專利名稱：一種發酵營養助劑、營養助劑在木聚糖酶制備中的應用及應用方法
技術領域：
本發明涉及發酵技術領域，尤其涉及ー種用于提高固態木聚糖酶發酵產量的發酵 營養助劑及發酵方法。
背景技術：
木聚糖是植物細胞壁中半纖維素的重要組分，占植物碳水化合物總量的三分之 一，是繼纖維素之后含量第二豐富的多糖，其主鏈是由多個3-D-吡喃木糖基以木糖苷鍵 相連而成。廣義的木聚糖酶是指可以降解半纖維素木聚糖的ー組酶的總稱。通常所說的木聚 糖酶指內切3 _1，4-D木聚糖酶，負責木聚糖骨架碳鏈的降解。木聚糖經木聚糖酶處理后， 部分降解可得到低聚木糖，完全降解則得到以木糖為主的五碳單糖。在植物性飼料中存在大量的半纖維素。非反芻動物由于缺少相應的消化酶類，幾 乎不能消化半纖維素。在動物腸道中存在的未消化的半纖維素會使食物的黏度增加，阻礙 脂肪和蛋白質等營養物質的消化吸收，降低了飼料的利用率。如果在飼料中加入木聚糖酶， 就可以通過降解飼料中的木聚糖，提高飼料的利用率，提高機體的免疫力，改善動物的生產 性能。傳統造紙漂白エ藝是采用氯及其衍生物等酸性漂白劑來去掉木質素，但是這會導 致所排放的造紙廢水中含有大量ニ惡英等強烈致畸致癌的有毒有機氯化物，造成嚴重的環 境污染。如果在化學漂白前，將紙漿用木聚糖酶進行預處理，則會加快紙漿中木質素的釋 放，促進氯氣等漂白劑更有效地作用，從而減少有害化學漂白劑的使用量，并縮短了紙漿處 理的時間。在釀酒原料的外層有纖維素及半纖維素層，這會影響原料內部淀粉的利用。通過 木聚糖酶對半纖維素層的作用，有利于淀粉酶對原料內部淀粉的降解，提高淀粉的利用率， 増加酒精的產率。此外，在釀造啤酒過程中，由于生產原料中的木聚糖和葡聚糖的影響，會 造成麥汁過濾困難，啤酒混濁，啤酒濾膜堵塞等問題。如果在制備麥芽汁的過程中加入木聚 糖酶，能使木聚糖降解而破壞植物細胞壁，從而有效釋放蛋白酶、淀粉酶等水解酶及細胞內 容物，使糖化時間縮短，同時使麥芽汁的黏度降低，提高麥汁的過濾速度及得率。綜上所述，木聚糖酶在飼料行業、制漿造紙、釀酒行業等都顯示出了巨大的應用潛 力。我國從上世紀80年代開始對木聚糖酶進行研究，但到目前為止，由于木聚糖酶的產量 較低，導致木聚糖酶的生產成本依然較高，經濟效益差，嚴重制約了其在以上エ業領域中的 應用。
發明內容
本發明所要解決的第一個技術問題是針對現有技術存在的不足，提供一種應用 于發酵中能顯著提高發酵效果的發酵營養助劑。
本發明所要解決的第二個技術問題是針對現有技術存在的不足，提供一種發酵 營養助劑在木聚糖酶制備中的應用。本發明所要解決的第三個技術問題是針對現有技術存在的不足，提供一種將發 酵營養助劑應用到木聚糖酶的發酵中，能顯著提高木聚糖酶產量的方法。為解決上述第一個技術問題，本發明的技術方案是—種發酵營養助劑，包含以下營養成分(g/L):甜菜堿80 120、維生素AO. 1 0. 4、維生素BiO. 1 0. 4、維生素B60. 05 0. 15、維生素B120. 05 0. 15、維生素D30. 1 0. 3、維生素E 0. 1 0. 6、維生素K30. 1 0. 3和煙酸0. 5 0. 8。作為一種優選，所述甜菜堿為無水甜菜堿、一水甜菜堿、鹽酸鹽甜菜堿、磺酸甜菜 堿、磷酸鹽甜菜堿中的一種或幾種的混合物。為解決上述第二個技術問題，本發明的技術方案是發酵營養助劑在木聚糖酶制備中的應用，將所述發酵營養助劑以300 500g/Kg 固體基質的添加量加入到發酵培養基中。為解決上述第三個技術問題，本發明的技術方案是一種發酵營養助劑在發酵制備木聚糖酶中的應用方法，包括以下步驟(1)種子培養將種子培養基在121°C滅菌20分鐘，降溫至28 32°C后接入黑曲 霉孢子懸浮液，在攪拌條件下培養2 3天。