoulos和McKersie，1983)。此外，本領域眾所周知，不是所有的苜蓿植物都是多年生的，在多年生苜蓿植物中，不是所有的均適合于轉化方案(Desgagnés，1995)。
在文獻中已經已經關注到轉基因蛋白在植物組織中以及在提取時的穩定性。然而，對于抗體在植物細胞系統中的穩定性知之甚少(Wongsamuth和Doran，1997)。數位研究人員(Hiatt等(1989)、During等(1990)、Ma等(1995)、Ma和Hein(1995)、Schouten(1996))已經觀察到，包含指導構成物在內質網中共同翻譯插入的信號序列的嵌合構成物，提高構成物在轉基因植物中的穩定性。在缺乏前導序列的情況下，轉基因蛋白的得率非常低(Hiatt等，1989)。通常的作法是，在提取混合物中包括蛋白抑制劑，以便將來自轉基因植物組織的蛋白得率最大化。然而，由植物適合市場地生產轉基因蛋白需要簡單性。例如，Austin和Bingham(1997)綜述了于田間位點的大規模浸漬和汁液提取方案，并且數小時后于加工廠進行加工。這類方案使用水和機械浸漬，并且如果提取物中的蛋白水解嚴重，或如果在提取期間需要蛋白酶抑制劑，則這類方案可能不可行。對于已知尤其在收獲后表現出高速率蛋白水解的苜蓿物種的應用而言，尤其如此(Jones等1995；Papadopoulos和McKersie 1983)。
目前1公斤的mAb的市值為＄1，000，000-＄10，000，000。在當預期產量為每年100g的250m2的溫室條件下，估計產生的每克C5-1的生產成本(包括用于提取和純化的加熱、人力和消耗品在內)時，每克C5-1的成本將為＄500-＄600，而產生的市值為＄400，000。這類估計表明，在植物中可以成本有效地生產重組蛋白，然而，需要建立合適的植物系統。本發明一個實施方案的一個方面涉及確定合適轉基因植物系所需的特性，所述轉基因植物系可以用來生產符合CBER建議書中建立的關于生物制品化合物標準的目的轉基因蛋白。
本發明也涉及生產用于血清學測定的蛋白的方法，包括用編碼所述蛋白的目的基因轉化苜蓿植株，并選擇表達所述蛋白的轉化苜蓿植株或選定苜蓿植株的子代，以及從轉化植株提取所述蛋白。本發明一個實施方案的一個方面涉及用親和層析純化所述蛋白。
本發明也涉及用于紅細胞血清學的單克隆抗體的生產方法，包括a)用包含編碼單克隆抗體的基因的載體轉化苜蓿，以產生轉化體，b)根據所述轉基因基因的存在選擇轉化體，c)培育所述轉化體，以生產由所述轉基因基因編碼的單克隆抗體，d)收獲所述轉基因苜蓿植株的地上部分，e)從所述轉基因苜蓿的所需組織提取所述單克隆抗體，f)讓所述轉基因苜蓿植株再生長，和g)重復步驟c)-f)，并且可任選地復制所述轉基因植株。本發明也涉及該方法，其中可任選的繁殖所述轉基因植物的步驟包括任何無性繁殖方法，包括莖繁殖或胚胎發生繁殖。本發明一個實施方案的再一方面涉及用親和層析純化所述單克隆抗體。
本發明也包括用該方法生產的單克隆抗體。
本發明也涉及在轉化苜蓿中生產目的蛋白的方法，包括
a)用含編碼目的蛋白的基因的載體轉化合適的苜蓿基因型，以產生轉化體，b)根據所述轉基因基因的存在篩選合適的轉化苜蓿基因型，c)培育所述轉化的合適苜蓿基因型，以生產所述目的蛋白，d)收獲所述合適的轉基因苜蓿基因型的地上部分，e)從所述合適的轉基因苜蓿基因型的所需組織提取所述目的蛋白，f)讓所述合適的轉基因苜蓿基因型再生長，和g)重復步驟c)-f)。
本發明也涉及能夠表達多聚體生物活性蛋白的轉基因苜蓿植株。
盡管本發明以單克隆抗體C5-1的制備作為實例，但實際上可以按照本發明的方案在轉化苜蓿中制備任何目的產物。現有技術中尚未公開過的、采用合適的苜蓿基因型來表達轉基因蛋白的優點，包括蛋白在以下部分中的穩定性1)收獲的組織，得自所述植株并讓其風干，且在提取之前貯存；2)在水中收獲的提取物，所述提取物于室溫下且在缺乏以下物質的情況下收獲穩定劑、蛋白酶抑制劑、緩沖劑、鹽、抗氧化劑、還原劑、穩定劑或通常加入提取混合物中以確保蛋白穩定性和活性的其它添加劑；3)在生長季節內和生長季節之間的同一植株過度重復收獲物；和4)無性繁殖體。
