專利名稱：鮑曼不動桿菌多重降落pcr檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及鮑曼不動桿菌感染的分子診斷技術領域，具體涉及多重降落PCR檢測方法在下呼吸道標本中鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii)檢測中的應用。
背景技術：
鮑曼不動桿菌為重要的院內感染病原，廣泛存在于自然界中，生命力頑強。在醫院環境中，鮑曼不動桿菌廣泛存在于各種醫療器械與患者的被褥中，亦可于醫護人員的手、工作服、聽診器中檢出。近年來其在院內感染中的重要性不斷上升，主要累及危重患者(如IUC患者)，可引起呼吸道感染、膿毒血癥與泌尿系統感染等，是醫院獲得性肺炎(HAP)、尤其是呼吸機相關肺炎(VAP)的重要致病菌。
Neil Woodford 等(Woodford N，et al. Multiplex PCR for genes encodingprevalent OXAcarbapenemases in Acinetobacter spp. Int J AntimicrobAgents, 2006，27 (4) : 351353.)以bla0XA_51_like基因為靶標建立的PCR的檢測結果支持bla^n&基因為鮑曼不動桿菌所固有。然而Lee Y T等發現I株不動桿菌基因型13TU臨床分離株亦存在 blaQXA_5Hike 基因(Lee Y T, et al. First identification of bla0XA_51_likein non-baumannii Acinetobacter spp. J Chemother, 2009，21 (5) : 514520.)。同時針對鮑曼不動桿菌的多個基因進行檢測可提高檢測方法的特異性。Korbie，D.J.等(Korbie，D.J. and J. S. Mattick, Touchdown PCR. for increased specificity and sensitivity inPCR amplification. Nat. Protocols, 2008. 3 (9) :p. 1452-1456.)發現降落 PCR 可提高 PCR的特異性與靈敏度。當前尚無同時針對鮑曼不動桿菌gltA、gyrB、bla0XA_51_like基因以檢測鮑曼不動桿菌的多重PCR報道。本發明建立的多重降落PCR可直接檢測下呼吸道標本中的鮑曼不動桿菌，費時少，具高度特異性與靈敏性，有利于鮑曼不動桿菌感染的快速診斷與流行病學調查。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種可快速特異檢測下呼吸道標本中鮑曼不動桿菌的多重PCR檢測試劑盒及檢測方法。為了解決上述技術問題，本發明是通過以下技術發案實現的一種鮑曼不動桿菌多重降落PCR檢測試劑盒，包括10XPCR緩沖液，MgCl2, dNTP,TaqDNA聚合酶，BSA，鮑曼不動桿菌陽性對照DNA，3對鮑曼不動桿菌引物；所述3對鮑曼不動桿菌引物序列如下第I 對5 ’ -AGCGACTCAAGCAGACTACC-3 ’ ( SEQ ID NO. I)與5’ -GAGCAGAGATACCAGCAGAGAT-3’ (SEQID NO. 2)；第2 對5，-TTATTATGACCGATGCCGATGT-3，( SEQ ID NO. 3)與5’ -CAGAATGTGCTGCCATACCT-3’ (SEQID NO. 4)；第3 對5，-TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3，( SEQ ID NO. 5)與5’ -TGGATTGCACTTCATCTTGG-3’ (SEQID NO. 6) (Woodford N，et al.Multiplex PCRfor genes encoding prevalent OXA carbapenemases in Acinetobacter spp.Int JAntimicrob Agents, 2006，27(4):351353.)；本發明還公開了應用上述試劑盒的檢測方法(一)提取待檢樣本DNA(二)多重降落PCR法擴增檢測待檢樣本DNA中的gltA、gyrB、blaQXA_51_like基因，具
體步驟如下
反應體系25 nl
H2OI，V fd
緩沖液 110 X PCR)2.5
BSA(10 mg/ml)0.25 ^il
AB—glt.A-F (10 MmoI/L)0. 5 nl
AS—gltA-R (10 (Jfliol/L)0. 5 pi
AB—gyrB-F (10 Umol/L)I p.1
AB—gyrB-R (10 剛ol/L)Ipl
AB—0XA-F (10 rtiiol/L)I yd
AB—0XA-R (10 Wnol/L)Ipl
MgCl2 (25 niM)2 |il
dNTP (10 mM)0.5^1
