專利名稱：人工合成Bt抗蟲基因Cry1F-t及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程和生物防治領域，具體涉及ー種人工合成Bt抗蟲基因Cry IF-1及其應用。
背景技術：
Bt基因編碼殺蟲晶體蛋白，來自蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringHansis),為革蘭氏陽性土壌桿菌。它在芽孢形成過程中產生稱為S-內毒素的殺蟲伴胞晶體蛋白(控制合成這種蛋白質的基因在質粒上)，這些蛋白具有很高的殺蟲活性。其作用原理為這種抗蟲蛋白能被堿性腸液溶解，水解為更小的活性毒素片段-核心片段(Hofte and ffhiteley,1989)。活性片段能抗蛋白酶的進一歩水解，被激活的蛋白質結合在昆蟲腸道上的刷狀小泡上，引起穿孔從而影響滲透平衡，細胞膨脹并溶解，靶標生物停止取食并最后死亡。研 究表明許多Bt蛋白，靶標害蟲的腸道上皮細胞都具有高親和性的結合位點(Hofte andffhiteley, 1989)在過去的幾十年里，已確定數十種蘇云金芽孢桿菌菌系及130多種它們編碼的殺蟲晶體蛋白。研究證明，Bt晶體蛋白對人體、哺乳動物、鳥類、魚類以及很多有益昆蟲均無毒害作用，不污染環境，所以Bt制劑已作為ー種無公害的天然微生物殺蟲劑在農業、林業及環境衛生等方面應用了近50年。Bt晶體蛋白質必須被昆蟲取食到才能發揮殺蟲功能，但自然環境下Bt晶體蛋白質穩定性差，殺蟲效果受天氣影響大，太陽照后則易降解，也不能滲透到植物組織內部，易被雨水、露水沖刷掉，這些因素極大的限制了其發展應用。1987年，比利時Vaeck等人首次獲得轉Bt殺蟲蛋白抗蟲煙草，獲得的轉基因煙草只能檢測到微弱的抗蟲性，其表達蛋白幾乎檢測不到，只占可溶性蛋白的O. 001%。在我國，1992年，郭三堆等人采用植物優化密碼子方法首先在國內人工合成全長1824bp的GFMCrylA殺蟲基因，獲得了中國第一代單價抗蟲棉；丁群星等(1993)和王國英等(1995)分別用子房注射法和基因槍法將PB48. 415質粒轉入玉米愈傷組織中獲得轉基因植株，抗蟲性測定表明其具有一定抗蟲性；中國農業大學于1994年在國內外首次用子房注射的方法把抗蟲基因Bt轉入玉米并獲得轉基因植株；中國農業科學院周逢勇等在1998年將GFM殺蟲基因構建到PMG6質粒上，導入到玉米中，后代檢測表明Bt基因以孟德爾遺傳方式遺傳到下一代(LIU YJ等，2003)。當前，全世界已轉化成26種以上Bt轉基因植物，包括棉花、玉米、水稻等主要農作物。盡管轉基因技術可打破生殖隔離，實現不同物種間的基因轉移。但在某一物種內可聞效表達的基因，被轉化到另一物種后，表達量不一定聞，也未必一定具有其本來的功能，尤其是對于差異較大的物種。其中，物種密碼子偏好性是影響外源基因表達量的諸多因素之一。不同的物種往往具有不同的偏好密碼子。分析這種偏好性，在轉基因之前，對需要轉化的目的基因進行密碼子的重新設計或改造，對于提高外源基因在受體生物中的表達量具有重要作用。1983年美國華盛頓大學宣布成功將卡那霉素抗性基因導入煙草細胞，以及同年4月美國威斯康星大學宣布成功將大豆基因轉入向日葵共同標志著植物轉基因技術的誕生。1986年，首批轉基因植物(抗蟲、抗除草剤)被批準進入田間試驗。1989年哺乳動物抗體重鏈和輕鏈基因在煙草中成功表達并正確組裝成有功能的抗體。1990年Gordon-Kamm首次報道用基因槍轉化玉米懸浮細胞系獲得了可育的轉化體。隨后，玉米轉基因技術開始迅猛發展，大量轉基因植物陸續研制開發成功。KozHal (1993)等培育出了抗蟲轉基因玉米，轉基因植株能高水平表達CryIA(b)抗蟲基因。