專利名稱：流感嗜血桿菌多重降落pcr檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及流感嗜血桿菌感染的分子診斷技術領域，具體涉及多重降落PCR檢測方法在下呼吸道標本中流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)檢測中的應用。
背景技術：
流感嗜血桿菌是引起社區獲得性肺炎的主要病原菌，為苛養菌，其培養需V因子與X因子。主要引起肺炎與腦膜炎，每年造成約300萬人嚴重患病并造成約38. 6萬人死亡。多數患者為5歲以下兒童。多數流感嗜血桿菌引起的死亡病例發生于發展中國家，這些國家尚未將流感嗜血桿菌疫苗納入常規計劃內免疫中(中國目前亦為計劃外)。成人發生侵襲性流感嗜血桿菌肺炎的危險因素有免疫受損者、C0PD、糖尿病、癌癥、脾切除與慢性酒精中毒、金黃色葡萄球菌或甲型流感病毒引起的重癥肺炎。疫苗接種可預防由b型流感嗜血桿菌引起的侵襲性疾病的發生。發達國家由于疫苗的廣泛接種，兒童流感嗜血桿菌肺炎已被消滅。但在未推廣疫苗接種的國家，第年仍可造成數十萬兒童死于流感嗜血桿菌感染引起的疾病。Guma M. K. Abdeldaim 等(Guma M. K. Abdeldaim, et al. , Detection ofHaemophilus influenzae in respiratory secretions from pneumonia patientsby quantitative real-time polymerase chain reaction. Diagn Microbiol InfectDisj 2009，64 (4) :366-373.)建立了以omp P6基因為靶標檢測流感嗜血桿菌的實時定量PCR，然而他們發現該方法可將部分嗜血桿菌的其它菌種誤鑒定為流感嗜血桿菌。同時針對流感嗜血桿菌的多個基因進行檢測可提高檢測方法的特異性。Korbie，D. J.等(Korbie，D.J. and J. S. Mattick,Touchdown PCR for increased specificity and sensitivity inPCR amplification. Nat. Protocols, 2008. 3 (9) :p. 1452-1456.)發現降落 PCR 可提高 PCR的特異性與靈敏度。當前尚無同時針對流感嗜血桿菌omp P6、frdB、16S rRNA基因以檢測流感嗜血桿菌的多重PCR報道。本發明建立的多重降落PCR可直接檢測下呼吸道標本中的流感嗜血桿菌，費時少，具高度特異性與靈敏性，有利于流感嗜血桿菌感染的快速診斷與流行病學調查。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種可快速特異檢測下呼吸道標本中流感嗜血桿菌的多重PCR檢測試劑盒及檢測方法。為了解決上述技術問題，本發明是通過以下技術發案實現的一種流感嗜血桿菌多重降落PCR檢測試劑盒，包括10 X PCR緩沖液，MgC12，dNTP,TaqDNA聚合酶，BSA,流感嗜血桿菌陽性對照DNA，3對流感嗜血桿菌引物；
第I 對5，-GAAATGGTGCTGCTCAAACTTT-3，( SEQ ID NO. I )與5’ -TGCGATGTTGTATTCTGGTGTA-3’ (SEQ ID NO. 2)；第2 對5，-CGATCAAGAGCCACATTTAAGC-3，( SEQ ID NO. 3)與5’ -CTTCTGAGCAATAGCCAACGA-3’ (SEQ ID NO. 4)；第3 對5，-CGTATTATCGGAAGATGAAAGTGC-3，(SEQ ID NO. 5) (Hendolin
PH, et al. Use of multiplex PCR for simultaneous detection of four bacterial
species in middle ear effusions. J Clin Microbiol, 1997, 35(11):2854-2858.)與
5’ -AGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGTT-3’ (SEQ IDNO. 6)；本發明還公開了應用上述試劑盒的檢測方法
(一)提取待檢樣本DNA(二)多重降落PCR法擴增檢測待檢樣本DNA中的omp P6、frdB、16S rRNA基因，具
體步驟如下
反應體系25
H2O12.55 nl
緩沖液(10XPCR)2.5 Jil
BSA (10 mg/ml)0.25 (il
Hi—omp P6-F (10 MinoI/L)0. 5 \il
Hi—omp P6-R (10 WiioI/L)0.5(11
Hi—frdB-F (10 ttnol/L)ItU
Hi—frdB-R (10 Wnol/L)I
Hi—16S rRNA-F (10 mol/L)Ipi
Hi—16S rRNA-R (10 Wnol/L)I
MgCl2 (25 mM)2 jil
