專利名稱：檢測SLC26A4基因c.665G＞T突變的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因檢測領域，具體涉及用于檢測SLC26A4基因突變基因的試劑盒，本發明還涉及新的SLC26A4突變基因及其在診斷和/或治療前庭導水管擴大疾病相關的應用。
背景技術：
SLC26A4基因位于7q31，其最初是由Everett等定位，并且發現該基因突變可以導致一種常染色體隱性遺傳性疾病=Pendred綜合征，臨床表現為甲狀腺腫，及合并前庭導水管擴大或Mondini畸形(前庭導水管擴大合并耳蝸發育不全)的感音神經性耳聾。后來，Usami等對6例單純前庭導水管擴大家系的SLC26A4基因的篩查結果表明，該基因的突變還可以導致單純前庭導水管擴大，其遺傳模式也是隱性遺傳.由此可見，SLC26A4基因突變可·以導致前庭導水管擴大——單純性前庭導水管擴大或者是合并耳蝸畸形的前庭導水管擴大。前庭導水管擴大是內耳最常見的畸形，其在遺傳性耳聾中占到I 8%。臨床上主要表現為高頻聽力損失為主的感音神經性耳聾，聽力損失程度多表現為重度或者是極重度聾。發病多在兒童時期，其發病前常有感冒、發燒、外傷等使顱內壓增高的誘因。與前庭導水管擴大相關的SLC26A4基因mRNA全長4930bp，含21個外顯子，開放閱讀框架2343bp(如SEQ ID NO. I所示)，貫穿外顯子2和外顯子21。該基因編碼的蛋白——Pendrin是一個分子量為86kD,含780個氨基酸的跨膜蛋白，屬于離子轉運子家族。Scott和Bidart等的研究發現，Pendrin主要表達于甲狀腺濾泡細胞的頂膜及內淋巴管和內淋巴囊的主細胞，介導碘離子和氯離子的轉運，在維持甲狀腺組織和內淋巴的離子平衡上發揮作用。在甲狀腺，當Pendrin功能障礙時，其不能把碘離子及時轉運到濾泡膠質，使碘離子在濾泡細胞內積聚，從而不能有效有機化并與甲狀腺球蛋白結合，從而導致Pendred綜合征中甲狀腺腫的發生。Qvortrup等認為，大鼠的內淋巴囊類似甲狀腺濾泡，有平衡膠狀物質填塞囊腔，內淋巴囊主細胞的功能類似于甲狀腺濾泡細胞，可以合成、分泌、吸收、消化蛋白質。氯離子轉運障礙使內淋巴液的成分改變，從而損傷感覺上皮細胞，導致感音神經性耳聾。并且由于滲透壓改變和成分改變的毒性機制導致膜迷路結構改變。由于內淋巴管和內淋巴囊到4歲時才停止發育，因此它們的擴大可以導致周圍骨性結構的改變，例如前庭導水管或耳蝸結構的改變。對于前庭導水管擴大患者SLC26A4基因突變的篩查，國外已經廣泛開展，報道的致病突變位點超過100個，包括錯義突變、框移突變、無義突變及剪接位點突變，分布于各個外顯子。SLC26A4基因具有明顯的異質性，不同種族其突變形式不完全相同。該基因突變后其編碼的蛋白不能準確定位到細胞膜上，而是存在于內質網或者是高爾基體內，影響離子轉運。前庭導水管擴大患者SLC26A4基因突變的發現，不僅會促進該病的發病機理等基礎研究的發展，還將大大促進前庭導水管擴大的基因診斷和治療的開展。通過產前診斷篩查及新生兒SLC26A4基因突變的普遍篩查，可以降低前庭導水管擴大患兒的出生率，并且實現癥前診斷，從而指導攜帶致病基因的患兒的行為，預防疾病的發生，這將會大大減少耳聾患者的數量，減輕社會壓力。未來的研究將致力于基因治療方面，能夠預見，基因治療將會給包括耳聾在內的各種遺傳性疾病的治療帶來質的飛躍。
發明內容
本發明的一個目的在于提供用于檢測SLC26A4基因c. 665G>T突變的試劑盒，其技術方案為—種用于檢測與前庭導水管擴大疾病相關的位于SLC26A4基因外顯子6的c. 665G>T突變的試劑盒，所述試劑盒包括從待測樣品中提取DNA的試劑；用于擴增樣本DNA的PCR反應試劑；