此外，因為苜蓿是多年生植物，能夠營養繁殖，所以在跨越許多生長季節的相當長的時間內可以獲得并收獲無性材料。這確保在轉基因苜蓿內目的蛋白的穩定來源。在用于轉基因蛋白生產的其它常用的植物內沒有發現這類特征，所述常用的植物往往是一年生植物，包括煙草、擬南芥屬、大豆和玉米。然而，不是所有的苜蓿變種均是多年生的，并且已知許多多年生且高產(從農藝上講)的變種不適合于轉化方案。因此，本發明也涉及用于生產轉基因蛋白的合適的苜蓿系或基因型的選擇方法，所述方法包括a)篩選苜蓿基因型或品系的文庫，以確定多年生的基因型或品系；b)根據胚胎發生潛力篩選在(a)中鑒定的所選擇的品系或基因型；c)根據轉化能力篩選在(b)中鑒定的所選擇的品系或基因型；d)根據轉基因蛋白的穩定性篩選在(c)中鑒定的所選擇的品系或基因型。
本發明也涉及合適的苜蓿基因型或得自所述合適的苜蓿基因型的繁殖體，用于生產在符合生物制品管理批準要求方面有用的轉基因蛋白。所述合適的苜蓿基因型在特征在于為多年生的，表現出為胚胎發生潛力，可被轉化，且不降解所述轉基因蛋白，使得所述蛋白在體內在干燥的氣生組織中以及在提取步驟期間是穩定的。此外，本發明包括所述合適的苜蓿基因型的繁殖體，包括無性衍生的繁殖體諸如莖，或胚胎衍生的繁殖體。
圖2顯示C5-1肽在單轉基因苜蓿植株和雙轉基因苜蓿植株中的表達和裝配。不用巰基乙醇，在Tris-HCl(50mM)、PMSF(2mM)和NaCl(150mM)的存在下提取蛋白。將蛋白經SDS PAGE分離，并電轉移至硝酸纖維素膜上。通過用兔抗小鼠IgG，然后用偶聯于過氧化物酶的抗兔IgG，在印跡上檢測C5-1肽。用Boehringer Manheim BM化學發光試劑盒，經化學發光檢測到過氧化物酶活性。L道得自表達κcDNA的親代植株的蛋白提取物。H道得自表達γcDNA的親代植株的蛋白提取物。F1道得自既表達κcDNA也表達γcDNA的F1子代的蛋白提取物。Hyb道由雜交瘤細胞分離的C5-1mAb。
圖3顯示植株C5-1的純化。圖3A，由膨脹床親和層析(STREAMLINETM-r蛋白A基質)純化的C5-1的洗脫分布圖。每個流分含有1．5ml流出液，由這些流出液每道上樣20μl，圖3B，并在非還原條件下在SDS-PAGE上分離，并用考馬斯藍染色。
圖4顯示在苜蓿葉或煙草葉的情況下共同提取的C5-1蛋白的蛋白質印跡。在2μg轉基因植物或雜交瘤培養物生產的C5-1的存在下，提取2克苜蓿葉或煙草葉組織。于0℃用10ml水進行提取，于20，000xg離心，并于25℃溫育至多3小時，然后進行蛋白質測定，以測定提取溶液中殘留的C5-1的量。
圖5顯示得自表達C5-1的雙轉基因苜蓿植株地上部分的蛋白的蛋白質印跡，將所述地上部分切割并讓其于室溫下干燥至多5天。將等量的收獲組織于20％的相對濕度下保持0h、7h、1天、2天和5天，然后提取并確定蛋白分布圖(圖5A)，并用蛋白質分析測定C5-1的水平(圖5B)。
圖6顯示在靜脈內注射后的一個月時期內植物衍生的C5-1(·)和雜交瘤衍生的C5-1(O)在小鼠中穩定性。用抗固定化人IgG的ELISA進行檢測。
按照本發明，“目的基因”是指能夠編碼蛋白的基因。然而，該定義也適用于其混合的轉錄和翻譯產物導致產生多聚體蛋白的目的基因，所述多聚體蛋白用作生物制品，諸如血清學測定內的生物制品。可以采用既立的方案(例如Desgagnés等，1995)，用目的基因轉化苜蓿。盡管苜蓿基因組的復雜性，但通過農桿菌介導的基因轉移獲得的性狀是穩定的，并按照簡單的孟德爾模式進行有性傳遞(Desgagnés等，1995)。這種特征對于生產的蛋白(包括多聚體蛋白在內)是必需的。盡管不希望限制可以用本發明以任何方式生產的蛋白的類型，但多聚體蛋白的一個實例可以是mAb，諸如C5-1。以下例舉該蛋白的生產和特性。