Taq DNA 聚合j* (5 U/nl)0.2 ^il
DNA模板2 nl3對鮑曼不動桿菌引物為AB_gltA-F :5，-AGCGACTCAAGCAGACTACC-3’(SEQ ID NO. I)AB_gltA-R :5，-AGCAGAGATACCAGCAGAGAT-3，(SEQ ID NO. 2)AB_gyrB-F :5’ -TTATTATGACCGATGCCGATGT-3’(SEQ ID NO. 3)AB_gyrB-R :5，-CAGAATGTGCTGCCATACCT-3，(SEQ ID NO. 4)AB_0XA-F :5’ -TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3’ (SEQ ID NO. 5)AB_0XA-R :5’ -TGGATTGCACTTCATCTTGG-3’ (SEQ ID NO. 6)(三)PCR反應循環參數如下94 °C 5min ；94 V 30s, 65 °C (每循環降低 0. 5 °C ) 30s, 72 V lmin, 20 個循環；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin, 20 個循環；72°C 7min。(四)電泳檢測鑒定對多重降落PCR反應產物進行瓊脂糖電泳檢測，如電泳圖中含有353bp、551bp、719bp條帶中的任意2條或3條則代表檢出鮑曼不動桿菌。有益效果本發明所建立的多重降落PCR可克服常規培養的耗時長、靈敏度低等問題，具有快速、簡便、特異、靈敏度高等特征。可于當天出檢測結果報告，可同時檢測鮑曼不動桿菌的3個基因，對鮑曼不動桿菌DNA的檢測下限達0. 82pg。該多重降落PCR可用于鮑曼不動桿菌感染的快速診斷與流行病學調查。
圖I為建立的多重降落PCR的特異性檢測結果；泳道I — 13模板依次對應為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、卡它莫拉菌(Moraxe Ila (Branhame 11a) catarrhal is )> 幾腸球菌(Enterococcus faecals)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)、肺炎鏈 球菌(Streptococcu spneumoniae)、b型流感嗜血桿菌、結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)、牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)、牛分枝桿菌 BCG (Mycobacteriumbovis BCG);泳道14為DL2000DNA分子質量標準；泳道15-16模板依次為陽性對照鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii)與陰性對照。圖2為實施例I檢測結果；泳道M為DL2000 DNA分子質量標準；泳道1_9模板為臨床痰標本基因組DNA，泳道7、8于353bp、551bp、719bp處出現3條對應大小的條帶，判為檢出鮑曼不動桿菌，其相應標本的細菌培養結果亦證實檢出鮑曼不動桿菌；泳道10、11為陽性對照與陰性對照。圖3為建立的多重降落PCR的檢測限檢測結果泳道1-7模板依次對應為鮑曼不動桿菌基因組DNA82ng及其10 稀釋模板；泳道8為陰性對照；泳道9為DL2000DNA分子質量標準；檢出下限為5道模板,對應為8. 2pg鮑曼不動桿菌基因組DNA。
具體實施例方式實施例I :痰標本預處理痰標本應用生理鹽水洗滌2次，加入等量的1%胰酶(當天現配現用)于37°C消化90min。提取痰標本中的細菌DNA :取已消化的痰標本I. 5ml用Takara minibest細菌基因組提取試劑盒(Takara，大連寶生)提取痰標本中的細菌DNA。提取的DNA直接用于PCR擴增或置于一 20°C保存備用。PCR擴增總體系25iU，在200iUPCR小管內依次加入12.55iU雙蒸水，2.5iU緩沖液(10XPCR)，BSA(10mg/ml)0. 25 U I、引物 AB_gltA_F (10umol/L) 0. 5u I, AB_gltA_R(10umol/L)0. 5u l,AB_gyrB-F (10umol/L)lu l,AB_gyrB-R (10umo/L)lu 1，AB_0XA_F(10 u mol/L) I u I, AB_0XA-R (10 u mol/L) I u l,2u IMgCl2 (25mM) ,0. 5u I dNTP (IOmM)，0. 2u I Taq DNA聚合酶(5U/yl )，2 提取的痰標本基因組DNA。同時設鮑曼不動桿菌陽性模板對照與陰性對照(雙蒸水作為模板)。手指輕彈混勻，短暫離心后放入PCR儀。