一種檢測和評價抗病毒感染活性的方法

一種檢測和評價抗病毒感染活性的方法
【專利摘要】本發明涉及抗體工程和抗病毒醫藥領域，涉及一種快速有效的測定重組人抗乙型肝炎病毒抗體抗病毒功能的方法。本發明利用沉降性病毒復合物技術，建立了一種檢測和評估分子抗病毒能力的新方法。該方法是通過檢測受試分子在血清中誘導產生沉降性病原體復合物的能力，檢測分子的抗病毒和抗感染能力；所述的病原體是病毒。利用該方法可以快速檢測抗體和其它抗感染藥物清除病毒和控制病毒感染的能力。本方法操作過程簡單，結果重復性好，是對現有抗病毒藥物功能性檢測和評估方法的補充，該方法的建立為目前還沒有有效的細胞和動物感染模型病毒的藥物研發，提供了一種新的選擇。本發明還涉及抗病毒感染活性的檢測試劑、檢測過程中出現的沉降性病原體復合物和上述檢測方法的應用。
【專利說明】一種檢測和評價抗病毒感染活性的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及抗體工程和抗病毒醫藥領域，具體涉及一種快速有效的測定重組人抗乙型肝炎病毒抗體抗病毒功能的方法。
【背景技術】
[0002]人乙型肝炎病毒(human hepatitis B virus, HBV)感染是全球性的公共衛生問題，根據世界衛生組織((World Health Organization, WHO)的統計,全球范圍內有超過20億人曾感染過HBV，其中，3.5億正遭受慢性HBV感染之苦(WH0，2000)。我國為乙型肝炎的高發區。2006年全國病毒性肝炎血清流行病學調查數據顯示，在全部人群中乙肝表面抗原(HBsAg)的陽性率為7.18%。據此估計我國有9300萬人為HBV攜帶者，其中，3000萬例為慢性乙型肝炎患者。研究還顯示，慢性的HBV感染又與肝硬化和肝癌的發病率和死亡率密切相關。
[0003]乙肝病毒是DNA病毒，具部分環狀雙鏈的DNA。基因組長度約為3.2kb，含有四個基本閱讀框架，分別是編碼核心蛋白(核心抗原)和e蛋白(e抗原)的C基因；編碼大、中和小表面蛋白(表面抗原)的S基因；編碼聚合酶的P基因和編碼X蛋白的X基因。人乙型肝炎病毒具有種群和組織特異性，只感染人類的肝細胞。
[0004]乙肝病毒的感染始于病毒附著在肝細胞上，通過未知的機制，病毒外膜與細胞膜發生融合，病毒核衣殼被釋放到細胞質中并解聚，病毒基因組轉移到被感染細胞的細胞核內，在細胞修復酶的作用下形成閉合環狀DNA (cccDNA)0隨后，病毒以cccDNA為模板轉錄產生四種 mRNA，分別是 3.5kb 的 pgRNA、2.4kb 的 mRNA、2.1kb 的 mRNA 和 0.8kb 的 mRNA。
2.4kb和2.1kb的mRNA指導表面 蛋白的翻譯；0.8kb的mRNA指導X蛋白的翻譯；而3.5kb的PgRNA除了指導核心蛋白和聚合酶的翻譯外，還作為病毒的前基因組RNA，被新產生的核心蛋白和聚合酶包裹，形成新的核衣殼。在核衣殼中，病毒聚合酶以pgRNA為模板通過反轉錄合成新的DNA基因組。最終，完成DNA復制的核衣殼被表面蛋白包裹，形成成熟的病毒粒子，分泌出細胞，開始新的感染周期。
[0005]在HBV感染者的血清中可見三種不同形態的病毒顆粒，即大球型顆粒(又稱為Dane顆粒)、小球形顆粒和管型顆粒。雖然這三種形式的顆粒都具有乙型肝炎表面抗原(HBsAg)，但是只有大球型顆粒內部含病毒的雙鏈DNA分子，并具感染性。同時值得注意的是，小球形顆粒，也稱亞病毒顆粒，一般在血液中可比Dane顆粒多出10，000至1，000，000倍。部分病人自然感染狀態下會出現保護性抗體。研究表明，乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的主要抗原為“a”決定簇。免疫顯性“a”表位在所有病毒血清中存在。治療慢性病毒感染的抗體都是抗HBsAg。