“啟動子”是指在所述啟動子區控制下基因表達的起始和調節方面有活性的DNA序列區，正如本領域技術人員所通常理解的。該DNA序列通常在結構基因編碼序列的上游(5’)，通過為RNA聚合酶和／或使轉錄于正確位點起始所需的其它因子提供識別，而控制所述編碼區的表達。
一般有兩種類型的啟動子，即誘導型和組成型。“誘導型啟動子”是能夠直接或間接激活一種或多種DNA序列或基因對誘導物應答而轉錄的啟動子。在缺乏誘導物時，所述DNA序列或基因將不被轉錄。通常，特異性地結合于誘導型啟動子以激活轉錄的蛋白因子以無活性形式存在，然后被誘導物直接或間接地轉化為活性形式。誘導物可以是化學因子，諸如蛋白、代謝物、生長調節劑、除草劑或酚類化合物，或是由熱、冷、鹽或毒性成分直接施加的生理脅迫，或通過病原體或諸如病毒的致病因子的作用間接施加的生理脅迫。通過將誘導物諸如通過噴灑、澆水、加熱或類似的方法外部應用于所述細胞或植物，可以將含有誘導型啟動子的植物細胞暴露于所述誘導物。另外，誘導型啟動子包括組織特異性啟動子，它們以組織特異性方式起作用，以在所述植物的選定組織中調節目的基因。這類組織特異性啟動子的實例包括種子、花或根特異性啟動子，它們也是本領域眾所周知的。
“組成型啟動子”是指指導基因在植物的所有不同部分并且在整個植物發育中持續表達。已知的組成型啟動子的實例包括與CaMV35S轉錄物和農桿菌Ti質粒胭脂堿合酶基因相關的啟動子本發明的基因構成物包括3’非翻譯區。3’非翻譯區是指基因包含這樣的DNA區段的部分，所述DNA區段含有多腺苷酸化信號和能夠實現mRNA加工或基因表達的任何其它調節信號。所述多腺苷酸化信號的特征通常為實現將多腺苷酸積加至mRNA前體的3’端。根據存在與規范形式5’AATAAA-3’的同源性而識別多腺苷酸化信號，盡管變異是常見的。合適的3’區的非限制性實例是含有以下基因的多腺苷酸化信號的3’轉錄的非翻譯區農桿菌腫瘤誘導(Ti)質粒基因諸如胭脂堿合酶(Nos基因)，和植物基因，諸如大豆貯藏蛋白基因和核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基(ssRUBISCO)基因。
本發明的基因構成物也可以包括其它可任選的調節基元，諸如可能是需要的增強子或者為翻譯增強子或者為轉錄增強子。這些增強子區對于本領域技術人員是熟知的，可以包括例如35S調節區的增強子區以及得自其它調節區的其它增強子和／或ATG起始密碼子和相鄰序列。起始密碼子必須符合編碼序列的讀框，以確保翻譯完整的序列。翻譯控制信號和起始密碼子可以得自多種起源，包括天然和合成的。翻譯起始區可以由轉錄起始區源提供，或由結構基因提供。所述序列也可以得自選擇以表達所述基因的增強子，且可以被特異性地修飾，以增加所述mRNA的翻譯。
為有助于轉化植物細胞的鑒別，還可以操作本發明的構成物，以包括植物選擇標記。有用的選擇標記包括但不限于提供對抗生素抗性的酶，所述抗生素諸如慶大霉素、潮霉素、卡那霉素等。同樣，提供產生可根據顏色變化鑒別的混合物的酶諸如GUS(β-葡糖醛酸糖苷酶)或提供產生可根據發光鑒別的化合物的酶諸如熒光素酶是有用的。
本發明也考慮了含有本發明嵌合基因構成物的轉基因植物。本發明也涉及得自表達目的基因的轉基因植株的部分，例如葉、莖、種子、花或根。這些選定的植物部分可以得自用包含或者組成型或者誘導型啟動子的載體轉化的植物。由植物細胞再生整個植株的方法是本領域已知的，獲得轉化和再生的植株的方法對于本發明不重要。一般而言，在合適的培養基中培養轉化的植物細胞，所述培養基可以含有諸如抗生素的選擇劑，在此選擇標記用來便于轉化植物細胞的鑒別。一旦形成愈傷組織，則可以通過利用合適的植物激素，按照已知方法，促進形成胚胎或苗，并且將苗轉移至生根培養基以再生植株。然后，可以或者由種子或者采用營養繁殖技術用所述植株建立重復世代。
可以采用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、微注射、電穿孔等，將本發明的構成物引入植物細胞中。關于這類技術的綜述，請參見例如Weissbach和Weissbach(1988)和Geierson和Corey(1988)。本發明還包括包含所述嵌合基因構成物和參與所述基因構成物表達的相關5’和3’調節區的合適的載體。