(2)配制發酵培養基按照干基為50 70wt%酒糟和30 50wt%麥麩的比例配 制固體基質，將生長限制因子用少量水溶解后添加到所述固體基質中，在121°C滅菌20分 鐘，再相對每lKg固體基質加入300 500g的發酵營養助劑,然后補充無菌水至發酵培養 基含水量為35 50wt%。(3)發酵培養將步驟⑴得到的種子液，按照100 200mL/Kg固體基質的接種 量接種入步驟(2)得到的發酵培養基中，在溫度為28 32°C開始發酵培養，發酵總時間 3. 5 4. 5 天。其中，所述發酵營養助劑包含以下營養成分(g/L):甜菜堿80 120、維生素A
0.1 0. 4、維生素&0. 1 0.4、維生素B60. 05 0. 15、維生素B120. 05 0. 15、維生素 D30. 1 0. 3、維生素E 0. 1 0. 6、維生素K30. 1 0. 3和煙酸0. 5 0. 8。優選的，所述甜菜堿為無水甜菜堿、一水甜菜堿、鹽酸鹽甜菜堿、磺酸甜菜堿、磷酸 鹽甜菜堿中的一種或幾種的混合物。優選的，所述種子培養基的配方為葡萄糖45 55g/L、蛋白胨8 12g/L、酵母膏 12 18g/L、KH2P041. 5 3g/L 和 MgS04 7H20 0. 5 2g/L。作為進一步的優選，所述種子培養基的配方為葡萄糖50g/L、蛋白胨10g/L、酵母 膏 15g/L、KH2P042g/L 和 MgS04 7H201g/L。優選的，在每lKg固體基質中加入包括玉米漿干粉25 40g、MgS04 7H200. 5
1.0g、CuS04 5H20 1. 0 2. 0g、MnS04 2H20 0. 5 1. 5g 和 FeS04 7H20 0. 05 1. 5g 的生
長限制因子。作為一種改進，所述發酵培養時，在發酵至36 48h,按照300 500g/Kg固體基 質的添加量再次加入發酵營養助劑，并扣散搖勻發酵培養基。由于采用了上述技術方案，本發明的有益效果是
I、本發明的發酵營養助劑中，含有甜菜堿以及多種維生素，甜菜堿作為ー種生物 堿，具有提供甲基，促進脂肪代謝和蛋白質合成的作用，另外，甜菜堿可以調節胞內滲透壓， 提高細胞的通透性，促進酶的外泌，而維生素是微生物正常機能與代謝活動不可或缺的因 素，作為輔助因子參與很多微生物代謝的調控，是微生物代謝調控中的ー個關鍵環節，本發 明通過采用合理的營養成分配方，通過添加不同水平的維生素改變特定酶活力的大小，從 而重新分配碳架物質在細胞內的流向，能有效促進酶尤其是木聚糖酶的合成。2、本發明在木聚糖酶的發酵培養時在發酵培養基中添加發酵營養助劑，可有效促 進黑曲霉孢子懸浮液菌體的生長及木聚糖酶的代謝，顯著提高了發酵效果和木聚糖酶的產 量，縮短了發酵時間，降低了生產成本。3、本發明在配制木聚糖酶的發酵培養基時以エ業廢料酒糟、麩皮為發酵培養基的 主要成分，降低了發酵的成本，同時減少了酒糟對環境的污染。4、本發明在發酵過程中適時補充營養助劑，可以適當的補充發酵前期損失的水分 及產酶所需的營養物質，為微生物產酶提供合適的環境和足夠的營養，進ー步保證了發酵 效果。
具體實施例方式下面結合具體的實施例，進ー步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發 明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術 人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限 定的范圍。實施例I將各營養成分用水充分溶解后，微濾除菌，制備成以下含量的發酵營養助劑無水 甜菜堿80g/L、維生素A 0. lg/L、維生素B1O. 4g/L、維生素B6O. 05g/L、維生素B12O. 15g/L、維 生素D3O. lg/L、維生素E0. 