ANTP (10 mM)0.5 fil
Taq DNA 聚合酶(.5 U/Ml )0.2 ^il
DNA 模板2 jil3對流感嗜血桿菌引物為Hi_omp P6-F:5’ -GAAATGGTGCTGCTCAAACTTT-3’ (SEQ ID NO. I)Hi_omp P6-R:5’ -TGCGATGTTGTATTCTGGTGTA-3J (SEQ ID NO. 2)Hi_frdB-F :5’ -CGATCAAGAGCCACATTTAAGC-3’ (SEQ ID NO. 3)Hi_frdB-R :5’ -CTTCTGAGCAATAGCCAACGA-3’ (SEQ ID NO. 4)Hi_16S rRNA-F :5’ -CGTATTATCGGAAGATGAAAGTGC-3J (SEQ ID NO. 5)Hi_16S rRNA-R:5’ -AGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGTT-3J (SEQ ID NO. 6)(三)PCR反應循環參數如下94°C 5min ；94°C 30s, 65°C (每循環降低 0. 5°C ) 30s, 72°C lmin,20 個循環；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin, 20 個循環；72°C 7min。(四)電泳檢測鑒定對多重降落PCR反應產物進行瓊脂糖電泳檢測，如電泳圖中含有215bp、620bp、
821bp條帶中的任意2條或3條則代表檢出流感嗜血桿菌。有益效果本發明所建立的多重降落PCR可克服常規培養的耗時長、靈敏度低等
問題，具有快速、簡便、特異、靈敏度高等特征。可于當天出檢測結果報告，可同時檢測流感嗜血桿菌的3個基因，對流感嗜血桿菌DNA的檢測下限達0. 2pg。該多重降落PCR可用于流感嗜血桿菌感染的快速診斷與流行病學調查。
圖I為建立的多重降落PCR的特異性檢測結果；泳道I 一 12模板依次對應為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii)、卡它莫拉菌(Moraxella (Branhamella) catarrhal is )、幾腸球菌(Enterococcus faecalis)、恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)、牛分枝桿菌 BCG (Mycobacterium bovisBCG);泳道 13 為DL2000DNA分子質量標準；泳道14 一 16模板依次為陽性對照流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)、b型流感嗜血桿菌、陰性對照。圖2為實施例I檢測結果；泳道M為DL2000DNA分子質量標準；泳道I — 10模板 為臨床痰標本基因組DNA，泳道5于215bp、821bp處出現2條對應大小的條帶，泳道6于215bp、620bp、821bp處出現3條對應大小的條帶，判為檢出流感嗜血桿菌，其相應標本的細菌培養結果亦證實檢出流感嗜血桿菌；泳道11、12為陽性對照與陰性對照。圖3為建立的多重降落PCR的檢測限檢測結果泳道I — 7模板依次對應為b型流感嗜血桿菌基因組DNA 20ng及其10 稀釋模板；泳道8為DL2000DNA分子質量標準；泳道9為陰性對照；檢出下限為5道模板，對應為2pgb型流感嗜血桿菌基因組DNA。
具體實施例方式實施例I :痰標本預處理痰標本應用生理鹽水洗滌2次，加入等量的1%胰酶(當天現配現用)于37°C消化90min。提取痰標本中的細菌DNA :取已消化的痰標本I. 5ml用Takara minibest細菌基因組提取試劑盒(Takara，大連寶生)提取痰標本中的細菌DNA。提取的DNA直接用于PCR擴增或置于一 20°C保存備用。PCR擴增總體系25iU，在200iil PCR小管內依次加入12. 55 U I雙蒸水，2. 5 iU緩沖液(10XPCR)，BSA(10mg/ml)0. 25 U I、引物 Hi_omp P6-F (10 u mol/L) 0. 5 u l，Hi_ompP6-R (10 u mol/L) 0. 5 u I, Hi_frdB-F (IOu mol/L) Iu I, Hi_frdB-R (IOu mol/L) Iu I,Hi_16S rRNA-F (lOumo/L) I u I, Hi_16S rRNA-R (10 u mol/L) I u 1, 2 u IMgCl2 (25mM),0. 5u I dNTP (IOmM)，0. 2 ill Taq DNA 聚合酶(5U/iU), 2 提取的痰標本基因組 DNA。同時設流感嗜血桿菌陽性模板對照與陰性對照(雙蒸水作為模板)。手指輕彈混勻，短暫離心后放入PCR儀。3對流感嗜血桿菌引物為針對流感嗜血桿菌omp P6基因設計的Hi_omp P6_F 5’ -GAAATGGTGCTGCTCAAACTTT-3’，Hi_omp P6-R :5’ -TGCGATGTTGTATTCTGGTGTA-3’，擴增片斷長度215bp ；