“合適的苜蓿系”或“合適的苜蓿基因型”是指多年生的、表現出胚胎發生潛力(例如每20個葉圓盤或其它外植體組織至少1個胚胎發生愈傷組織)、可轉化并且其中根據所述文件討論的穩定性標準(參見實施例3)轉基因蛋白是穩定的苜蓿基因型或系。不是所有的苜蓿基因型或系都是多年生的，眾所周知，許多苜蓿多年生基因型或系是不能進行胚胎發生的，并且不能轉化，或者這些特性在轉化后可能改變(Desgagnés，1995)。即使由于先前所述的優點，苜蓿植株看來作為宿主植株是有前途的，但已知苜蓿植株表現出高蛋白酶活性。事實上，在表征的飼料物種中，豆科飼料在青貯中表現出比禾本科物種更高程度和速率的蛋白水解，而苜蓿在豆科飼料中顯示最大程度和最高速率的蛋白水解(Jones等1995)。而且，已經證明，在諸如煙草的其它植物物種中，轉基因蛋白易于被內源蛋白水解活性降解(例如Hiatt等，1989)。當人們綜合考慮這兩種因素時，完全未預料到，可能分離出表現出確保轉基因蛋白穩定性的特性的合適的苜蓿基因型。因此，重要的是確定合適的苜蓿基因型中任何蛋白水解活性是否針對所述植株中生產的目的轉基因蛋白。為了確保可接受的蛋白水解活性，應該獲得某些最低標準。這些最低標準將根據所述轉基因蛋白的應用需要而變化。例如，如果需要大量的所述轉基因蛋白，則所述蛋白應該在水性提取物中是穩定的，最好在缺乏任何加入的組分(諸如蛋白酶抑制劑)或通常加入提取溶液中的其它試劑的情況下是穩定的。也可能要求所述轉基因蛋白在干燥過程中和干的收獲的組織中是穩定的，便于大規模收獲所述植物。
通過篩選苜蓿植物文庫，以確定多年生的苜蓿植株，然后根據胚胎發生潛力篩選這些選定基因型或系，然后根據轉化能力篩選選定的基因型或系，而獲得合適的苜蓿基因型或系。然后，用目的蛋白轉化這些植株，并測定所述蛋白在粗提取物中和在干燥的氣生組織中的穩定性。然后，可任選地，驗證轉基因蛋白用作生物制品的實用性。為了舉例說明本發明，表征一個胚胎發生苜蓿基因型11．9，然而，也可能已經使用了其它基因型。確立該基因型為多年生、胚胎發生、可轉化的并且如下指出的，表現出可忽略的針對轉基因蛋白的蛋白水解活性。然而，人們會理解，該基因型將被認為是可以采用上述標準選擇的可能的苜蓿基因型或系的一個實例，并且該基因型不意味著在篩選方法應用或由于該篩選方案獲得的植株方面是限制性的。
為了研究可以用于試劑中的目的蛋白的成本有效的制備方法，考慮了在合適的苜蓿基因型或系中生產轉基因蛋白。因為已經證明mAbC5-1可用于紅細胞血清學，所以由雜交瘤細胞cDNA文庫克隆了C5-1重鏈和輕鏈，并且在轉化苜蓿植株之前將其置于35S啟動子控制之下(參見實施例1)。然而，人們會理解，該mAb以及35S啟動子的應用可以分別作為可以使用并在合適的苜蓿基因型或系中生產的嵌合基因構成物和蛋白的一個實施例提供，并且該實施例決不是限制性的。
通過RNA印跡分析(
圖1)和蛋白質印跡分析(圖5)證實所述基因在轉基因組織中表達，確定C5-1在合適的轉基因苜蓿植株中的表達。通過提取組織的蛋白質印跡測定，所述轉基因表達的mAb在于室溫下或在大田條件下經數天干燥的氣生組織中是穩定的(實施例3，圖5)。當在苜蓿葉的情況下共同提取時，該mAb也是穩定的，而與煙草葉共同提取C5-1時，該mAb顯著低(實施例3，圖4)。當其它抗體與苜蓿共同提取并在一段時間內溫育時，也觀察到類似的結果(參見實施例3，表1和表2)。此外，當靜脈內注射給小鼠時，由植物衍生的C5-1表現出與由雜交瘤衍生的C5-1相同的穩定性(圖6)，表明由于植物衍生蛋白的糖基化如同雜交瘤衍生蛋白的糖基化，因此獲得類似程度的保護。如果考慮采用苜蓿大規模生產和收獲目的蛋白，則由于這類方法通常使收獲的組織暴露于長期的風干和簡單的水性提取方案，所以這些特性是重要。