6g/L、維生素K3O. lg/L和煙酸0. 8g/L。實施例2將各營養成分用水充分溶解后，微濾除菌，制備成以下含量的發酵營養助劑一水 舌甘菜堿120g/L、維生素A 0. 4g/L、維生素B1O. lg/L、維生素B6O. 15g/L、維生素B12O. 05g/L、 維生素D3O. 3g/L、維生素E 0. lg/L、維生素K3O. 3g/L和煙酸0. 5g/L。實施例3將各營養成分用水充分溶解后，微濾除菌，制備成以下含量的發酵營養助劑鹽酸 鹽甜菜堿100g/L、維生素A 0. 2g/L、維生素B1O. 3g/L、維生素B6O. 10g/L、維生素B12O. IOg/ L、維生素D3O. 2g/L、維生素E 0. 4g/L、維生素K3O. 2g/L和煙酸0. 6g/L。實施例4將各營養成分用水充分溶解后，微濾除菌，制備成以下含量的發酵營養助劑磺酸 甜菜堿 100g/L、維生素 A 0. 3g/L、維生素 B1O. 25g/L、維生素 B6O. 09g/L、維生素 B12O. 09g/L、 維生素D3O. 25g/L、維生素E 0. 3g/L、維生素K3O. 25g/L和煙酸0. 7g/し實施例5將各營養成分用水充分溶解后，微濾除菌，制備成以下含量的發酵營養助劑鹽 酸鹽甜菜堿和磷酸鹽甜菜堿的混合物100g/L、維生素A 0. 25g/L、維生素B1O. 3g/L、維生素B60. 10g/L、維生素 B120. 10g/L、維生素 D30. 25g/L、維生素 E 0. 35g/L、維生素 K30. 25g/L 和煙 酸0. 65g/L。實施例6(1)配制種子培養基葡萄糖45g/L、蛋白胨12g/L、酵母膏12g/L、KH2P043g/L和 MgS04 *7H20 0. 5g/L。將種子培養基在121°C滅菌20分鐘，降溫至28°C，向黑曲霉孢子懸浮 液斜面菌種中加入5ml無菌水，用接種針輕輕刮動培養基表面，將制成的菌懸液移入液體 種子培養基中接入黑曲霉孢子懸浮液，在攪拌條件下培養3天。(2)配制發酵培養基按照干基為550g酒糟和450g麥麩的配比配制固體基質，將 包括玉米漿干粉 30g、MgS04 7H20 0. 8g、CuS04 5H20 1. 5g、MnS04 2H201. 5g 和 FeS04 7H20 1. 5g的生長限制因子用少量水溶解后添加到固體基質中，在121°C滅菌20分鐘，再加入實 施例1得到的發酵營養助劑400g，然后補充無菌水至發酵培養基含水量為45wt%。(3)發酵培養取步驟(1)得到的種子液150mL，接種入步驟(2)得到的發酵培養 基中，在溫度為28°C開始發酵培養，在發酵至36h，再次加入實施例1得到的發酵營養助劑 400g,并扣散搖勻發酵培養基，發酵總時間4. 5天。實施例7(1)配制種子培養基葡萄糖55g/L、蛋白胨8g/L、酵母膏18g/L、KH2P041. 5g/L和 MgS04 *7H20 2g/L。將種子培養基在121°C滅菌20分鐘，降溫至32°C，向黑曲霉孢子懸浮液 斜面菌種中加入10ml無菌水，用接種針輕輕刮動培養基表面，將制成的菌懸液移入液體種 子培養基中接入黑曲霉孢子懸浮液，在攪拌條件下培養2天。(2)配制發酵培養基按照干基為500g酒糟和500g麥麩的配比配制固體基質，將 包括玉米漿干粉 40g、MgS04 7H20 0. 7g、CuS04 5H20 1. 8g、MnS04 2H201. 3g 和 FeS04 7H20 1.0g的生長限制因子用少量水溶解后添加到固體基質中，在121°C滅菌20分鐘，再加入實 施例2得到的發酵營養助劑450g，然后補充無菌水至發酵培養基含水量為50wt%。