對PCR擴增產物進行測序的試劑；其中，所述擴增樣本DNA的PCR反應試劑包括PCR引物，所述PCR弓丨物擴增的目標片段包含SLC26A4基因第665位堿基。具體地，上述PCR引物為選自SLC26A4-6F-1 (SEQ ID NO. 3) :5’ -GGTTTCTATCTCAGGCAAACAT-3’，SLC26A4-6R-1 (SEQ ID NO. 4) :5’ -ATTGTTTCTGGAATGAACAGTGACC-3’ ；SLC26A4-6F-2 (SEQ ID NO. 5) :5’ -AGGAAGGGGAGTGATAGGGT-3’，SLC26A4-6R-2 (SEQ ID NO. 6) :5，-GCCCAGACTCAGAGAATGAAT-3，；SLC26A4-6F-3 (SEQ ID NO. 7) :5’ -CTACCAGTATTTTTGTGCTAT-3’，SLC26A4-6R-3 (SEQ ID NO. 8) :5，-CAAAGTGCTGGGATTACAGG-3’ ;SLC26A4-6F-4 (SEQ ID NO. 9) :5’ -GGACCGAAAGCCACATAAAT-3’，SLC26A4-6R-4 (SEQ ID NO. 10) :5，-ACCACCACACCCAGCAAAT-3，;中一的對。本發明的另一個目的在于提供上述試劑盒用于檢測位于SLC26A4基因外顯子6的c. 665G>T突變的方法，包括以下步驟I)采集待測個體的血液、體液或組織樣本，提取DNA ；2)以該DNA為模板，以PCR引物進行PCR反應，得到PCR反應產物；其中，所述PCR引物擴增的目標片段包含SLC26A4基因第665位堿基；3)將得到的PCR反應產物進行直接測序，并將測序結果與SLC26A4正常基因的序列進行比較，確定是否存在SLC26A4基因的c. 665G>T突變位點。進一步地,上述方法還包括下述步驟4)按照正常閱讀框架進行翻譯以確定c. 665G>T突變使氨基酸序列于222位發生錯義改變，并使第222位編碼的氨基酸由甘氨酸變為纈氨酸(p. G222V)，極性氨基酸變為了非極性氨基酸。本發明的又一個目的是提供上述試劑盒在用于檢測前庭導水管擴大疾病中的用途，將為在前庭導水管擴大相關疾病患者中開展易感基因篩查提供方便確實的方法，便于易感基因在診斷和/或治療前庭導水管擴大相關疾病中的應用；提供診斷前庭導水管擴大的方法，其通過檢測來自患者的待測樣本中是否存在具有本發明所述突變形式的SLC26A4突變基因而判斷患者前庭導水管擴大癥的發生和類型，進而為臨床診斷和治療提供參考；同時可以指導臨床治療，并為將來利用這一突變作為靶點開展耳聾的基因治療提供堅實的基礎。使用本發明的試劑盒的檢測方法為通過檢測來自于患者的待測樣本中是否存在SLC26A4基因c. 665G>T突變，而判斷該患者前庭導水管擴大相關疾病發生原因及類型。其中，SLC26A4基因的c. 665G>T堿基改變引起氨基酸編碼過程中在222位發生錯義改變，并使第222位編碼的氨基酸由甘氨酸變為纈氨酸(p. G222V)，圖I給出SLC26A4編碼區氨基酸與核酸堿基的對照圖，并用紅色方框示出突變位點所在位置。這一突變位點位于Pendrin的第五細胞外環袢，使222位極性親水的甘氨酸變成了非極性疏水的纈氨酸，同時，其氨基酸序列與獼猴、大鼠、狗、雞等同源序列的進化研究結果表明，該突變位點具有高度保守性，這一突變將導致SLC26A4基因編碼的Pendrin蛋白功能異常。SLC26A4基因突變相關的前庭導水管擴大相關疾病以常染色體隱性遺傳的方式傳 遞。發明人應用候選基因篩查的方法對272例前庭導水管擴大患者和100例聽力正常且無家族史的對照進行篩查，在一例前庭導水管擴大患者發現SLC26A4基因雜合的c. 665G>T錯義突變，除此之外患者還攜帶另一個位于外顯子區域的雜合突變，SLC26A4基因突變與前庭導水管擴大表型共分離。同時100名正常人的篩查中未檢測到該突變，說明這一突變位點與前庭導水管擴大密切相關。目前國際上報道與前庭導水管擴大相關的突變有100多種，尚無c. 665G>T突變的報道。圖I給出SLC26A4編碼區氨基酸與核酸堿基的對照圖，并示出突變位點(方框標記處)，該突變使位于SLC26A4基因編碼區的第665位中的一個G堿基變為T堿基，使得第222位編碼的氨基酸由甘氨酸變為纈氨酸(P. G222V)。