專利名稱：蘇云金芽胞桿菌vip1like1、vip2like1基因組合及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物防治技術領域，特別是涉及蘇云金芽胞桿菌vipl、vip2基因組合及其應用。
背景技術：
蠐螬是金龜總科(Scarabaeoidea)幼蟲的總稱，屬于鞘翅目，鰓金龜科，是地下害蟲中種類最多，也是危害最大，造成植物損失最大的種類。金龜子總科種類繁多，世界上記載的有3萬多種，目前我國已記錄1800多種，這類害蟲食性雜、分布廣、生活隱蔽、適應性強、生活史長短不一，其中為害農林牧草的有100多種，防治十分困難。最主要的有暗黑鰓金龜(Holotrichia parallela)、華北大黑觸金龜(Holotrichia obeita)和銅綠麗金龜(Anomala carpulenta)等。蠐螬生活習性復雜多樣，危害蟲態也各異，有的以成蟲危害，有的以幼蟲危害。蠐螬成蟲喜食作物，林果木(楊，榆，柳，蘋果，梨等)葉片、嫩莖和花蕾，果穗等，造成危害。蠐螬幼蟲危害更為嚴重，幼蟲棲居地下，取食萌發的種子咬斷幼苗的根莖，蛀食根塊莖等，造成輕則缺苗斷壟，重則毀種絕收。幼蟲不僅危害范圍廣，而且為害時間長，從春季到秋季，從播種到收獲都有較大危害。蠐螬啃食地下塊根、塊莖，使作物生長衰弱，直接影響產量和品質，如花生、紅薯、馬鈴薯、蘿卜類春秋受害嚴重。蠐螬啃食后不僅影響產品的外觀品質，還易招致病菌從傷口入侵，對冬菜貯藏帶來很大不便。近年來隨著城市發展，草皮綠化面積逐年加大，對綠化植被的維護已經成為城市發展中的一項重要工作。蠐螬幼蟲咬食草皮根莖，以及進一步引起的病害入侵成為城市綠化草皮的主要危害之一。此外，蠐螬還是危害豬群的寄生蟲病(豬巨吻棘頭蟲)中間宿主和傳播媒介，棘頭蟲寄生于豬的小腸，糞肥施于田間，蠐螬是其中間寄主。因此，蠐螬是危害農業、林業、城市綠化的重要害蟲。蠐螬是國內外公認的難以防治的地下害蟲，作物地下部分損失的86%是由蠐螬造成的，據統計常年全國蠐螬發生面積約700萬公頃，一般減產20% 30%。嚴重年份全國蠐螬發生面積曾達2000萬公頃，減產達到50%以上(姜常松，姜福軍，包信平.(2008)花生蠐螬播種期一次用藥全生育期控制技術，現代農業科技，121-123.)，甚至絕產，成為目前最重要的地下害蟲。花生因蠐螬為害一般情況造成減產20% 40%，嚴重時可減產70% 80%，甚至絕產，并使花生品質下降大大挫傷了群眾種植花生的積極性(劉樹森,李克斌，尹姣，曹雅忠(2008)蠐螬生物防治研究進展，中國生物防治，168-173。許婷婷，江晨，宮清軒，陳金鳳，曲明靜(2010)青島市花生田蠐螬發生與無公害防治研究，花生學報，42-44。王振軍，郭志剛，雷曉天，茹德平.(2010)花生田蠐螬發生原因與防治技術，農業科技通訊， 198-200。張改霞，王永芳，魏改紅(2010)夏花生田蠐螬的發生與防治，農家參謀，11)。2007年8月中下旬在山東省菏澤地區挖查，蠐螬蟲口密度平均為8. 7頭/m2，最高達22頭/m2(王愛東.(2008)農田蠐螬發生及綜合防治技術，現代農業科技)。2003 2007年，在無棣縣采取黑光燈誘集與春、夏、秋3季挖土調查相結合的方法。對大田作物進行了隨機調查,大豆田、玉米田金龜子分別達5. 63和3. 00頭/m2。大豆田金龜子發生的種類最多，為7種。其中中華弧麗金龜最多，占50. 2%，銅綠麗金龜次之，占25. 1%。華北大黑鰓金龜第3，占13. 