(3)發酵培養取步驟(1)得到的種子液180mL接種入步驟(2)得到的發酵培養 基中，在溫度為32°C開始發酵培養，在發酵至48h，再次加入實施例2得到的發酵營養助劑 450g，并扣散搖勻發酵培養基，發酵總時間4天。實施例8(1)配制種子培養基葡萄糖50g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏15g/L、KH2P042g/L和 MgS04 *7H20 lg/L。將種子培養基在121°C滅菌20分鐘，降溫至30°C，向黑曲霉孢子懸浮液 斜面菌種中加入8ml無菌水，用接種針輕輕刮動培養基表面，將制成的菌懸液移入液體種 子培養基中接入黑曲霉孢子懸浮液，在攪拌條件下培養2. 5天。(2)配制發酵培養基按照干基為600g酒糟和400g麥麩的配比配制固體基質，將 包括玉米漿干粉 25g、MgS04 7H20 0. 5g、CuS04 5H20 1. 3g、MnS04 2H200. 5g 和 FeS04 7H20 0. 7g的生長限制因子用少量水溶解后添加到固體基質中，在121°C滅菌20分鐘，再加入實 施例3得到的發酵營養助劑300g，然后補充無菌水至發酵培養基含水量為48wt%。(3)發酵培養取步驟(1)得到的種子液100mL，接種入步驟(2)得到的發酵培養 基中，在溫度為30°C開始發酵培養，在發酵至40h，再次加入實施例3得到的發酵營養助劑 300g,并扣散搖勻發酵培養基，發酵總時間4天。實施例9
(1)將種子培養基在121°C滅菌20分鐘，降溫至30°C，向黑曲霉孢子懸浮液斜面菌 種中加入5ml無菌水，用接種針輕輕刮動培養基表面，將制成的菌懸液移入液體種子培養 基中接入黑曲霉孢子懸浮液，在攪拌條件下培養3天。(2)配制發酵培養基按照干基為700g酒糟和300g麥麩的配比配制固體基質，將 包括玉米漿干粉 28g、MgS04 7H20 0. 9g、CuS04 5H20 1. 2g、MnS04 2H200. 9g 和 FeS04 7H20 0. 9g的生長限制因子用少量水溶解后添加到固體基質中，在121°C滅菌20分鐘，再加入實 施例4得到的發酵營養助劑480g，然后補充無菌水至發酵培養基含水量為44wt%。(3)發酵培養取步驟(1)得到的種子液140mL，接種入步驟(2)得到的發酵培養 基中，在溫度為30°C開始發酵培養，在發酵至42h，再次加入實施例4得到的發酵營養助劑 480g,并扣散搖勻發酵培養基，發酵總時間4天。對比例1(1)配制種子培養基葡萄糖50g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏15g/L、KH2P042g/L和 MgS04 *7H20 lg/L。將種子培養基在121°C滅菌20分鐘，降溫至30°C，向黑曲霉孢子懸浮液 斜面菌種中加入8ml無菌水，用接種針輕輕刮動培養基表面，將制成的菌懸液移入液體種 子培養基中接入黑曲霉孢子懸浮液，在攪拌條件下培養2. 5天。(2)配制發酵培養基酒糟(以干基計)650g、麥麩350g。玉米漿干粉30g、 MgS04 7H20 0. 9g、CuS04 5H201. 2g、MnS04 2H20 0. 9g、FeS04 7H20 0. 9g,以上生長限制因 子用少量水溶解后添加到固體基質中。補充水至培養基終含水量為45wt%。于121°C滅菌 20mino(3)發酵培養取步驟(1)得到的種子液170mL，接種入步驟(2)得到的發酵培養 基中，在溫度為30°C開始發酵培養，發酵總時間5天。對比例2(1)配制種子培養基葡萄糖45g/L、蛋白胨12g/L、酵母膏12g/L、KH2P043g/L和 MgS04 *7H20 0. 5g/L。將種子培養基在121°C滅菌20分鐘，降溫至28°C，向黑曲霉孢子懸浮 液斜面菌種中加入5ml無菌水，用接種針輕輕刮動培養基表面，將制成的菌懸液移入液體 種子培養基中接入黑曲霉孢子懸浮液，在攪拌條件下培養3天。