突變發生后編碼的氨基酸極性發生改變，導致SLC26A4基因編碼的Pendrin蛋白功能異常。檢測該突變可用本領域的任何檢測點突變的方法來進行，例如PCR (聚合酶鏈反應)一測序法、采用標記的SLC26A4基因DNA探針雜交法或用限制性片段長度多態性方法或序列特異性引物的方法等等。在本發明的一個實施方案中，采用PCR擴增-直接測序法來檢測樣本，具體包括下述步驟I)采集待測個體的樣本，例如血液、體液或組織，提取基因組DNA ；2)以該DNA為模板，以針對SLC26A4基因或SLC26A4編碼區第222位堿基附近設計的PCR引物進行PCR反應，得到PCR擴增產物；3)將得到的PCR產物進行直接測序分析，將所得到的序列與SLC26A4正常基因的序列進行比較，確定是否存在SLC26A4突變位點。4)根據以上結果判斷待測個體是否為SLC26A4基因突變c. 665G>T導致的前庭導水管擴大。進一步的，該方法可以選擇性的包括如下步驟5)按正常閱讀框進行翻譯以確定氨基酸是否存在第222位編碼的甘氨酸變為纈氨酸(P.G222V)。在發明人進行的實驗中，通過聾病門診及資源收集網絡收集前庭導水管擴大患者，建立資源庫。在患者自愿的前提下，簽署知情同意書后，留取5-10ml血樣，并建立門診病歷資料庫，詳細記錄患者病情、家系中的發病情況以及聯系方式。然后，應用酚氯仿抽提的方法提取基因組DNA，定量后入庫，-20° C保存，每份DNA樣品均詳細對應于登記的患者臨床資料。然后，應用在線引物設計軟件Primer3設計引物，包含SLC26A4整個編碼區，應用PCR擴增。PCR產物直接測序測序引物與PCR擴增引物相同，正反向測序，應用ABI公司3700DNA測序儀。得到的序列與Genbank中的序列(登錄號NC 000007. 13)比較確定SLC26A4突變位點。按正常閱讀框進行翻譯以確定SLC26A4的突變位點。上述步驟2所得到的PCR反應產物還可以用雜交探針來檢測，所用的雜交探針可以是與正常的SLC26A4核苷酸序列雜交，或與突變的核苷酸序列雜交，或與它們的互補序列雜交的探針。這些探針可以用放射性同位素、發色物質或熒光物質標記，尤其是可利用等位基因特異探針，也可用限制性酶切的方法篩查是否存在已被確定的突變。因此，檢測PCR擴增產物的試劑選自測序檢測試劑、限制性內切酶酶切檢測試劑、限制性長度多態性檢測試劑、序列特異性引物檢測試劑和探針雜交檢測試劑。在上述方法中使用的PCR引物可以依據已知的核苷酸序列設計，通常為15 30個堿基，GC含量為45 50%左右，在適當的溫度下與末端特異性結合，其可以利用專門的計算機程序設計。在本發 明的一個具體實施例中，應用在線引物設計軟件primer 3. O設計了一對PCR引物，其序列為上游引物SLC26A4-6F-1:5，-GGTTTCTATCTCAGGCAAACAT-3’下游引物SLC26A4-6R-1:5’-ATTGTTTCTGGAATGAACAGTGACC-3，SLC26A4正常基因的標準序列可以參考例如Genbank NC_000007. 13。用于檢測SLC26A4基因c. 665G>T突變的試劑盒中可以包含以下試劑用于擴增樣本DNA中SLC26A4基因或SLC26A4基因編碼區第665位堿基附近的PCR引物；以及以下一種或幾種試劑的組合從待測樣品中提取DNA的試劑；PCR反應試劑；對PCR擴增產物進行直接測序的試劑。例如，本發明的一個實施方案中提供一個檢測SLC26A4基因c. 665G>T突變的試劑盒，容器內裝有用以檢測SLC26A4基因c. 665G>T突變的成分，與之同時提供的可以是經政府藥物管理機構審核的、有關藥品或生物制品的制造、使用及銷售信息。例如，采用PCR擴增后，直接檢測樣品中SLC26A4基因c. 665G>T突變位點的試劑盒，可含有擴增引物、dNTPs、用于PCR反應的DNA聚合酶及其緩沖液、或測序反應所需試劑等的一種或多種。