張秀君(1999)等用基因槍法將兩個含高賴氨酸蛋白質基因導入玉米的胚性愈傷組織。劉大文(2000)等將Zml3-Barnase基因轉化玉米胚性愈傷組織，經過除草劑篩選得到陽性植株。Ishida(1996)等首次利用超雙元載體建立了根瘤農桿菌轉化玉米自交系的幼胚，Frame (2002)等成功實現了根瘤農桿菌利用普通的雙元載體轉化幼胚。張艷貞(2002)等對根瘤農桿菌介導法將Bt殺蟲基因導入優良玉米自交系進行了較為系統的研究，Huang (2005)、Frame (2006)和Lee (2007)等分別利用農桿菌成功轉化了常規玉米自交系。我國在轉基因技術研究方面，已建立較成熟的玉米轉基因技術體系。如中國農業大學在國內較早的開展了玉米遺傳轉化的工作，于1994在國內外首次用子房注射的方法把抗蟲基因Bt轉入玉米并獲得轉基因植株，以自主知識產權基因Bt為代表的抗蟲玉米已展示了良好的開發前景。同時，在無選擇標記、選擇標記基因刪除和目標基因產物定時降解、植物組織特異性優勢表達等核心技術創新方面已具有較強的創新能力。目前已分離的 抗蟲基因很多，主要包括①細菌來源的抗蟲基因，主要是Bt毒蛋白基因(CryIAb、CryIAc、Cry2、Cry3等)植物來源的蛋白酶抑制劑基因，特點在于抗蟲譜廣、來源于植物本身易于被公眾接受；③細菌來源的營養殺蟲蛋白(Vipl、Vip2、Vip3等)，廣譜抗鱗翅目，特別是對小地老虎、粘蟲和甜菜葉蛾具有較強作用。由于基因抗蟲能力及昆蟲耐受性的影響，轉基因抗蟲產品主要通過獲得更多更有效的抗蟲基因、改造已有基因、雙抗植物體等途徑獲得。玉米既是重要的糧食作物，又是重要的飼料和エ業原料，當前玉米蟲害(以玉米螟為主)嚴重，造成玉米大量減產，因此采取有效措施控制其危害對提高玉米產量、增加農民收入具有重要的意義。由于缺乏合適的抗蟲品種，目前解決蟲害的主要方法是在生長過程中噴施化學殺蟲劑；但是化學殺蟲劑同時殺死害蟲及其天敵，造成生態不平衡和環境污染。通過轉基因技術可以將Bt抗蟲基因導入玉米品種中，進而提高轉基因玉米的抗蟲性，降低農藥的使用量，節省人力、物力及社會資源。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種可在作物中穩定表達、且表達量高、抗蟲效果好的人工合成抗蟲基因CrylF-t及其編碼蛋白，并將其應用于載體、宿主細胞的轉化構建等方面。本發明的另一目的是將改造抗蟲基因CrylF-t轉化玉米等其他植物，從而提高玉米等植物的抗蟲性。通過轉基因及常規育種手段，把抗蟲基因Bt轉入生產中普遍應用的骨干自交系中，為解決玉米等植物生產中的蟲害提供一條有效途徑。為解決上述技術問題，本發明通過以下技術方案實現CrylF-t基因是在野生型CrylF基礎上進行改造的，只留下部分缺失的N端1809bp的一段堿基序列(如SEQ ID NO :5所示)，并且在保持該段序列的氨基酸組成總體不變的情況下，用植物偏愛的密碼子置換序列SEQID No. 5相對應的密碼子，排除DNA序列中存在的造成植物轉錄不穩定的富含AT序列以及常用限制性酶切位點(SacI和XbaI)，然后通過置換密碼子的方法進行改正消除，并在3端加上終止密碼子TAG，獲得ー個改造的Cry IF-1基因序列(如SEQ ID NO : I所示)，其對應的氨基酸序列如SEQ ID NO : 2所示；另夕卜，在改造的抗蟲基因5端前面加上了 AdhI的增強子序列SEQ ID No. 3。然后確定并化學合成Adhl-CrylF-t如序列表SEQ. ID NO 4所示的編碼序列；根據基因功能分析的需要，進ー步對合成的產物進行PCR克隆并測序，合成的基因裝載在質粒載體PUC57上。