已知某些苜蓿變種的營養結構表現出低水平的鞣質(Morris和Robbins 1997)。盡管不希望受理論的束縛，但這些苜蓿組織提取物中蛋白的穩定性提高可能是酚類化合物和鞣質水平降低的結果。已經發現這些特征限制了苜蓿作物飼料作物的應用，正在進行的第一步是提高該植物中酚類化合物的水平，以提高其作物飼料的效率(Morris和Robbins 1997)，然而，這些特性對于本發明公開的目的是有益的。
采用粗制澄清的提取物的親和層析純化植物C5-1，在用考馬斯藍染色時，表明最終的制備物無污染物(參見實施例2)。對于先前報道的方法(例如During等1990)這是一個顯著的改進。在純化過程期間也沒有明顯的C5-1損失，因此由植物中的C5-1至純化的C5-1的得率估計超過70％。
當在ELISA和標準化血細胞凝集測定中測試時，純化的植物衍生C5-1的免疫反應性與其得自雜交瘤細胞的對應物類似。雖然在粗提取物中存在幾種裝配類型，但所公開的純化方法產生的H2L2形式用作雜交瘤衍生C5-1在血清學試驗中的反應性應答方面不可區別。這表明，植物C5-1可以與雜交瘤衍生的C5-1一樣有效地用作診斷蛋白。
為了批準基于mAb的蛋白，管理機構要求用于mAb生產的活材料必須是穩定的，以確保所述生物活性分子的質量和產量不隨時間而變化(www．fda．gov／cber／cberftp／html；Miele，1997)。通過測定由F1子代兩個基因型獲得的再生體內C5-1的濃度，并比較這些濃度與親代材料內的濃度(參見實施例3)，檢查植物繁殖體之間C5-1的穩定性。這些結果表明，植物組織內C5-1的濃度在繁殖體之間保持恒定，并且這類轉基因苜蓿系看來是穩定的C5-1mAb源。可以體外引入如11．9的具有高胚胎發生潛力的基因型，來以高比率產生無性繁殖體。可以使所述繁殖體進入休眠、干燥至15-20％含水量，用人工胚乳包被，并于-80℃貯藏(McKersie和Bowley，1993)。該克隆材料可以保持數年而不顯著喪失萌發潛力，因此構成了回收(retrieve)與原始活材料相同的材料以起始新的生產循環的細胞庫。也設想本領域技術人員已知的無性繁殖體的其它來源可以用來持續繁殖合適的苜蓿基因型。其它來源可以包括但不限于胚、莖或能夠繁殖的其它營養結構。
此外，因為苜蓿是多年生植物且能夠營養繁殖，所以可以獲得無性材料，并在跨越許多生長季節的相當長的時間內直接從大田收獲。這意味著一棵植株可以在10年或10年以上的時間內重復收獲。同一原種材料的這種再生能力和可更新有效性，確保了在轉基因苜蓿中目的蛋白的一致來源。在通常用于轉基因蛋白生產的其它植物中，諸如在煙草、擬南芥、大豆、玉米或許多苜蓿基因型或系中，沒有發現這類能力和特征。
作為植物體(plantibody)策略商業應用，在轉基因苜蓿中大規模生產C5-1mAb是非常有前途的，因為與包括其它植物在內的許多異源系統相比，它代表一個經濟的選擇。而且，應用合適的苜蓿基因型提供最大限度降低根據生物制品的批準和臨床試驗所需的特征鑒定和維持細胞庫的成本的能力。
在大田規模方面，成熟苜蓿植物地段有1-3×106單株／公頃；這確立了無性繁殖體的生產成本為約＄8，000。根據我們對繁殖的轉基因苜蓿中抗體含量的估計(0．13-1．0％總可溶性蛋白)，每年一公頃的產量將為500-1000g。苜蓿是多年生作物，這種植物的田間生產性能可以維持3-4年。這將使得在開放耕地利用(open-field exploitation)方面所述原料的生產成本為＄3，000／kg mAb。用常規雜交瘤細胞培養物(約50mg C5-1mAb／L)生產1kg C5-1mAb的生產成本估計為約2×106美元。即使將雜交瘤培養物的抗體產量提高20-40倍，降低的成本(約750，000＄／kg)仍顯著高于植物衍生的C5-1。
關于從轉基因植物大規模純化mAb尚未有報道。先前的關于純化植物衍生mAb的報道表明，純化為均質在親和層析前后需要復雜的操作(During等1990)。利用膨脹床吸附層析，有助于按比率擴大本發明的純化方法。該技術在縮短的時間范圍內，由大體積的粗略澄清的提取物產生純化的肽，因此看起來開創了降低從膠體提取物的純化成本的新方法。