本領域技術人員已知，以上組分僅是示意性的，例如，所述的引物可以采用上述的一對SLC26A4-6F-1和SLC26A4-6R-1引物，所述用于PCR反應的DNA聚合酶是能夠用于PCR擴增的酶。所述試劑盒的使用方法主要包括如下步驟(I)提取待測血樣的DNA，利用上述的一對SLC26A4-6F-1和SLC26A4-6R-1引物，進行PCR反應，得到PCR反應產物；(2)PCR反應產物純化后直接測序，將所得的序列與Genbank中的標準序列比較確定突變位點的存在；所述步驟還可進一步包括(3)按正常閱讀框進行翻譯以確定氨基酸是否存在第222位編碼的甘氨酸變為纈氨酸(P.G222V)。
該試劑盒可簡便快捷地檢測SLC26A4突變位點，從而應用于前庭導水管擴大相關基因的檢測及其診斷或治療方法中。本發明也提供了 SLC26A4突變基因在診斷或治療前庭導水管擴大中的應用。通過檢測來自患者的待測樣本中是否存在SLC26A4基因c. 665G>T突變而判斷該患者的前庭導水管擴大發生原因及類型，進而為臨床診斷和治療提供依據；此外，在進一步的臨床治療方面，在檢測為發生了 SLC26A4基因c.665G>T突變之后，可以將正常基因導入攜帶突變基因的細胞并在其中表達，它可與內源性突變基因發生重組，從而可以進行基因治療。本發明提出了通過檢測患者中是否存在SLC26A4基因新的突變而診斷前庭導水管擴大發生的原因和類型的檢測方法，這將有利于為不同類型前庭導水管擴大患者確定個體化治療方案。下面結合附圖，通過對本發明較佳實施方式的說明，詳細描述但不限制本發明。
圖I為SLC26A4基因編碼區核苷酸與氨基酸的對照突變位于SLC26A4基因第222位中一個G堿基，用方框圈起來的是突變的堿基和對應的氨基酸，突變后的堿基序列使氨基酸于222位發生錯義突變(下劃線部分的氨基酸)。圖2為本發明方法中PCR反應過程示意圖，示出了反應溫度和時間，其中*表示每個循環降低0.5°C。圖3為本發明方法中，對PCR產物進行電泳定量的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，圖中示出了定量Marker的片段位置。圖4為不同物種Pendrin氨基酸序列進化研究，通過對不同物種氨基酸序列比對，可見不同物種的Pendrin在該位點均為甘氨酸(G)，說明p. G222V突變位于保守區域；在獼猴、大鼠、狗、雞等物種間具有高度保守性。圖5為Pendrin的結構示意圖，星號示出第222位氨基酸所在位置，發生p. G222V突變的位置。
具體實施例方式本發明所用試驗材料，如無特別說明，均為市售購買產品。實施例I待測血樣提取與SLC26A4基因編碼區的PCR擴增一、待測對象血樣DNA的制備I、研究對象對272例散發前庭導水管擴大患者和100名無家族史的聽力正常對照按照下述方法進行SLC26A4基因的篩查。272例患者中，2例前庭導水管擴大患者的SLC26A4基因檢測發現患者為c. 665G>T突變和另外一已知致病種突變(c. 235delC)的復合雜合子。對100名聽力正常者的篩查中未發現c.665G>T突變者。對所有參加者詳細調查其病史以及家族史，并對其進行體格檢查，耳科檢查包括耳鏡檢查、聽力學評估。在簽署知情同意書以后每人采集血樣5 10ml。2、基因組DNA提取采用酚氯仿抽提法。
第一天I)抗凝血用PBS作I倍稀釋。2)在離心管中加入2倍體積的淋巴分離液(18° C 28° C)，上面鋪一層I倍體積已稀釋的血液，室溫，IOOOXg,離心20分鐘。3)吸棄上清液，小心吸出中間有核細胞層，轉入5ml Ep管中，5000 X g，離心10分鐘，然后用PBS洗一次。5000Xg,離心10分鐘。4)將細胞懸于 2ml TE 緩沖液(IOmM Tris. HCl, ImM EDTA，ρΗ8· O)中，加 10% 的 SDS(十二烷基硫酸)至終濃度O. 5% (100 μ I )，蛋白激酶k 100 200yg/ml (10mg/ml )，50° C水浴3 5小時。5)用酚氯仿提取。用等體積的飽和酚，加入混勻，5000Xg，離心10分鐘。 