將本發明基因與原核表達載體可操作地連接，能夠快速初步檢測本發明合成的Bt抗蟲基因CrylF-t表達產物對玉米螟的毒性。將本發明基因與植物表達載體可操作地連接，將表達載體導入相應農桿菌中(LBA4404)，并通過農桿菌介導法進行玉米愈傷組織和幼胚的遺傳轉化，得到轉人工合成CrylF-t基因的玉米轉化子，培育抗蟲轉基因玉米。也可以 對其它農作物或者果樹等進行遺傳轉化，使其具備抗蟲活性。本領域技術人員可以根據本發明公開的基因，以其轉化玉米、棉花、水稻、蔬菜等農作物，使其具備相應的抗蟲活性。本領域技術人員還可以將本發明基因轉化細菌或真菌，通過大規模發酵生產Bt蛋白，并將其制備成殺蟲劑，用于農作物害蟲的防治。本發明具有積極有益的效果本發明抗蟲基因CrylF-t序列與原始CrylF序列比較，改造后的基因設計了缺失和DNA序列改變，并在基因的前面加上AdhI增強子，大大增強了其在植物中的表達。使用植物偏愛性密碼子，減少了原始DNA序列中的富含AT序列和存在的反向重復序列以及不明確的真核DNA序列內含子序列。對于改造后的CrylF-t基因，與原始CrylF基因序列相比，G+C含量為由37. 65%提高到59. 04%。CrylF-t基因與原始DNA序列的同源性為69%。本發明抗蟲基因CrylF-t能在植物細胞中高效穩定的表達。此人工改造合成的Adhl-CrylF-t基因通過農桿菌介導、超聲波處理和基因槍轉化等手段導入玉米后，可以得到穩定遺傳的抗蟲的Adhl-CrylF-t轉化子。同時也可以把該Bt抗蟲基因CrylF-t轉化到棉花、水稻、蔬菜等農作物中，使其具備相應的抗蟲活性，從而降低農藥的使用量，以減少環境污染，具有重要的經濟價值和廣闊的應用前景。
圖I為含有增強子AdhI的新改造抗蟲基因Adhl-CrylF-t的合成及構建到質粒載體 pUC57 上的構建圖譜其中 I :PUC57 Xbal/SacI 雙切，2 PUC57+AdhI-CrylF-t XbaI/SacI 雙切，3 DNA mark SM0331,4 =PUCAdh I-Cry I F-t 質粒；圖2為含有增強子AdhI的新改造抗蟲基因AdhI-CrylF-t的合成及構建到原核表達載體PET28b 構建圖譜1 :PET28b載體Ndel/Hindlll 雙切，2 :PET28b載體+AdhI-CrylF_tNdel/Hindlll 雙切，3 DNA mark SM0331,4 PET Adhl-CrylF-t 質粒；圖3為含有增強子AdhI的新改造抗蟲基因AdhI-Cry lF-t的合成及構建到植物表達載體pCAMBIAl 300-Bar構建圖譜I =CPB載體Xbal/SacI雙切，2 =CPB載體+Adhl-CrylF-tXbal/SacI 雙切，3 DNA mark SM0331,4 : CPBAdh I-Cry IF-1 質粒；圖4為通過農桿菌介導法轉化含有增強子AdhI的新改造抗蟲基因Adhl-CrylF-t轉化流程及再生過程:A為浸染后的共培養；B為篩選培養；C為抗性愈傷組織；D為抗性愈傷的再生培養；E為抗性愈傷的分化培養；F為轉基因植株的生根培養；G為轉基因植株的移栽；H為溫室里的轉基因苗。圖5為TO代轉化體目的基因CrylF-t的PCR檢測，M DL2000plus其中CKl :陽性質粒對照，CK2 :非轉基因苗陰性對照，空白雙蒸水對照，1-6是CrylF-tl到CrylF_t6 ；圖6為TO代轉化體目的蛋白Cry lF-t的檢測圖譜，CKl :未轉基因苗陰性對照；1_6是 CrylF-tl 到 CrylF_t6。