0%，其他種類較少。玉米田華北大黑鰓金龜最多，占38. 7%，銅綠麗金龜次之，占29. 5%，暗黑鰓金龜第3，占14. 6%，其他種類較少(田方文，彭彥明，張偉華，崔少英(2008)山東省無棣縣農田金龜子種類調查及發生規律研究，安徽農業科學，12322-12323)。目前，由于機械化作業的推廣，農業生產的耕作制度的改變，比如免耕耕作制度、秸桿還田等技術的推廣，給蠐螬帶來了舒適的生存環境與豐富的食物，增加了單位面積的蟲口數，使得蠐螬危害日益加重，特別是東北、華北和華中地區，給蠐螬的防治帶來了困難(裴桂英，馬賽飛，劉健，劉保才(2010)大豆田不同耕作模式對蠐螬發生及產量的影響，科學種養)。篩選具有特異性殺蟲譜的新Bt菌株始終是Bt研究最活躍的領域。90年代以來，人們在總結回顧Bt殺蟲劑防治害蟲的歷史時發現，現有的Bt殺蟲劑主要是用于防治地上的敏感性鱗翅目害蟲，用于防治鞘翅目葉甲類害蟲的很少。但是起主要殺蟲活性作用的伴孢晶體蛋白和芽孢在陽光中的紫外線照射下很容易失活，喪失殺蟲活性(初立良，鄭桂玲，周洪旭，李長友，李國勛.兩株殺鞘翅目害蟲Bt菌株的生物活性及殺蟲蛋白基因鑒定，華北 農學報，2010 (3))。應用Bt制劑防治蠐螬具有一定的優勢，因為蠐螬生活環境隱蔽，避免了伴胞晶體和芽孢受紫外線的照射，能延長殺蟲持效期，提高殺蟲效果(劉樹森，李克斌，尹姣，曹雅忠(2008)蠐螬生物防治研究進展，中國生物防治，168-173)。因此，一些Bt研究者將研究重點轉向篩選對主要地下害蟲一金龜子類幼蟲具有殺蟲活性的菌株上，并取得突破性進展。目前，已有不少報道關于對蠐螬有效的菌株與基因，1992年，Ohba等在世界上首次篩選出對銅綠麗金龜、日本弧麗金龜幼蟲有特異殺蟲活性的一株Bt新菌株(Bt. subsp.japonensis BuiBui),這是Bt首次用于對擠贈的防治研究。Sato等于1994年從該菌株中克隆得到新的殺蟲基因_cry8Cal。1994年，美國Mycogen公司從Bt菌株PS50C分離的cry8Aal 和 cry8Bal 對花金龜 Cotinis sp 有明顯的殺蟲活性。Shin-ichiro Asano 等 2003年發現的含有cry8Da的Bt菌株SDS-502對銅綠異麗金龜有高活性。我國的相關基因發掘是2002年以后開始的。河北省農科院植保所篩選出多株對黃褐麗金龜(Anomala. exoleta)和銅綠麗金龜(Anomala. . corpulenta)幼蟲具有特異殺蟲活性的Bt菌株(馮書亮，王容燕，范秀華，胡明峻.一株對金龜子類幼蟲具有殺蟲活性的蘇云金桿菌新分離株[J].中國生物防治，2000(2) :74-76)。2004年，中國農業科學院植物保護研究所從菌株HBF-I中克隆得到對銅綠麗金龜高效的cry8Ca2基因，隨后進行了突變研究，提高了對銅綠麗金龜的殺蟲活性。2006年，中國農業科學院植物保護研究所又發現Bt菌株Btl85對暗黑鰓金龜具有較好殺蟲活性，這是發現的第一株對暗黑鰓金龜有殺蟲活性的基因，2008年從該菌株中克隆得到了模式基因cry8Fal和對暗黑鰓金龜高活力的模式基因crySEal。2009年，中國農業科學院植物保護研究所又發現了同時對暗黑鰓金龜和大黑鰓金龜高殺蟲活性的Bt菌株HBF-18，從該菌株中分離到對大黑鰓金龜與暗黑鰓金龜都有效的第二分類等級的新基因crySGal。研究結果表明自然界中存在對蠐螬具有特異殺蟲活性的菌株與基因，通過篩選高效殺蟲菌株與基因，可以利用Bt來蠐螬進行有效的生物防治。目前發現對擠贈有殺蟲活性的Bt基因有cry3、cry8、cry23、cryl8、cry37、cry43等類基因。研究較多的是cry8類基因，cry8類基因由1160-1210個氨基酸組成，分子量在128-137kDa之間。這些菌株與基因的克隆為我國的蠐螬防治提供了優質菌株資源，也為進一步開發抗蠐螬轉基因作物提供了基因資源。