此外，用得自雜交瘤細胞培養物的未純化上清液制備Coombs試劑，因此，如果觀察到部分純化的植物制備物于4℃的較長的穩定性，則它們可能適用于這種診斷。
采用在缺乏上述緩沖液(參見表1)的情況下與苜蓿共同提取的單克隆抗體(25F5，人mAb)和多克隆(hISG，人免疫球蛋白)抗體，進一步研究蛋白在苜蓿提取物中的穩定性。結果表明，在4天溫育后，在于室溫下貯藏的苜蓿提取物中有顯著量的免疫學可檢測到的蛋白。
表1與苜蓿提取物共同收獲的和在苜蓿提取物中溫育的蛋白的穩定性
2)在從轉基因苜蓿植株提取期間重組蛋白的穩定性通過將雙轉基因植物葉在純水中勻漿，也證明了粗提取物中轉基因C5-1的穩定性。這類葉提取物具有小但顯著的緩沖能力，這是在含100g新鮮葉的提取物中以約0．4pH單位(pH6．5-8．5)／摩爾NaOH確立的。結果表明，這些提取物可以于室溫保持，而至少2小時pH不顯著改變。作為轉基因C5-1的提取劑，單獨的水與含蛋白酶抑制劑的緩沖液(緩沖液A)一樣好，在該基本提取系統中，C5-1于室溫下保持100％穩定至少2小時(表2)。
表2-植物C5-1在粗蛋白提取物中的穩定性
*通過鼠IgG特異性ELISA測定3)蛋白在收獲的植物組織中的穩定性為了確定將苜蓿地上部分干燥對C5-1水平和／或從轉基因氣生組織提取C5-1的能力是否有影響，收獲了一株雙轉基因植株，讓其于25℃、20％的相對濕度下干燥至多30天。在該干燥時期結束時，葉材料的含水量低于20％，這是在大田條件下觀察到的水平。在該干燥期間收獲等量的葉材料，對其提取并用蛋白質分析測定C5-1水平。正如在顯示前5天數據的圖5中觀察到的，對于來自正在干燥或已經干燥的苜蓿葉的可提取轉基因蛋白的量，沒有觀察到降低。當收獲植株并在大田條件下保持時，在干燥30天后觀察到相同的結果。4)C5-1在給予小鼠后的穩定性給小鼠靜脈內給予等量的苜蓿衍生C5-1或雜交瘤衍生的C5-1，檢測在28天的時期內獲得的血漿樣品中的蛋白的存在。該試驗的結果示于圖6。給予的C5-1蛋白在小鼠中的半衰期對于雜交瘤衍生蛋白或植物衍生蛋白是相同的。這提示，植物衍生C5-1通過糖基化受到保護，其程度與雜交瘤衍生蛋白相似。在5天時間內注射的蛋白損失50％后，剩余的蛋白在接下來的20天時期內再下降25％。評價時期結束時，在小鼠內可檢測到原始供應的蛋白的25％。5)苜蓿繁殖體中蛋白的穩定性為了確立轉基因表達在轉基因苜蓿繁殖體內的穩定性，檢查15株得自F1子代的兩種基因型的葉組織中的C5-1濃度。通過在節間莖節(stem section)上誘導生根，制備繁殖體。分析來自這兩種基因型的15株再生植株的C5-1含量，將其與親代材料中的C5-1水平比較。表3所示數據顯示這一試驗的結果，并表明C5-1水平在親代材料和繁殖的材料中觀察到的水平之間保持不變。表3-可提取的C5-1在世代之間的穩定性基因型2 基因型3原材料*原材料*14．4μg／g葉 14．4g／g葉121．2μg／g 1613．4μg／g217．9μg／g 1718．2μg／g316．9μg／g 1819．7μg／g418．5μg／g 1915．1μg／g517．8μg／g 2014．5μg／g615．0μg／g 2115．6μg／g716．1μg／g 2214．6μg／g814．4μg／g 2312．4μg／g921．8μg／g 2415．6μg／g1014．2μg／g2517．5μg／g1118．4μg／g2617．4μg／g1218．2μg／g2718．0μg／g1317．3μg／g2816．8μg／g1415．1μg／g2917．2μg／g1512．7μg／g3014．6μg／g17．0±2．53μg／g 16．0±1．99μg／g*在先前的試驗中已經測定了原始值為14．4實施例4抗原結合活性和血細胞凝集素活性用ELISA試驗進一步測試植物衍生C5-1 mAb的抗原結合能力。來自生產C5-1的植株的葉提取物的連續稀釋液用于該試驗。