3對鮑曼不動桿菌引物為針對鮑曼不動桿菌gltA基因的引物對AB_gltA_F:5’ -AGCGACTCAAGCAGACTACC-3’，AB_gltA-R :5’ -GAGCAGAGATACCAGCAGAGAT-3’，擴增片斷長度 551bp ；針對鮑曼不動桿菌gyrB基因的引物對AB_gyrB_F:5’ -TTATTATGACCGATGCCGATGT-3’，AB_gyrB-R :5’ -CAGAATGTGCTGCCATACCT-3’，擴增片斷長度 719bp ；針對鮑曼不動桿菌blaQXA_51_like基因的弓丨物對AB_0XA-F:5’ -TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3’，AB_0XA_R :5’ -TGGATTGCACTTCATCTTGG-3’，擴增片斷長度353bp。設置PCR反應循環參數94 V 5min ；94 V 30s, 65 °C (每循環降低0. 5°C ) 30s, 72°C lmin, 20 個循環；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin, 20 個循環；72°C 7min。擴增產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，上樣量為5 Ul與6X上樣緩沖液混勻后加入膠孔中，于I X TAE溶液中，在100V電壓下，電泳30min，電泳后經0. 5mg/L的溴化乙錠浸泡染色IOlOmin后，于凝膠成像分析系統中分析檢測結果。如陰性對照無條帶，陽性對照于353bp、551bp、719bp處出現對應大小的條帶，檢測樣本出現353bp、551bp、719bp條帶中的任意2條或3條則代表檢出鮑曼不動桿菌(見圖2);如陽性對照于353bp、551bp、719bp處未出現對應大小的條帶或陰性對照出現非特異性條帶，則判為實驗失敗，需重新檢測。 實施例2:多重降落PCR的特異性檢測。提取大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、卡它莫拉菌、糞腸球菌、流感嗜血桿菌、恥垢分枝桿菌、肺炎鏈球菌、b型流感嗜血桿菌、結核分枝桿菌、牛分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG、鮑曼不動桿菌的基因組DNA，取上述細菌的純培養物用Takaraminibest細菌基因組提取試劑盒(Takara，大連寶生)提取其基因組DNA。提取的DNA直接用于PCR擴增或置于_20°C保存備用。PCR擴增總體系25iU，在200iUPCR小管內依次加入12.55iU雙蒸水，2.5iU緩沖液(10XPCR)，BSA(10mg/ml)0. 25 U I、引物 AB_gltA_F (10 u mol/L) 0. 5u I, AB_gltA_R(10umol/L)0. 5u l,AB_gyrB-F (10umol/L)lu l,AB_gyrB-R (10umol/L)lu 1，AB_0XA_F(10 u mol/L) Iii I, AB_0XA-R (IOu mol/L) I u l,2u IMgCl2 (25mM), 0. 5 u I dNTP (IOmM),0. 2 ill Taq DNA聚合酶(5U/ U I),模板為2 U I提取的細菌基因組DNA。同時設陰性對照(雙蒸水作為模板)。手指輕彈混勻，短暫離心后放入PCR儀。3對鮑曼不動桿菌引物為針對鮑曼不動桿菌gltA基因的引物對AB_gltA_F:5’ -AGCGACTCAAGCAGACTACC-3’，AB_gltA-R :5’ -GAGCAGAGATACCAGCAGAGAT-3’，擴增片斷長度 551bp ；針對鮑曼不動桿菌gyrB基因的引物對AB_gyrB_F 5’ -TTATTATGACCGATGCCGATGT-3’，AB_gyrB-R :5’ -CAGAATGTGCTGCCATACCT-3’，擴增片斷長度 719bp ；針對鮑曼不動桿菌blaQXA_51_like基因的弓丨物對AB_0XA-F:5’ -TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3’，AB_0XA_R :5’ -TGGATTGCACTTCATCTTGG-3’，擴增片斷長度353bp。設置PCR反應循環參數94 V 5min ；94 V 30s, 65 °C (每循環降低0. 5°C ) 30s, 72°C lmin, 20 個循環；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin, 20 個循環；72°C 7min。擴增產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，上樣量為5 Ul與6X上樣緩沖液混勻后加入膠孔中，于IXTAE溶液中，在100V電壓下，電泳30min，電泳后經0. 5mg/L的溴化乙錠浸泡染色IOlOmin后，于凝膠成像分析系統中分析檢測結果。