[0006]人抗乙肝病毒抗體(HBIG)系從乙型肝炎疫苗免疫健康人群中，采集高效價血漿或血清后，分離提取制備的免疫球蛋白制劑，在臨床上被用于降低HBV的感染率。在中國和其它HBV高發地區，母嬰傳播是HBV的主要的感染途徑之一。臨床研究顯示，HBIG與重組HBV疫苗聯合使用是目前阻斷HBV母嬰傳遞最有效的手段，其保護率達95%左右。乙肝表面抗原(HBsAg)陽性母親所產新生兒出生后24h內使用乙肝疫苗和乙肝免疫球蛋白(HBIG)，已在《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》中被建議。器官移植后乙肝病毒感染是影響手術成功率的主要因素。高劑量的HBIG抑制肝臟移植后HBV再感染率的成功率達60%至85%。臨床研究表明，圍產期的母嬰傳播率與母體病毒載量高度相關，肝臟移植后HBV再感染的風險也與病毒載量直接相關。HBIG的使用可能降低病毒的載量。
[0007]由于HBIG的生產和臨床應用分別存在著血源稀缺和血源性傳播疾病感染等隱憂，重組型人抗乙肝單抗(mAb)已受到了醫藥產業界的關注。值得注意的是，雖然治療性單抗藥物(mAbs)在過去的20年里已悄然成為推動生物醫藥產業發展的主力，但是單抗技術在感染性疾病領域的應用相對滯后，目前只有一個抗-呼吸道合胞病毒的單抗藥物用于臨床。Shlomo Dagan等人在2001年報導了兩個抗HBV人單抗的聯合用藥的一期臨床試驗結果后，有關抗HBV單抗的研究進展緩慢，其中的一個重要原因，就是缺乏評估重組人抗乙肝單抗(HlAb)中和病毒能力的評估系統。
[0008]與HIV和HCV不同，HBV至今未建立可靠的細胞感染模型和動物保護模型。多年以來，人原代肝細胞是研究HBV病毒感染性唯一的一種細胞。但是，人原代肝細胞很難培養，不能在體外繁殖并且需要特殊的生長因子來維持其原代的分化狀態。即使在培養過程中加入二甲基亞砜(DMSO)和聚乙二醇(PEG)，也只能有限的改善HBV病毒的感染力感染細胞以擴增病毒的能力。再加上來源困難等其它問題，人原代肝細胞很難被應用到以細胞為基礎的體外中和實驗中。人肝癌細胞系(HepG2)細胞在培養中加入二甲基亞砜(DMSO)和5-aza_2'-脫氧胞啶后能探測到病毒抗原的存在，可是，這個結果的重復性差。從原發性肝癌和慢性HCV共感染的一位女性病人中分離出的IfepaRG細胞在感染前先通過二甲基亞砜(DMSO)和皮質醇(hydrocortisone)的前處理達到了成功感染HBV的目的,但這個細胞系不是很穩定且處理過程繁瑣。而且，成功建立HBV感染的人細胞系只能產生病毒顆粒，不能用于體外病毒中和實驗。
[0009]樹駒的原代肝細胞被發現具有感染人HBV的能力，并且感染后能探測到乙肝表面抗原和乙肝e抗原的分泌的能力。有些實驗室正用樹駒的原代肝細胞作為多肽抗體的評估。但是，只有原代分離的樹駒肝細胞具有感染和復制病毒能力。時效性短，來源復雜，可重復率低，也限制了它應用到體外中和病毒實驗中。
[0010]利用抗體工程技術可以設計、構建、表達和生產具有高度特異性的抗病毒單克隆抗體。如何檢測和判定單抗的抗感染能力，去偽存真，是將單抗成功導入臨床應用的關鍵。雖然細胞感染模型和動物保護模型已成功應用于部分病毒，如Hiv和HCV等的研究，但是，受體外細胞感染系統培養和感染條件及動物模型的異種性等因素的限制，細胞感染模型和動物保護模型的實際應用效率和價值尚待觀察。此外，一些具高度種屬，組織和細胞特異性的病毒感染，如HBV感染，以及一些新發和突發性的感染病毒，至今還沒有相應的細胞感染和動物保護模型。因此，醫療和制藥界急需一個快速，高效和通用的檢測系統，作為現有方法和手段的補充。