表4A顯示了用1／10稀釋樣品獲得的光密度值。結果表明，植物C5-1mAb被抗小鼠IgG抗體識別，提示植物產生的抗體的總體構象為IgG的構象。此外，植物C5-1特異性地識別人IgG，表明H鏈和L鏈正確折疊形式抗原結合位點。初步試驗表明，C5-1植物提取物可以特異性地使以人IgG致敏的紅細胞凝集。對親和純化的物質的更完全的表征與雜交瘤衍生C5-1mAb平行進行。結果(表4B)表明，植物衍生C5-1mAb特異性地使抗D-致敏人RBC凝集，于6μg／ml下產生完全的(4+)反應，這與用雜交瘤衍生的C5-1mAb觀察到的結果相似。
用抗鼠IgG作為包被抗體的ELISA測定也用來測定親代轉基因植株的反應性。表5A表明，在L-單轉基因植株中沒有檢測到信號，而在含有H鏈的植株中檢測到信號。這些結果用來確定粗提取物中免疫反應性物質的量。然后，在用人IgG包被的孔中測試已知量的粗提取物的反應性(表5B)。這第二個試驗表明，單獨的重鏈不與人IgG反應。它也表明，植物H2L2的比活與來自雜交瘤細胞的C5-1的比活相似。通過測定平衡下的解離常數，比較植物衍生抗體對其抗原的真正的親和力與雜交瘤衍生抗體的親和力。植物衍生C5-1和雜交瘤衍生C5-1的KD分別為4．7×10-10M和4．6×10-10M。表4-植物衍生C5-1mAb的反應性。(A)ELISA測定；(B)血細胞凝集A) 490nm下的光密度固定化抗體測試的材料 山羊抗小鼠 人IgG對照植株的 0．000±0．000 0．000±0．000提取物(1／10)轉基因植株的 0．243±0．007 0．531±O．014提取物(1／10)C5-1雜交瘤 O．414±0．034 0．643±0．035上清液(1／10)B)血細胞凝集素強度樣品 未包被的 抗-D-包被的RBC RBC- -無對照抗人IgG-++++試劑雜交瘤C5-1(6μg／ml) -++++植株C5-1(6μg／ml) -++++表5-親代和F1轉基因植株的免疫反應性(A)和比活(OD／100ng)(B)A)光密度 μg／ml提取物來自雜交瘤細胞的IgG 0．376±0．008 0．28*L(1／1) 0．000 --H(1／4) 0．560±0．049 0．10±0．01**HL(F1，1／6)0．328±0．027 0．25±0．02B)光密度 比活提取物來自雜交瘤細胞的IgG0．332±0．032 0．235±0．020L(1／1) 0．000 --H(1／4) 0．000 --HL(F1，1／6)0．334±0．011 0．267±0．080-* 來自純化的流分，0．28μg／ml**根據H2L2結構計算的選擇膨脹床吸附(STREAMLINETMr Protein A)，使得可以將部分澄清的含膠體物質的植物提取物以高流速上樣。采用該技術，由非澄清的植物粗提取物純化植物C5-1，通過在SDS-PAGE凝膠上的考馬斯藍染色，顯示純化的植物C5-1作為單一肽(圖3B)。
所有科學出版物和專利文件均通過引用結合到本文中。
已經通過優選實施方案描述了本發明。然而，對于本領域技術人員顯而易見的是，在不偏離以下權利要求所述的本發明范圍的情況下，可以進行多種變化和修改。
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權利要求
1．用于血清學測定的蛋白的生產方法，包括用編碼所述蛋白的目的基因轉化苜蓿植株，選擇表達所述蛋白的轉化的苜蓿植株，并且從所述轉化的苜蓿植株中提取所述蛋白。
2．權利要求1的方法，其中所述蛋白得自所述選定的轉化苜蓿植株的繁殖體。
3．權利要求2的方法，其中所述繁殖體包括莖衍生的繁殖體。
4．權利要求2的方法，其中所述繁殖體包括胚衍生的繁殖體。
5．權利要求1的方法，其中所述蛋白為單克隆抗體。
6．權利要求1的方法，其中在使用之前純化所述蛋白。
7．權利要求6的方法，其中所述蛋白用親和層析純化。
8．權利要求1的方法，其中所述植株為苜蓿再生性基因型11．9。