(2)配制發酵培養基酒糟(以干基計)600g、麥麩400g。玉米漿干粉35g、 MgS04 7H20 1. 0g、CuS04 5H202. 0g、MnS04 2H20 1. 5g、FeS04 7H200. 9g,以上生長限制因 子用少量水溶解后添加到固體基質中。補充無菌水至培養基終含水量為50wt%。于121°C 滅菌20min。(3)發酵培養取步驟(1)得到的種子液180mL，接種入步驟(2)得到的發酵培養 基中，在溫度為28°C開始發酵培養，發酵總時間5. 5天。對比例3(1)配制種子培養基葡萄糖50g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏15g/L、KH2P042g/L和 MgS04 *7H20 lg/L。將種子培養基在121°C滅菌20分鐘，降溫至30°C，向黑曲霉孢子懸浮液 斜面菌種中加入8ml無菌水，用接種針輕輕刮動培養基表面，將制成的菌懸液移入液體種 子培養基中接入黑曲霉孢子懸浮液，在攪拌條件下培養2. 5天。(2)配制發酵培養基酒糟(以干基計)650g、麥麩350g。玉米漿干粉30g、 MgS04 7H20 0. 9g、CuS04 5H201. 2g、MnS04 2H200. 9g、FeS04 7H20 0. 9g,以上生長限制因子用少量水溶解后添加到固體基質中。培養基于121°C滅菌20min。加入實施例3得到的 發酵營養助劑480g。補充無菌水至培養基終含水量為50wt%。(3)發酵培養取步驟(1)得到的種子液170mL，接種入步驟(2)得到的發酵培養 基中，在溫度為30°C開始發酵培養，發酵總時間4. 8天。對比例4(1)配制種子培養基葡萄糖45g/L、蛋白胨12g/L、酵母膏12g/L、KH2P043g/L和 MgS04 *7H20 0. 5g/L。將種子培養基在121°C滅菌15分鐘，降溫至28°C，向黑曲霉孢子懸浮 液斜面菌種中加入5ml無菌水，用接種針輕輕刮動培養基表面，將制成的菌懸液移入液體 種子培養基中接入黑曲霉孢子懸浮液，在攪拌條件下培養3天。(2)配制發酵培養基酒糟(以干基計)600g、麥麩400g。玉米漿干粉35g、 MgS04 7H20 1. 0g、CuS04 5H202. 0g、MnS04 2H20 1. 5g、FeS04 7H20 0. 9g,以上生長限制 因子用少量水溶解后添加到固體基質中。補充水至培養基終含水量為50wt%。培養基于 121°C 滅菌 20min。(3)發酵培養取步驟(1)得到的種子液150mL，接種入步驟(2)得到的發酵培養 基中，在溫度為28°C開始發酵培養，在發酵至40h，加入實施例3得到的發酵營養助劑500g， 并扣散搖勻發酵培養基，發酵總時間5. 2天。實施例6至實施例9、對比例1至對比例4中的發酵時間、制備的木聚糖酶的酶活 情況見表1。表權利要求
1.特征在于包含以下營養成分甜菜堿80 120g/L、維生素A 0. 1 0. 4g/L、維生素 &0. 1 0. 4g/L、維生素 B60. 05 0. 15g/L、維生素 B120. 05 0. 15g/ L、維生素D30. 1 0. 3g/L、維生素E 0. 1 0. 6g/L、維生素K30. 1 0. 3g/L和煙酸0. 5 0.8g/L。
2.如權利要求1所述的發酵營養助劑，其特征在于所述甜菜堿為無水甜菜堿、一水甜 菜堿、鹽酸鹽甜菜堿、磺酸甜菜堿、磷酸鹽甜菜堿中的一種或幾種的混合物。
3.如權利要求1所述的發酵營養助劑在木聚糖酶制備中的應用，其特征在于將所述 發酵營養助劑以300 500g/Kg固體基質的添加量加入到發酵培養基中。