【發明內容】

[0011]本發明的目的是提供一種在快速有效的測定抗感染分子抗病毒能力的方法。
[0012]本發明的另一個目的是利用上述檢測方法篩選具有抗HBV感染的小分子化合物、蛋白或者核酸。
[0013]本發明要解決的問題是建立一個快速有效的檢測系統，以界定抗HBV單抗和其它抗病毒分子和制劑的抗感染能力。
[0014]臨床研究顯示，HBV被動免疫和HBIG主動免疫都可以有效的控制HBV的感染率，提示雖然HBV病毒感染的靶細胞為肝細胞，血液卻是抗HBV感染的主要屏障。此外，業界都清楚，無論是細胞感染模型、動物保護模型還是臨床感染，病毒的感染率都與病毒的載量相關。因此本發明假設，受試分子在血液中調控病毒載量的能力，與其抗感染能力相關。并在此基礎上，利用沉降性病毒復合物技術，建立了一個新的抗感染檢測系統。
[0015]聞玉梅等利用沉降性抗原抗體復合物技術，設計和生產了具有免疫再生能力的治療性疫苗，并應用于持續性乙型肝炎的基礎研究和臨床治療，該技術已獲得國內外專利。沉降性病原體復合物是對沉降性抗原/抗體復合物技術的延伸。病原體復合物是包含病原體以及表面粘聯分子的多聚體。
[0016]沉降性病原體復合物技術的新穎性是利用不同的病毒復合物在血樣中的不同沉降條件，以及感染性病毒顆粒的分子特點，檢測受試樣品從血樣中清除病毒的能力。病毒與單抗和其它抗病毒分子和制劑可以借助靜電力、氫鍵、范德華力等次級鍵可逆性結合而形成的多分子復合物。
[0017]本發明提供了一種檢測和評價抗病毒感染活性的方法，通過檢測受試分子在血清中誘導產生沉降性病原體復合物的能力，檢測分子的抗病毒和抗感染能力。
[0018]該方法依次包括下列步驟:
[0019](I)取離體血液樣本，分離獲得病原體血清樣本；
[0020](2)將病原體血清樣 本與試劑A和試劑B混合后，加入受試分子；
[0021](3)步驟(2)獲得的混合物在4-37攝氏度靜置0.5-15小時，以1，000-12，000轉/分的速度離心30分鐘；
[0022](4)離心后的混合物取上清分離病原體核酸后，測定病原體核酸量。
[0023]所述的病原體是病毒，例如在實施例中針對的是HBV病毒。
[0024]步驟(3)所述的離心的速度，較好的是10，000-12，000轉/分。
[0025]用熒光實時PCR定量測定病原體核酸量。
[0026]所述的沉降性病原體復合物包括病原體和表面粘聯分子的多聚體。其中，病原體可以是病毒，例如在實施例中針對的是HBV病毒。
[0027]本發明中涉及一種沉降性病原體復合物，該沉降性病原體復合物包括病原體和表面粘聯分子的多聚體。所述的病原體是病毒。
[0028]利用該方法檢測受試樣品從血樣中清除病毒的過程如下。含病原體血清樣本與檢測價抗病毒感染活性的試劑混合后，加入受試分子。混合物在特定溫度中靜置后，離心。取上清分離病原體核酸后，測定病原體核酸量。
[0029]樣品在特定條件下病毒的清除率的計算方法是:
[0030]病毒的清除率=(對照組病毒載量(Xe)-樣品組病毒載量(Xt)) /對照組病毒載量(Xe)。
[0031 ] 上述方法中，可以將混合物置于在離心試管中。
[0032]靜置的時間是0.5-15小時，靜置的特定溫度的范圍是4-37度(攝氏度)。[0033]靜置后的離心速度的范圍是1，000-12，000轉/分，較好的5，000-10，000轉/分。尚心時間可以是20-60分鐘。例如米用30分鐘。
[0034]測定病原體核酸量可以使用熒光實時PCR定量測定法。
[0035]含病原體血清樣本與檢測價抗病毒感染活性的試劑可以按比例混合。混合比例為1:1000-10:1，體積比。