9．用權利要求5的方法生產的單克隆抗體。
10．在轉化的苜蓿中生產目的蛋白的方法，包括a)用含編碼目的蛋白的基因的載體轉化苜蓿，以產生轉化體，b)根據所述轉基因基因的存在篩選轉化的苜蓿，c)培育所述轉化的苜蓿，以生產所述目的蛋白，d)收獲所述轉基因苜蓿植株的地上部分，e)從所述轉基因苜蓿的所需組織提取所述目的蛋白，f)讓所述轉基因苜蓿植株再生長，和g)重復步驟c)-f)。其中在水的存在下，從所述轉化的苜蓿植株中提取所述目的蛋白。
11．權利要求10的方法，其中所述目的蛋白為單克隆抗體。
12．權利要求10的方法，其中步驟b)-g)用所述轉基因植株的繁殖體進行。
13．權利要求12的方法，其中所述繁殖體包括莖衍生的繁殖體。
14．權利要求12的方法，其中所述繁殖體包括胚衍生的繁殖體。
15．權利要求11的方法，其中所述提取所述目的蛋白的步驟包括純化。
16．用權利要求11的方法生產的單克隆抗體。
17．用于生產轉基因蛋白的合適的苜蓿基因型的選擇方法，包括a)篩選苜蓿基因型文庫，以確定多年生的基因型或品系；b)根據胚胎發生潛力篩選在(a)中鑒定的所選擇的基因型或品系；c)根據轉化能力篩選在(b)中鑒定的所選擇的基因型或品系；d)根據轉基因蛋白的穩定性篩選在(c)中鑒定的所選擇的基因型或品系。
18．權利要求17的方法，其中步驟(d)包括測定所述轉基因蛋白在所述植物地上部分中的穩定性。
19．權利要求18的方法，其中步驟(d)包括測定在合適苜蓿基因型的粗提取物中的穩定性。
20．權利要求19的方法，其中所述轉基因蛋白在干燥的氣生組織中是穩定的。
21．權利要求19的方法，其中所述轉基因蛋白在所述合適的苜蓿植株的水性提取物中是穩定的。
22．適用于生產能符合管理批準要求的轉基因蛋白的苜蓿基因型，所述苜蓿基因型的特征在于它為多年生的，表現出為胚胎發生潛力，可被轉化，且在所述苜蓿基因型中生產的轉基因蛋白在體內、在干燥的氣生組織中以及在提取步驟期間是穩定的。
23．如權利要求16中定義的苜蓿基因型的無性繁殖體。
24．權利要求23的無性繁殖體，其中所述繁殖體是莖衍生的繁殖體。
25．權利要求23的無性繁殖體，其中所述繁殖體是胚衍生的繁殖體。
26．得自權利要求23中定義的無性繁殖體的人工種子。
27．在權利要求22中定義的苜蓿基因型的干燥的氣生組織。
全文摘要
本發明涉及特征鑒定適用于生產功能性轉基因蛋白的宿主系統;所述功能性轉基因蛋白用于需要政府管理批準的應用,諸如抗人IgG。眾所周知;管理機構要求用于生產轉基因蛋白的主細胞庫和主細胞系是穩定和持久的,以確保足夠的材料用于合適的特征鑒定、臨床試驗和潛在的銷售。目前的植物生產系統需要建立用于此目的的種子庫。然而;有許多缺點與用于生產持續可靠的轉基因蛋白源的這種系統相關。本發明的一方面涉及特征鑒定適用于符合嚴格管理要求的轉基因蛋白的植物生產系統。本發明的另一方面例舉了通過在轉基因苜蓿植株中表達相應的基因,生產和特征鑒定用作血清試劑的抗人IgG。將人IgG特異性IgG2a(κ)鼠mAb(C5—1)的重鏈和輕鏈的cDNA通過農桿菌感染轉移入苜蓿中。獲得了表達編碼輕鏈和重鏈的mRNA的轉基因植株,發現來自F1子代(通過有性雜交獲得的)的植株表達完全裝配的C5—1。此外,所述轉基因蛋白在體內以及在提取和純化步驟期間是穩定的。純化產生獨特的H2L2形式,在標準化血清學試驗中其反應性不可與雜交瘤衍生C5—1的反應性區分。結果表明,植物衍生的轉基因蛋白諸如mAb可以與雜交瘤衍生的mAb一樣有效地用作診斷試劑,并且證明轉化的苜蓿系統生產大量蛋白(包括諸如mAb的多體蛋白)的有用性。
文檔編號C07K14/705GK1290302SQ98812925
公開日2001年4月4日 申請日期1998年11月10日 優先權日1997年11月10日
發明者L·P·維茲納, S·拉伯格, R·巴津, H·克豪迪, R·萊米烏克斯, G·阿拉德 申請人:加拿大農業及農業食品部, 赫馬-魁北克公司, 加拿大血液服務公司, 拉瓦爾大學