除cry基因外，Bt還有其他編碼殺蟲蛋白的基因。營養期殺蟲蛋白(Vegetativeinsecticidial protein,Vips)是在蘇云金芽孢桿菌在細胞營養期發現的一種非晶體的新型胞外殺蟲蛋白，Estruch和Warren等人于1996年和1998年分別從Bt菌株AB88和蠟狀芽孢桿菌(B. cereus)菌株AB78的上清液中發現了 Vip殺蟲蛋白(Estruch et al. 1996)。該類蛋白從對數生長中期開始分泌，直到穩定前期達到最高峰；一般不形成伴孢晶體且與已知的ICPs沒有序列相似性，最重要的是其殺蟲作用機理與ICPs不同。該蛋白的發現使Bt在殺蟲活性、殺蟲范圍方面得到很大突破，并在一定程度上克服了多種害蟲對ICPs低敏感或不敏感的弊端。目前Vips命名規則分為4大類(Vipl，Vip2，Vip3和Vip4)，其中Vipl與Vip2是一種二元毒素，兩者需要協同 作用，目前研究顯示這類毒素對鞘翅目害蟲具有殺蟲活性(US5770696，US6656908，US6605701等專利);Vip3類是一大類對鱗翅目高效的殺蟲蛋白，特別是Vip3Aa類蛋白對草地灘夜蛾、小地老虎等害蟲有較好殺蟲活性，克服了 Bt殺蟲晶體蛋白對其不敏感的弱點(Estruch et al. 1996) ;Vip4類蛋白是新發現的一類營養期殺蟲蛋白，其具體功能還不清楚。20世紀90年代以后，隨著化學農藥的大規模應用而產生的問題越來越突出，我國逐漸限制了相關高毒農藥的使用，從2007年I月I日起，已全面禁止了甲胺磷等高毒化學農藥在農業生產中的應用。高毒化學農藥的逐漸退場無疑給生物農藥騰出了巨大的市場空間。依照我國農藥行業確定的“十二五”規劃，農藥產業將繼續深化高毒農藥的替代工作，預計到2015年，高毒農藥所占比重將由目前的20%降低到5%左右，而生物農藥占所有農藥的份額將由現在的不足10%增加到30%以上。為了獲得最佳的社會、經濟和生態效益，改善農業生態環境，實現我國農業經濟的可持續發展，保障糧食、食品安全生產，增強我國農產品國際競爭力，研發和推廣以生物防治為核心的蠐螬綜合防治技術是目前主流趨勢。菌株HBF-18對大黑鰓金龜與暗黑鰓金龜有較好殺蟲活性，本項目組從中分離到對暗黑鰓金龜與大黑鰓金龜都有活性的cry8Gal基因。cry8Ga基因也是目前唯一報導的對大暗黑鰓金龜有活性的cry基因類型。然而，cry8Ga基因的表達產物與出發菌株(HBF-18)相比，有較大的差別，結果顯示含有crySGa基因的無晶體突變株對大黑鰓金龜與暗鰓金龜的活性比出發菌株要低，其LC5tl分別高出50倍與70倍(Shu et al. 2009)(表1-1)。在申請人克隆的其他對蠐螬有活性的基因則沒有這種現象。在轉入cry8Ca、cry8Ea、cry8Ha與cry8Ia等基因的Bt無晶體突變株具與其出發菌株HBF_l、Btl85以及BtSU4有相當的殺蟲效果(表1-2，1-3)。這些現象表明，菌株HBF-18中除了含有cry8Ga基因外，還含有一些其他新的殺蟲基因。表1-1.菌株HBF-18與HD8G (只有cry8Ga基因的表達表達菌株)對大黑鰓金龜與暗黑鰓金龜的殺蟲活性比較