針對流感嗜血桿菌frdB基因設計的Hi_frdB_F 5’ -CGATCAAGAGCCACATTTAAGC-3’，Hi_frdB-R :5’ -CTTCTGAGCAATAGCCAACGA-3’，擴增片斷長度 620bp ；/
針對流感嗜血桿菌16S rRNA基因設計的Hi_16S rRNA-F 5’-CGTATTATCGGAAGATGAAAGTGC-3’，Hi_16S rRNA-R :5’-AGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGTT-3J,擴增片斷長度821bp。設置PCR反應循環參數94 V 5min ；94 V 30s, 65 °C (每循環降低
0.5°C ) 30s, 72°C lmin, 20 個循環；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin, 20 個循環；72°C 7min。擴增產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，上樣量為5 Ul與6X上樣緩沖液混勻后加入膠孔中，于IXTAE溶液中，在100V電壓下，電泳30min，電泳后經0. 5mg/L的溴化乙錠浸泡染色IOlOmin后，于凝膠成像分析系統中分析檢測結果。如陰性對照無條帶，陽性對照于215bp、620bp、821bp處出現對應大小的條帶，檢測樣本出現215bp、620bp、821bp條帶中的任意2條或3條則代表檢出流感嗜血桿菌(見圖2);如陽性對照于215bp、620bp、821bp處未出現對應大小的條帶或陰性對照出現非特異性條帶，則判為實驗失敗，需重新檢測。實施例2 多重降落PCR的特異性檢測。提取大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、卡它莫拉菌、糞腸球菌、恥垢分枝桿菌、肺炎鏈球菌、結核分枝桿菌、牛分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、流感嗜血桿菌與b型流感嗜血桿菌的基因組DNA，取上述細菌的純培養物用Takaraminibest細菌基因組提取試劑盒(Takara，大連寶生)提取其基因組DNA。提取的DNA直接用于PCR擴增或置于一 20°C保存備用。PCR擴增總體系25iU，在200iU PCR小管內依次加入12. 55 U I雙蒸水，2. 5 iU緩沖液(10XPCR)，BSA(10mg/ml)0. 25 U I、引物 Hi_omp P6-F (10 u mol/L) 0. 5 u l，Hi_ompP6-R (10 u mol/L) 0. 5 u I, Hi_frdB-F (IOu mol/L) Iu I, Hi_frdB-R (IOu mol/L) Iu I,Hi_16S rRNA-F (IOu mol/L) Iu I, Hi_16S rRNA-R (IOu mol/L) Iu 1,2 u IMgCl2 (25mM),
0.5u I dNTP (IOmM)，0. 2 ill Taq DNA聚合酶(5U/yl)，模板為2 yl提取的細菌基因組DNA。同時設陰性對照(雙蒸水作為模板)。手指輕彈混勻，短暫離心后放入PCR儀。3對流感嗜血桿菌引物為針對流感嗜血桿菌omp P6基因設計的Hi omp P6-F 5’ -GAAATGGTGCTGCTCAAACTTT-3’，Hi_omp P6-R :5’ -TGCGATGTTGTATTCTGGTGTA-3’，擴增片斷長度215bp ；針對流感嗜血桿菌frdB基因設計的Hi_frdB_F 5’ -CGATCAAGAGCCACATTTAAGC-3’，Hi_frdB-R :5’ -CTTCTGAGCAATAGCCAACGA-3’，擴增片斷長度 620bp ；針對流感嗜血桿菌16S rRNA基因設計的Hi_16S rRNA-F 5 CGT A TT A TCGG A A G A TG A A A GTGC - 3 ’，Hi_ I 6S r RN A - R 5’ -AGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGIT-3’，擴增片斷長度 82Ibp。設置PCR反應循環參數94 V 5min ；94 V 30s, 65 °C (每循環降低
0.5°C ) 30s, 72°C lmin, 20 個循環；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin, 20 個循環；72°C 7min。
