專利名稱：一種適用于全基因組測序的產糖被細菌基因組dna的提取方法
技術領域：
本發明涉及DNA提取方法。具體涉及一種適用于全基因組測序的產糖被細菌基因組DNA的提取方法。
背景技術：
在分子生物學技術的研究中，關鍵在于DNA的提取。常規的分子生物學操作如PCR、酶切、雜交對DNA的質量要求不高，一般分子生物學實驗指導書上的常規方法如濃鹽法、酚氯仿抽提法等即可滿足其要求。隨著全基因組隨機測序方法一霹彈法(shotgun)的成熟，計算機拼裝算法的發展，近年來細菌基因組測序以每年50%的速度增長。新一代高通量基因組測序儀的迅速發展(Solexa,454GS-FLX, SOLID, tSMS)給基因組領域帶來革命性的突破。目前，細菌基因組研究進展迅猛，已有684個真細菌基因組和51個古細菌基因組序列發布。而且，對于細菌全基因序列的測定是分析細菌生物合成過程、基因調控、蛋白表達等之前非常必要的工作。通過全基因組測序，可以預測所含有的編碼序列、可能表達的蛋白、與各種細胞功能相關的基因，還可以預測未知功能的基因等，從而可開創性的研究預測一些可能的方向，使得生物學實驗具有可驗證性和可循證性。但全基因組測序對DNA的樣品具有高純度、大片段的要求，不同于一般PCR樣品的要求。對于全基因組測序的基因組文庫構建，DNA的需求量較大，長度至少大于23kb，而且質量要求較高，應盡量避免多糖、蛋白質的殘留，否則影響庫的構建及后續測序工作。因此，一次性獲取高質高量的DNA就相當必要。某些細菌在細胞壁外被一層厚度不定的透明膠狀物質所包被，這層物質統稱為糖被。它通常由多糖類、多肽類或多糖與多糖蛋白復合體組成。糖被具粘稠的特性，在進行DNA提取時，會與DNA結合形成共沉淀，獲得的DNA溶液常常黏度大乃至呈膠狀，在很大程度上影響基因組DNA提取的質量和數量。所以，如何高效簡便地去除細菌的多糖類物質，對提取純化細菌基因組DNA來說至關重要。本實驗室于2010年6月在華大基因科技股份有限公司啟動了一株產多糖細菌的全基因組測序項目，但在提取該菌株全基因組DAN樣品時發現，常規提取方法無法達到完全去除多糖類物質的目的，不能滿足測序建庫要求。而且多糖類物質對核酸限制性內切酶和PCR都有抑制作用。因此，本發明提供了一種適合于產糖被細菌的DNA提取體系，可獲得高純度基因組DNA，而且DNA含量高，片段在23kb以上，完全滿足全基因組測序文庫構建及一般分子生物學實驗操作的要求。采用該方法提取的細菌DNA經華大基因科技股份有限公司檢測，檢測結論為合格，達到I類樣品標準，可以用于全基因組測序文庫構建。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種操作安全、簡便、高通量、成本低的一種適用于全基因組測序的產糖被細菌基因組DNA的提取方法。為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下一種適用于全基因組測序的產糖被細菌基因組DNA的提取方法，該方法包括以下步驟(I)向3飛mL產糖被細菌的培養物中加入400 i! L DNA提取緩沖液和IOy L溶菌酶的水溶液，37°C下靜置lOmin，再加入10 y L蛋白酶K的水溶液，65°C下靜置Ih ； (2)向步驟(I)得到的混合溶液中加入等體積的苯酚-氯仿-異戊醇的混合溶液，抽提，離心，取上清；(3)向步驟(2)得到的上清中，加入等體積的氯仿-異戊醇混合溶液，抽提，離心，取上清；(4)向步驟(3)得到的上清液中，加入2倍體積的冷乙醇和0. I倍體積的醋酸鈉的水溶液，離心，沉淀經體積百分濃度為70%的乙醇洗滌后室溫干燥，加DNA提取緩沖液溶解；(5)向步驟(4)得到的體系中加入RNA酶的水溶液10 y L，37°C下靜置IOmin ；(6)向步驟(5)得到的體系中加入PEG6000，混勻，50°C下靜置IOmin ；(7)向步驟(6)得到的體系中加入等體積的苯酚-氯仿-異戊醇的混合溶液，抽提，離心，取上清；(8)向步驟(7)得到的上清中，加入等體積的氯仿-異戊醇混合溶液，抽提，離心，取上清；(9)向步驟(8)得到的上清中，加入2倍體積的冷乙醇和0. I倍體積的醋酸鈉的水溶液，離心，沉淀經體積百分濃度為70%的乙醇洗滌后室溫干燥，加200 u I ddH20或者TE緩沖液溶解，即為提取到的DNA溶液，_20°C保存備用。其中，所述的產糖被細菌為卩比咯伯克霍爾德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、越南伯克霍爾德氏菌(Burkholderiavietnamiensis)、洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderia cepacia)、草木樨中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)。