4.一種發酵營養助劑在發酵制備木聚糖酶中的應用方法，其特征在于包括以下步驟(1)種子培養將種子培養基在121°C滅菌20分鐘，降溫至28 32°C后接入黑曲霉孢 子懸浮液，在攪拌條件下培養2 3天；(2)配制發酵培養基按照干基為50 70wt%酒糟和30 50wt%麥麩的比例配制固 體基質，將生長限制因子用少量水溶解后添加到所述固體基質中，在121°C滅菌20分鐘，再 相對每lKg固體基質加入300 500g的發酵營養助劑,然后補充無菌水至發酵培養基含水 量為35 50wt% ；(3)發酵培養將步驟⑴得到的種子液，按照100 200mL/Kg固體基質的接種量接 種入步驟(2)得到的發酵培養基中，在溫度為28 32°C開始發酵培養，發酵總時間3. 5 4. 5 天。
5.如權利要求4所述的發酵營養助劑在發酵制備木聚糖酶中的應用方法，其特征在 于所述發酵營養助劑包含以下營養成分(g/L):甜菜堿80 120、維生素A 0. 1 0. 4、維 生素BA 1 0. 4、維生素B60. 05 0. 15、維生素B120. 05 0. 15、維生素D30. 1 0. 3、維 生素E 0. 1 0. 6、維生素K30. 1 0. 3和煙酸0. 5 0. 8。
6.如權利要求5所述的發酵營養助劑在發酵制備木聚糖酶中的應用方法，其特征在 于所述甜菜堿為無水甜菜堿、一水甜菜堿、鹽酸鹽甜菜堿、磺酸甜菜堿、磷酸鹽甜菜堿中的 一種或幾種的混合物。
7.如權利要求4所述的發酵營養助劑在發酵制備木聚糖酶中的應用方法，其特征在 于所述種子培養基的配方為葡萄糖45 55g/L、蛋白胨8 12g/L、酵母膏12 18g/L、 KH2P041. 5 3g/L 和 MgS04 7H20 0. 5 2g/L。
8.如權利要求7所述的發酵營養助劑在發酵制備木聚糖酶中的應用方法，其特征在 于所述種子培養基的配方為葡萄糖50g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏15g/L、KH2P042g/L和 MgS04 7H201g/L。
9.如權利要求4至8所述的任一種發酵營養助劑在發酵制備木聚糖酶中的應用方法， 其特征在于在每lKg固體基質中加入包括玉米漿干粉25 40g、MgS04 *7H20 0. 5 1. 0g、 CuS04 5H20 1. 0 2. 0g、MnS04 2H20 0. 5 1. 5g 和 FeS04 7H20 0. 05 1. 5g 的生長限 制因子。
10.如權利要求9所述的發酵營養助劑在發酵制備木聚糖酶中的應用方法，其特征在 于所述發酵培養時，在發酵至36 48h，按照300 500g/Kg固體基質的添加量再次加入 發酵營養助劑，并扣散搖勻發酵培養基。
全文摘要
本發明公開了一種發酵營養助劑、營養助劑在木聚糖酶制備中的應用及應用方法，發酵營養助劑包含以下營養成分(g/L)甜菜堿80～120、維生素A0.1～0.4、維生素B10.1～0.4、維生素B60.05～0.15、維生素B120.05～0.15、維生素D30.1～0.3、維生素E 0.1～0.6、維生素K30.1～0.3和煙酸0.5～0.8。將所述發酵營養助劑按300～500g/Kg固體基質的添加量加入發酵培養基中，發酵培養4～5天制備木聚糖酶。本發明用于木聚糖酶的發酵培養，可有效促進黑曲霉孢子懸浮液菌體的生長及木聚糖酶的代謝，顯著提高了發酵效果和木聚糖酶的產量，縮短了發酵時間。
文檔編號C12R1/685GK102660520SQ201210134429
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月2日 優先權日2012年5月2日
發明者呂麗娟, 吳寶強, 宋琦, 馬興群 申請人:濰坊祥維斯化學品有限公司