[0036]其中，檢測抗病毒感染活性的試劑包括試劑A和試劑B。所述的試劑A是表面粘聯分子的多聚體。
[0037]利用上述檢測和評價抗病毒感染活性的方法可以篩選并界定具抗感染能力的受測分子(受試分子)。所述的受測分子是抗HBV的多克隆抗體或者單克隆抗體。
[0038]已知病毒可以通過物理的、化學的方法，分離和純化。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于:密度梯度離心、PEG沉淀等。與超離心法相比，本發明無需超離心機等儀器和設備，操作過程簡單易行；與PEG沉淀法相比，本方法具病毒特異性沉降等特點，有臨床實用性。
[0039]酶聯免疫吸附法(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssays, ELISA)是常用的免疫檢測手段，臨床上用于檢測抗乙肝病毒表面抗體，抗乙肝病毒衣殼抗體等。與ELISA相比，本發明所檢測的病毒和抗感染物質之間的相互作用發生在液相的血清中，沒有受到器皿和其它粒子表面分子的影響，具有生理學和病理學意義。
[0040]利用本發明的方法檢測了 HBIG，人抗HBV單抗BC1，人IgG，人白蛋白，和其它動物IgG清除病人血清中HBV病毒的能力。結果顯示，在同樣蛋白濃度條件下(1-50微克/毫升)，HBIG和人抗HBV單抗的病毒 清除率在70%以上，與人IgG，人白蛋白和異源IgG比較，HBIG和人抗HBV單抗具特異性清除HBV的能力。
[0041]本發明利用沉降性病毒復合物技術，建立了一種檢測和評估分子抗病毒能力的新方法。利用該方法可以快速檢測抗體和其它抗感染藥物清除病毒和控制病毒感染的能力。本方法操作過程簡單，結果重復性好，是對現有抗病毒藥物功能性檢測和評估方法的補充，該方法的建立為目前還沒有有效的細胞和動物感染模型病毒(如HBV)的藥物研發，提供了一種新的選擇。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0042]圖1:HBV單抗與HBIG的病毒清除能力。
[0043]圖2:沉降相關性實驗。
[0044]圖3:人HBV單抗的特異性。
【具體實施方式】
[0045]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。除非另有描述，本發明的實施將采用分子生物學、微生物學、重組DNA和免疫學的常規技術，這些均是本領域技術人員所知的。這些技術在下列文獻中有完整的描述:例如，Sambrook《分子克隆實驗指南》第2版(1989) ； ((DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover編輯1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait編輯，1984)；《核酸雜交》(B.D.Hames和S.J.Higgins編輯.1984);《蛋白質純化:原理和實踐》第2版(Springer-Verlag,N.Y.),以及《實驗免疫學手冊》1-1V卷(D.C.Weir和C.C.Blackwell編輯1986)，或者，可按照試劑生產商所提供的說明書進行。
[0046]實施例1:HBV單抗與HBIG的抗感染性能力
[0047]利用本發明建立的檢測方法，分別檢測HBV單抗與HBIG的抗病毒活性。HBIG為由中生集團生產的人抗乙肝病毒球蛋白，人源化抗乙肝病毒單克隆抗體由中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所提供。
[0048]具體檢測步驟是:
[0049](1)取離體血液樣本，分離獲得病原體血清樣本；