步驟(I)和(4)中，所述的DNA提取緩沖液按如下方法配制得到將lmol/L pH8. 0的 Tris-HCl 緩沖液 IOmL,0. 5mol/L pH8. 0 的 EDTA 4mL、5mol/L 的 NaCl 28mL、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB) 2g和聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 2g溶于去離子水，定容到IOOmL ;使用時加A 2mL的2-巰基乙醇。步驟(I)中，所述的溶菌酶的水溶液的濃度為50mg/mL。步驟(I)中，所述的蛋白酶K的水溶液的濃度為20mg/mL。步驟(2)和(7)中，所述的苯酚-氯仿-異戊醇的混合溶液，苯酚、氯仿和異戊醇的體積比為25:24:1。步驟(3)和(8)中，所述的氯仿-異戊醇混合溶液，氯仿和異戊醇的體積比為24: I。步驟(4)和(9)中，所述的醋酸鈉的水溶液濃度為3mol/L。步驟(4)和(9)中，所述的冷乙醇溫度為_20°C。步驟(5)中，所述的RNA酶的水溶液的濃度為10mg/mL。步驟(6)中，PEG6OOO加入量為 10 20g/L。
步驟(9)中，所述的TE緩沖液由IOmM Tris-HCl和ImM EDTA組成，pH8. O。本發明的保護范圍不局限于上述物料的具體加入量，物料的加入量可根據提取樣品量的增大進行相應的增加。有益效果本發明方法與現有的常規CTAB方法相比具有如下優點(I)本發明方法操作安全、簡便、高通量、成本低。(2)本發明方法所述的DNA提取方法適用范圍較廣，提取產糖被細菌的基因組DNA質量較好，可以滿足一般分子生物學操作及全基因組測序文庫構建。
圖I為5種細菌改進方法獲得的細菌全基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳示意圖(其電泳圖為1%瓊脂糖凝膠，從左到右依次為=DNAmarker ;泳道2-6 B1 (吡咯伯克霍爾德氏菌)，B2 (巨大芽孢桿菌)，B3 (越南伯克霍爾德氏菌)，B4 (洋蔥伯克霍爾德氏菌)，B5 (草木樨中華根瘤菌)的 DNA 產物)。其中，M,入-Hind IHdigest (Takara)0圖2為通過常規DNA提取方法獲得的細菌全基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳示意圖(其電泳圖為0. 8%瓊脂糖凝膠，從左到右依次為DNAmarker ;泳道2_6 :B1(吡咯伯克霍爾德氏菌)，B2 (巨大芽孢桿菌)，B3 (越南伯克霍爾德氏菌)，B4 (洋蔥伯克霍爾德氏菌)，B5 (草木禪中華根瘤菌)的DNA產物)。其中，M,入-Hind IHdigest (Takara)0圖3為通過5種細菌改進方法獲得的細菌全基因組DNA經PCR擴增后得到的16SrDNA產物瓊脂糖凝膠電泳示意圖(其電泳圖為2%瓊脂糖凝膠，從左到右依次為DNAmarker ;泳道2-6 B1 (吡咯伯克霍爾德氏菌)，B2 (巨大芽孢桿菌)，B3 (越南伯克霍爾德氏菌)，B4 (洋蔥伯克霍爾德氏菌)，B5 (草木樨中華根瘤菌)的DNA產物)。其中，M，DL2000(Takara)0
具體實施例方式根據下述實施例，可以使本領域的技術人員更好地理解本發明。實施例所描述的僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。實施例I :選擇5種實驗室保存的具糖被的細菌菌株(BI :吡咯伯克霍爾德氏菌(Burkholderia pyrrocinia) ；B2 :巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium) ；B3 :越南伯克霍爾德氏菌(Burkholderia vietnamiensis) ；B4 :洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderiacepacia) ；B5 :草木禪中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti))按如下方法進行基因組DNA的提取。(I)向3 6mL產糖被細菌的培養物中加入400 u L DNA提取緩沖液和10 u L50mg/mL溶菌酶的水溶液，37°C下靜置lOmin，再加入IOyL 20mg/mL蛋白酶K的水溶液，65°C下靜置Ih ;所述的DNA提取緩沖液按如下方法配制得到將lmol/L pH 8. 0的Tris-HCl緩沖液 10mL、0. 5mol/L pH8. (^AEDTA 4mL、5mol/L 的NaCl 28mL、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)2g和聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 2g溶于去離子水，定容到IOOmL ;使用時加入2mL的2-巰基乙醇；