鮑曼不動桿菌基因組模板于353bp、55Ibp、719bp處出現對應大小的條帶，其它細菌基因組模板及陰性對照無條帶出現(見圖I)。實施例3:多重降落PCR的檢測限確定。提取鮑曼不動桿菌 的基因組DNA :取鮑曼不動桿菌純培養液I. 5ml用Takaraminibest細菌基因組提取試劑盒(Takara，大連寶生)提取其基因組DNA。提取的DNA直接用于PCR擴增或置于一 20°C保存備用。PCR擴增總體系25iU，在200iUPCR小管內依次加入12.55iU雙蒸水，2.5iU緩沖液(10XPCR)，BSA(10mg/ml)0. 25 U I、引物 AB_gltA_F (10 u mol/L) 0. 5u I, AB_gltA_R(10umol/L)0. 5u l,AB_gyrB-F (10umol/L)l u l,AB_gyrB-R (10umol/L)lu 1，AB_0XA_F(10 u mol/L) I u I, AB_0XA-R (10 u mol/L) I u l,2u IMgCl2 (25mM) ,0. 5u I dNTP (IOmM)，0. 2u I Taq DNA聚合酶(5U/yl)，模板為2 yl提取的鮑曼不動桿菌基因組DNA或其10 稀釋模板。同時設陰性對照(雙蒸水作為模板)。手指輕彈混勻，短暫離心后放入PCR儀。3對鮑曼不動桿菌引物為針對鮑曼不動桿菌gltA基因的引物對AB_gltA_F:5’ -AGCGACTCAAGCAGACTACC-3’，AB_gltA-R :5’ -GAGCAGAGATACCAGCAGAGAT-3’，擴增片斷長度 551bp ；針對鮑曼不動桿菌gyrB基因的引物對AB_gyrB_F 5’ -TTATTATGACCGATGCCGATGT-3’，AB_gyrB-R :5’ -CAGAATGTGCTGCCATACCT-3’，擴增片斷長度 719bp ；針對鮑曼不動桿菌blaQXA_51_like基因的弓丨物對AB_0XA-F:5’ -TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3’，AB_0XA_R :5’ -TGGATTGCACTTCATCTTGG-3’，擴增片斷長度353bp。設置PCR 反應循環參數94°C 5min ；94°C 30s, 65°C (每循環降低 0. 5°C ) 30s, 72°Clmin，20 個循環；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin，20 個循環；72°C 7min。擴增產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，上樣量為5 Ul與6X上樣緩沖液混勻后加入膠孔中，于I X TAE溶液中，在100V電壓下，電泳30min，電泳后經0. 5mg/L的溴化乙錠浸泡染色IOlOmin后，于凝膠成像分析系統中分析檢測結果。將于353bp、551bp、719bp處出現對應大小條帶的最低鮑曼不動桿菌基因組DNA濃度定義為該多重降落PCR的檢測下限(見圖3)。
權利要求
1. 一種鮑曼不動桿菌多重降落PCR檢測試劑盒，包括=IOXPCR緩沖液，MgCl2, dNTP，Taq DNA聚合酶，BSA，鮑曼不動桿菌陽性對照DNA，3對鮑曼不動桿菌引物，其特征在于所述3對鮑曼不動桿菌引物序列如下第 I對5’ -AGCGACTCAAGCAGACTACC-3’ 與 5’ -GAGCAGAGATACCAGCAGAGAT-3’ ；第 2 對5’ -TTATTATGACCGATGCCGATGT-3’ 與 5’ -CAGAATGTGCTGCCATACCT-3’ ； 第 3 對5，-TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3，與 5，-TGGATTGCACTTCATCTTGG-3，。
全文摘要
本發明公開了一種可快速檢測下呼吸道標本中鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)的多重降落PCR檢測試劑盒。本發明屬于下呼吸道感染性疾病的分子診斷技術領域，擬解決下呼吸道標本中鮑曼不動桿菌的快速診斷。所述試劑盒包括10×PCR緩沖液，MgCl2，dNTP，TaqDNA聚合酶，BSA，鮑曼不動桿菌陽性對照DNA，以及3對鮑曼不動桿菌引物。本發明建立了可檢測鮑曼不動桿菌的多重降落PCR檢測試劑盒及檢測方法，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。本發明建立的多重降落PCR檢測試劑盒及檢測方法快速、簡便、特異、靈敏，可用于鮑曼不動桿菌感染的快速診斷與流行病學調查。
文檔編號C12R1/01GK102653793SQ201210148590
公開日2012年9月5日 申請日期2012年5月14日 優先權日2012年5月14日
發明者侯艷嬌, 杜蓬, 潘紅, 羅欲承, 邵世和, 錢靜漪, 陳珵 申請人:江蘇大學