擴增產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，上樣量為5 Ul與6X上樣緩沖液混勻后加入膠孔中，于I X TAE溶液中，在100V電壓下，電泳30min，電泳后經0. 5mg/L的溴化乙錠浸泡染色IOlOmin后，于凝膠成像分析系統中分析檢測結果。流感嗜血桿菌與b型流感嗜血桿菌于215bp、620bp、821bp處出現對應大小的條帶，其它細菌基因組模板及陰性對照無條帶出現(見圖I)。實施例3 多重降落PCR的檢測限確定。提取b型流感嗜血桿菌的基因組DNA :取b型流感嗜血桿菌純培養液I. 5ml用Takaraminibest細菌基因組提取試劑盒(Takara，大連寶生)提取其基因組DNA。提取的DNA 直接用于PCR擴增或置于_20°C保存備用。PCR擴增總體系25iU，在200iil PCR小管內依次加入12. 55 U I雙蒸水，2. 5 iU緩沖液(10XPCR)，BSA(10mg/ml)0. 25 U I、引物 Hi_omp P6-F (10 u mol/L) 0. 5 u l，Hi_ompP6-R (10 u mol/L) 0. 5 u I, Hi_frdB-F (IOu mol/L) Iu I, Hi_frdB-R (IOu mol/L) Iu I,Hi_16S rRNA-F (IOu mol/L) Iu I, Hi_16S rRNA-R (IOu mol/L) Iu 1,2 u IMgCl2 (25mM),
0.5 ill dNTP (IOmM)，0. 2 ill Taq DNA聚合酶(5U/)，模板為2 提取的b型流感嗜血桿菌基因組DNA或其10 稀釋模板。同時設陰性對照(雙蒸水作為模板)。手指輕彈混勻，短暫離心后放入PCR儀。3對流感嗜血桿菌引物為針對流感嗜血桿菌omp P6基因設計的Hi omp P6-F 5’ -GAAATGGTGCTGCTCAAACTTT-3’，Hi_omp P6-R :5’ -TGCGATGTTGTATTCTGGTGTA-3’，擴增片斷長度215bp ；針對流感嗜血桿菌frdB基因設計的Hi_frdB_F 5’ -CGATCAAGAGCCACATTTAAGC-3’，Hi_frdB-R :5’ -CTTCTGAGCAATAGCCAACGA-3’，擴增片斷長度 620bp ；針對流感嗜血桿菌16S rRNA基因設計的Hi_16S rRNA-F 5’-CGTATTATCGGAAGATGAAAGTGC-3’，Hi_16S rRNA-R :5’-AGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGTT-3J,擴增片斷長度821bp。設置PCR反應循環參數94 V 5min ；94 V 30s, 65 °C (每循環降低
0.5°C )30s, 72 °C lmin, 20 個循環；94°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C lmin, 20 個循環；72°C 7min。擴增產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，上樣量為5 iU與6 X上樣緩沖液混勻后加入膠孔中，于IXTAE溶液中，在100V電壓下，電泳30min，電泳后經0. 5mg/L的溴化乙錠浸泡染色IOlOmin后，于凝膠成像分析系統中分析檢測結果。將于215bp、620bp、821bp處出現對應大小條帶的最低b型流感嗜血桿菌基因組DNA濃度定義為該多重降落PCR的檢測下限(見圖3)。
權利要求
1. 一種流感嗜血桿菌多重降落PCR檢測試劑盒，包括=IOXPCR緩沖液，MgCl2, dNTP,Taq DNA聚合酶，BSA，流感嗜血桿菌陽性對照DNA，3對流感嗜血桿菌引物；其特征在于所述3對流感嗜血桿菌引物如下 第 I 對5，-GAAATGGTGCTGCTCAAACTTT-3，，與 5，-TGCGATGTTGTATTCTGGTGTA-3，；第 2 對5’ -CGATCAAGAGCCACATTTAAGC-3’ 與 5’ -CTTCTGAGCAATAGCCAACGA-3’ ；第 3 對5’ -CGTATTATCGGAAGATGAAAGTGC-3’ 與 5’ -AGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGTT-3’。
全文摘要
本發明公開了一種可快速檢測下呼吸道標本中流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)的多重降落PCR檢測試劑盒。本發明屬于下呼吸道感染性疾病的分子診斷技術領域，擬解決下呼吸道標本中流感嗜血桿菌的快速診斷。該試劑盒包括10×PCR緩沖液，MgCl2，dNTP，TaqDNA聚合酶，BSA，流感嗜血桿菌陽性對照DNA，3對流感嗜血桿菌引物。本發明并建立了可檢測流感嗜血桿菌的多重降落PCR檢測試劑盒及檢測方法，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。本發明建立的多重降落PCR檢測試劑盒及檢測方法快速、簡便、特異、靈敏，可用于流感嗜血桿菌感染的快速診斷與流行病學調查。
文檔編號C12Q1/04GK102653794SQ20121014861
公開日2012年9月5日 申請日期2012年5月14日 優先權日2012年5月14日
發明者侯艷嬌, 杜蓬, 潘紅, 羅欲承, 邵世和, 邵晨 申請人:江蘇大學