(2)向步驟(I)得到的混合溶液中加入等體積的苯酚-氯仿-異戊醇(體積比25:24:1)的混合溶液，抽提，離心，取上清；(3 )向步驟(2 )得到的上清中，加入等體積的氯仿-異戊醇(體積比24:1)混合溶液，抽提，離心，取上清；(4)向步驟(3)得到的上清液中，加入2倍體積的冷乙醇和0. I倍體積3mol/L的醋酸鈉的水溶液，離心，沉淀經體積百分濃度為70%的乙醇洗滌后室溫干燥，加DNA提取緩沖液溶解；(5)向步驟(4)得到的體系中加入10mg/mL RNA酶溶液10 y L，37°C下靜置IOmin ；
(6)向步驟(5)得到的體系中加入PEG6000，PEG6000加入量為l(T20g/L，混勻，50°C下靜置 IOmin ；(7)向步驟(6)得到的體系中加入等體積的苯酚-氯仿-異戊醇(體積比25:24:1)的混合溶液，抽提，離心，取上清；(8 )向步驟(7 )得到的上清中，加入等體積的氯仿-異戊醇(體積比24:1)混合溶液，抽提，離心，取上清；(9)向步驟(8)得到的上清中，加入2倍體積的冷乙醇和0. I倍體積3mol/L的醋酸鈉的水溶液，離心，沉淀經體積百分濃度為70%的乙醇洗滌后室溫干燥，加200iaddH20或者TE緩沖液(TE緩沖液由IOmM Tris-HCl和ImM EDTA組成，pH8. 0)溶解，即為提取到的DNA溶液，_20°C保存備用。實施例2 對實施例I中提取的DNA及常規CTAB方法Clank MS. Plant molecularbiology-Alaboratory manual (植物分子生物學-實驗手冊)[M].北京高等教育出版VS施普林格出版社，1998，4 7提取的DNA采用NanoDrop 1000進行濃度檢測。檢測結果如表I所示。由表I可以看出，實施例I中提取的DNA滿足I. 8彡A260/A280 ( 2. 0，A260/A230 ^ 2. 0，優于常規提取方法。說明所提取的DNA較純，DNA中蛋白質、酶類及色素、RNA等雜質含量合乎要求。而且DNA濃度均在707. 18ng/ y L以上。實施例3 對實施例I中提取的DNA及常規方法提取的DNA片段大小的瓊脂糖電泳檢測，marker選用X -Hind III digest,膠濃度為1% ;電壓為150V ;電泳時間為40min。實施例I中提取的細菌基因組DNA結果如圖I所示，5種菌基因組DNA主帶在入-Hind III digest最大條帶23kb以上。泳道2飛的DNA圖譜清晰、無拖尾。常規CTAB方法提取的DNA細菌基因組DNA結果如圖2所示，5種菌基因組DNA主帶在入-Hind III digest最大條帶23kb以上，但泳道2飛的DNA電泳譜有拖尾現象，且點樣槽中有物質殘留。以上說明傳統方法不能有效去除DNA粗提液中的多糖類物質，與DNA形成共沉淀，而改進的DNA提取方法則能彌補這一不足。實施例4 對實施例I中提取的DNA進行16S rDNA的PCR擴增及產物檢測，選擇擴增細菌16S rDNA的通用引物(正向引物27F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG ;反向引物1512R ACGGCTACCTTGTTACGACT)對5種細菌基因組DNA進行擴增。擴增體系為20 y L體系IOXBuffer (含 Mg2+L 5mmol/L) 2 y L、2. 5mmol dNTP I. 5 y L、10 y mol 引物各 I y L、Taq 酶0.15i! L、模板I u UddH2O補足20 u Lo PCR反應條件94°C變性2min ;再以94°C變性30s，52°C退火30s，72。。延伸I. 5min,30次循環；72°C延伸7min。PCR產物于2%瓊脂糖凝膠中電泳，溴化乙錠染色，紫外燈下拍照。電泳結果如圖3所示，已經成功擴增出5種細菌的16SrDNA的目的條帶(1500bp )。說明采用實施例I中提取的DNA可以滿足PCR樣品要求。表I 5種具糖被菌兩種提取方法提取DNA的純度、濃度
權利要求