具體實施例方式以下結合具體實施例進ー步闡述本發明。下述實施例中的試驗方法，如無特別說 明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料及試劑，如無特別說明，均購自常規生化試劑公司。實施例lCrylF-t基因的設計與人工合成Cry IF-1基因是在Bt基因CrylF的原始核苷酸序列的基礎之上，留下部分缺失的N端1809bp的一段堿基序列SEQ ID No. 5，并且在保持保留序列氨基酸組成總體不變的情況下，采用植物基因的偏愛性密碼子置換原始Bt的對應密碼子，消除Bt基因中ATTTA、AATGAA等富含AT序列和不明確的內含子序列，并副除基因中存在的大的反向重復序列和常用限制性內切酶識別位點序列，設計出目標合成的Bt基因的編碼序列如序列表SEQ IDNo. I所示。含有增強子AdhI的新改造Bt抗蟲基因Adhl-CrylF-t (如序列表SEQ. ID NO 4所示)委托上海生物工程有限公司(2011年I月)合成。所用試劑上海生物工程有限公司。具體方法步驟如下；(I)用DNA work軟件根據需要合成Adhl-CrylF-t基因序列設計引物(寡核苷酸單鏈)58條,姆條35-45bp,姆條約33ug,約為10D。(2) PCR連接引物為雙鏈DNA，兩輪PCR。
權利要求
1.一種人工合成Bt抗蟲基因CrylF-t，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
2.根據權利要求I所述人工合成Bt抗蟲基因CrylF-t，其氨基酸序列如SEQID NO 2所示。
3.一種含有權利要求I或2所述人工合成Bt抗蟲基因CrylF-t的原核表達載體。
4.一種增強權利要求I所述人工合成Bt抗蟲基因CrylF-t表達的AdhI增強子，其核苷酸序列如SEQ ID NO 3o
5.一種含有權要求I所述增強子AdhI和權利要求I所述人工合成Bt抗蟲基因Cry IF-1的Bt抗蟲基因Adhl-CrylF-t，其核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示。
6.一種由權利要求I所述人工合成Bt抗蟲基因CrylF-t編碼的殺蟲蛋白。
7.一種含有權利要求6所述殺蟲蛋白的殺蟲劑。
8.一種含有權利要求I或2所述人工合成Bt抗蟲基因CrylF-t的植物表達載體。
9.一種由權利要求8所述植物表達載體轉化的宿主細胞LBA4404。
10.權利要求I或2所述人工合成Bt抗蟲基因CrylF-t或權利要求7所述植物表達載體通過農桿菌介導方法進行玉米遺傳轉化的方法。
全文摘要
本發明提供了一種抗蟲基因Cry1F-t及其應用。對Cry1F基因進行全面改造，得到如SEQ ID NO1所示的Cry1F-t抗蟲基因，在其前面加上AdhI增強子，放在含有強啟動子35S的表達載體上，通過農桿菌介導的遺傳轉化方法將Cry1F-t基因轉到玉米基因組中，得到含有Cry1F-t的轉基因材料。實驗證明本發明改造合成的Bt毒蛋白對玉米螟有顯著的殺蟲效果，Cry1F-t及其表達的目的蛋白能夠在玉米中穩定高效表達，進而用于培育轉Cry1F-t基因抗蟲玉米。該Bt抗蟲基因Cry1F-t也可以在提高其它農作物、果樹或蔬菜等抗蟲性中的得到應用，為解決玉米等植物生產中的蟲害提供了一條有效途徑。
文檔編號C12N1/21GK102660560SQ20121012475
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月26日 優先權日2012年4月26日
發明者盧彩霞, 岳潤清, 柏松, 王延召, 鐵雙貴, 陳娜, 齊建雙 申請人:河南省農業科學院