[0050](2)將病原體血清樣本與試劑A和試劑B按1:4.5:4.5混合后，加入0.5%Volume受試分子(分為HBV單抗組和HBIG組)；
[0051](3)室溫靜置3小時，以10，000轉/分的速度離心30分鐘；
[0052](4)離心后的混合物取上清分離病原體核酸后，熒光實時PCR定量測定病原體核酸量。樣品在特定條件下病毒的清除率的計算方法是:
[0053]100%-〔對照組病毒載量(Xe)-樣品組病毒載量(Xt) ) /對照組病毒載量(Xe)。
[0054]結果顯示，HBV單抗的病毒清除率為87%，HBIG病毒清除率為96.8%。HBIG和抗HBV單抗同具抗病毒能力，兩者間無顯著性差異，HBV單抗與HBIG具生物等效性。
[0055]實施例2 =HBIG和抗HBV單抗的抗病毒能力與病毒復合物的形成和沉降相關
[0056]圖2為沉降特異性實驗的結果。
[0057]按照實施例1的方法檢測病毒DNA，只是HBV單抗和HBIG處理血清樣本后不做沉降處理，檢測病毒DNA。
[0058]實驗結果表明，不做沉降處理組的HBV單抗BCl和HBIG不能從血清中清除病毒。沉降性病毒復合體的形成和檢測為檢測的必要條件。
[0059]實施例3人HBV單抗BCl的特異性實驗
[0060]圖3為人HBV單抗BCl的特異性實驗。
[0061]按照實施例1的方法檢測病毒DNA。
[0062]結果顯示，HBV單抗中和病毒的能力為93% (P=0.0001)，與HBIG中和病毒的能力沒有顯著性差異。與人血清白蛋對照相比，HBIG和抗HBV單抗BCl的病毒清除能力具特異性。
【權利要求】
1.一種檢測和評價抗病毒感染活性的方法，其特征在于，通過檢測受試分子在血清中誘導產生沉降性病原體復合物的能力，檢測分子的抗病毒和抗感染能力；所述的病原體是病毒。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該方法依次包括下列步驟: (1)取離體血液樣本，分離獲得病原體血清樣本； (2)將病原體血清樣本與檢測試劑混合后，加入受試分子； (3)步驟(2)獲得的混合物在4-37攝氏度靜置0.5-15小時，以1，000-12，000轉/分的速度離心30分鐘； (4)離心后的混合物取上清分離病原體核酸后，測定病原體核酸量。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的分離病原體核酸的方法是密度梯度離心或者PEG沉淀。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的沉降性病原體復合物包括病原體和表面粘聯分子的多聚體。
5.一種抗病毒感染活性的檢測試劑，其特征在于，所述的檢測試劑包括試劑A和試劑B0
6.如權利要求5所述的抗病毒感染活性的檢測試劑，其特征在于，所述的試劑A是表面粘聯分子的多聚體。
7.一種沉降性病原體復合物,其特征在于,該沉降性病原體復合物包括病原體和表面粘聯分子的多聚體。
8.如權利要求7所述的沉降性病原體復合物，其特征在于，所述的病原體是病毒。
9.權利要求1所述的方法的應用，其特征在于，利用該方法篩選或者界定具有抗HBV感染的小分子化合物、蛋白或者核酸。
10.如權利要求9所述的應用，其特征是，利用該方法篩選或者界定抗HBV的多克隆抗體或者單克隆抗體。
【文檔編號】C12Q1/68GK103468826SQ201210185329
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2012年6月6日 優先權日:2012年6月6日
【發明者】陳力, 聞玉梅, 王蕾, 謝幼華, 梁米芳 申請人:復旦大學