1.一種適用于全基因組測序的產糖被細菌基因組DNA的提取方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 (1)向3飛mL產糖被細菌的培養物中加入400ii L DNA提取緩沖液和IOy L溶菌酶的水溶液，37°C下靜置lOmin，再加入10 y L蛋白酶K的水溶液，65°C下靜置Ih ； (2)向步驟(I)得到的混合溶液中加入等體積的苯酚-氯仿-異戊醇的混合溶液，抽提，離心，取上清； (3)向步驟(2)得到的上清中，加入等體積的氯仿-異戊醇混合溶液，抽提，離心，取上清； (4)向步驟(3)得到的上清液中，加入2倍體積的冷乙醇和0.I倍體積的醋酸鈉的水溶液，離心，沉淀經體積百分濃度為70%的乙醇洗滌后室溫干燥，加DNA提取緩沖液溶解； (5)向步驟(4)得到的體系中加入RNA酶的水溶液IOiiL，37°C下靜置IOmin; (6)向步驟(5)得到的體系中加入PEG6000，混勻，50°C下靜置IOmin； (7)向步驟(6)得到的體系中加入等體積的苯酚-氯仿-異戊醇的混合溶液，抽提，離心，取上清； (8)向步驟(7)得到的上清中，加入等體積的氯仿-異戊醇混合溶液，抽提，離心，取上清； (9)向步驟(8)得到的上清中，加入2倍體積的冷乙醇和0.I倍體積的醋酸鈉溶液，離心，沉淀經體積百分濃度為70%的乙醇洗滌后室溫干燥，加200 u I ddH20或者TE緩沖液溶解，即為提取到的DNA溶液，_20°C保存備用。
2.根據權利要求I所述的適用于全基因組測序的產糖被細菌基因組DNA的提取方法，其特征在于，所述的產糖被細菌為卩比咯伯克霍爾德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)、巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium)、越南伯克霍爾德氏菌(Burkholderia vietnamiensis)、洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderia cepacia)和草木樨中華根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)。
3.根據權利要求I所述的適用于全基因組測序的產糖被細菌基因組DNA的提取方法，其特征在于，步驟(I)和(4)中，所述的DNA提取緩沖液按如下方法配制得到將lmol/L pH8.0 的 Tris-HCl 緩沖液 IOmL,0. 5mol/L pH8. 0 的 EDTA 4mL、5mol/L 的 NaCl 28mL、十六烷基三甲基溴化銨2g和聚乙烯吡咯烷酮2g溶于去離子水，定容到IOOmL ;使用時加入2mL的2-巰基乙醇。
4.根據權利要求I所述的適用于全基因組測序的產糖被細菌基因組DNA的提取方法，其特征在于，步驟(I)中，所述的溶菌酶的水溶液中，溶菌酶的濃度為50mg/mL。
5.根據權利要求I所述的適用于全基因組測序的產糖被細菌基因組DNA的提取方法，其特征在于，步驟(I)中，所述的蛋白酶K的水溶液中，蛋白酶K的濃度為20mg/mL。
6.根據權利要求I所述的適用于全基因組測序的產糖被細菌基因組DNA的提取方法，其特征在于，步驟(2)和(7)中，所述的苯酚-氯仿-異戊醇的混合溶液，苯酚、氯仿和異戊醇的體積比為25:24:1。
7.根據權利要求I所述的適用于全基因組測序的產糖被細菌基因組DNA的提取方法，其特征在于，步驟(3)和(8)中，所述的氯仿-異戊醇混合溶液，氯仿和異戊醇的體積比為24:1。
8.根據權利要求I所述的適用于全基因組測序的產糖被細菌基因組DNA的提取方法，其特征在于，步驟(4)和(9)中，所述的醋酸鈉的水溶液中，醋酸鈉的濃度為3mol/L。
9.根據權利要求I所述的適用于全基因組測序的產糖被細菌基因組DNA的提取方法，其特征在于，步驟(5)中，所述的RNA酶水溶液中，RNA酶的濃度為10mg/mL。
10.根據權利要求I所述的適用于全基因組測序的產糖被細菌基因組DNA的提取方法， 其特征在于，步驟(6)中，PEG6000加入量為l(T20g/L。
全文摘要
本發明公開了一種適用于全基因組測序的產糖被細菌基因組DNA的提取方法，向產糖被細菌的培養物中加入提取緩沖液和溶菌酶，37℃下靜置10min，再加入蛋白酶K，65℃下靜置1h；加入苯酚-氯仿-異戊醇的混合溶液，抽提；加入氯仿-異戊醇混合溶液，抽提；加入冷乙醇和醋酸鈉，離心，沉淀經乙醇洗滌后室溫干燥，加DNA提取緩沖液溶解；加入RNA酶，37℃下靜置10min；加入PEG6000，混勻，50℃下靜置10min；加入苯酚-氯仿-異戊醇的混合溶液，抽提；加入氯仿-異戊醇混合溶液，抽提；加入冷乙醇和醋酸鈉溶液，離心，沉淀經乙醇洗滌后室溫干燥，加ddH2O或者TE緩沖液溶解，即為提取到的DNA溶液。
文檔編號C12N15/10GK102643801SQ20121014553
公開日2012年8月22日 申請日期2012年5月10日 優先權日2012年5月10日
發明者付涵予, 任嘉紅, 葉建仁, 吳小芹, 李 浩 申請人:南京林業大學