~大黑鰓金龜暗黑鰓金龜
菌株 -
LC5o(^g 毒素 g_1 土壤)a Slope士S.E.Mb LC50((ig 毒素 g_1 土壤)a Slope士S.E.Mb
0.1078
HBF-18 0.2043 (0.1218-0.3109) 1.4621±0.1625 ,、 1.3428±0.1673
(0.0686-0.1695)
10.15347.3846
HD8G,、 2.5759±0.1876 ,、 1.5424±0.1814
(5.5692-18.5115)(4.9120-11.1019)
3括號中是95%置信區間13平均值土標準誤表1-2.菌株HBF-I與HD8C (只有cry8Ca基因的表達表達菌株)對銅綠麗金龜的殺蟲活性比較
權利要求
1.一種蛋白組合物，含有Vipllikel與Vip21ikel的蛋白，所述Vipllikel蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N03所示，所述Vip21ikel蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N04所示。
2.根據權利要求I所述的蛋白組合物，僅由Vipllikel與Vip21ikel的蛋白組成。
3.據權利要求I所述的蛋白組合物，還含有Cry8Gal蛋白。
4.權利要求1-3任一所述的蛋白組合物在抗鞘翅目害蟲中的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，是將蛋白組合物制成殺蟲劑殺鞘翅目害蟲。
6.根據權利要求4所述的應用，是將分別含有表達蛋白的基因載體轉入同一植物或微生物中，使其表現抗鞘翅目害蟲的特性。
7.根據權利要求6所述的應用，其中表達Vipllikel蛋白的基因的序列如SEQID NOl所不，表達Vip21ikel蛋白的基因序列如SEQ ID N02所不，表達Cry8Gal蛋白的基因序列如SEQ ID N05所示。
8.根據權利要求7所述的應用，所述含有表達蛋白的基因載體分別為pSTKvip2A，pSTKviplB, pSTKvip8Gal，其結構如圖 16 所示。
9.根據權利要求6所述的應用，所述微生物為蘇云金芽胞桿菌無晶體突變株HD-73-。
10.根據權利要求4-9任一所述的應用，所述鞘翅目害蟲為蠐螬。
全文摘要
本發明涉及“蘇云金芽胞桿菌vip1like1、vip2like1基因組合及其應用”，屬于生物防治技術領域。本發明人從出發菌株HBF-18中克隆得到vip1like1、vip2like1基因，其序列分別為SEQ ID NO1和SEQ ID NO 2。本發明發現，vip1like1、vip2like1基因之間，cry8Ga1與vip1like1、vip2like1基因之間存在相互的協同作用，表現出對鞘翅目害蟲的高毒力，特別是對暗黑鰓金龜的殺蟲效果非常好。該基因組合對主要地下害蟲蠐螬的生物防治以及我國農業綠色可持續發展都有極其重要的意義，進一步為開發抗蠐螬的Bt工程菌株、轉基因作物提供基因來源。
文檔編號C12N1/21GK102633884SQ20121011982
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月21日 優先權日2012年4月21日
發明者宋福平, 張彥蕊, 張 杰, 彭琦, 束長龍, 耿麗麗 申請人:中國農業科學院植物保護研究所