6)吸上清液至新離心管中，棄下層沉淀，加入等體積酚氯仿混合物，混勻，5000 Xg,離心10分鐘。7)吸上清液至新離心管中，棄下層沉淀，加入等體積氯仿異戊醇混合物，混勻，5000 Xg,離心10分鐘。8)吸上清液至新離心管中，棄下層沉淀，加入1/10體積的乙酸鈉，混勻。9)加入2. 5倍體積的無水乙醇。10)-20。C 沉淀 DNA 過夜。第二天11)高速離心，10000Xg，10 分鐘，4。C。12)棄上清液，加入75%乙醇2ml，高速離心10000 X g，5分鐘13)棄上清液，吹干。14)用 TE 緩沖液溶解(200 μ I TE/5ml 全血，400TE/10ml 全血)。15)分裝。1%瓊脂糖電泳和分光光度計定量。二、SLC26A4基因編碼區的PCR擴增I、引物序列上游引物SLC26A4-6F-1:5，-GGTTTCTATCTCAGGCAAACAT-3’下游引物SLC26A4-6R-1:5’-ATTGTTTCTGGAATGAACAGTGACC-3，注SLC26A4基因序列檢索號NC_000007. 13。2、PCR反應體系的建立(表I)表1SLC26A4基因的PCR反應體系
權利要求
1.一種用于檢測與前庭導水管擴大疾病相關的位于SLC26A4基因外顯子6的c. 665G>T突變的試劑盒，所述試劑盒包括 從待測樣品中提取DNA的試劑； 用于擴增樣本DNA的PCR反應試劑； 對PCR擴增產物進行測序的試劑； 其中，所述擴增樣本DNA的PCR反應試劑包括PCR引物，所述PCR弓丨物擴增的目標片段包含SLC26A4基因第665位堿基。
2.如權利要求I所述的試劑盒，其中所述PCR引物為選自下述引物中的一對 SLC26A4-6F-1:5’ -GGTTTCTATCTCAGGCAAACAT-3’，SLC26A4-6R-1:5’ -ATTGTTTCTGGAATGAACAGTGACC-3’ ；SLC26A4-6F-2:5， -AGGAAGGGGAGTGATAGGGT-3，，SLC26A4-6R-2:5’ -GCCCAGACTCAGAGAATGAAT—3’ ；SLC26A4-6F-3:5’ -CTACCAGTATTTTTGTGCTAT-3’ ， SLC26A4-6R-3:5，-CAAAGTGCTGGGATTACAGG-3，;SLC26A4-6F-4:5’ -GGACCGAAAGCCACATAAAT-3’ ，SLC26A4-6R-4:5，-ACCACCACACCCAGCAAAT-3，。
3.如權利要求I或2所述試劑盒，所述試劑盒用于檢測位于SLC26A4基因外顯子6的c. 665G>T突變的方法，包括以下步驟 1)采集待測個體的血液、體液或組織樣本，提取DNA； 2)以該DNA為模板，以PCR引物進行PCR反應，得到PCR反應產物； 其中，所述PCR引物擴增的目標片段包含SLC26A4基因第665位堿基； 3)將得到的PCR反應產物進行直接測序，并將測序結果與SLC26A4正常基因的序列進行比較，確定是否存在SLC26A4基因的c. 665G>T突變位點。
4.如權利要求3所述試劑盒，所述方法還進一步包括下述步驟 4)按照正常閱讀框架進行翻譯以確定c.665G>T突變使氨基酸序列于222位發生錯義改變，并使第222位編碼的氨基酸由甘氨酸變為纈氨酸(p. G222V)，極性氨基酸變為了非極性氨基酸。
5.如權利要求I所述的試劑盒在用于檢測前庭導水管擴大疾病中的用途。
全文摘要
本發明提供了檢測SLC26A4基因c.665G>T突變的試劑盒，通過檢測患者中是否存在該突變基因而診斷前庭導水管擴大發生的原因和類型。該突變基因和檢測方法將有利于臨床上開展前庭導水管擴大患者的SLC26A4突變篩查工作，為前庭導水管擴大患者的診斷和治療提供依據。
文檔編號C12Q1/68GK102851359SQ20121017176
公開日2013年1月2日 申請日期2012年5月29日 優先權日2012年5月29日
發明者王秋菊 申請人:王秋菊, 中國人民解放軍總醫院