專利名稱：獲得用于生產維生素k2的有益乳酸菌變種的方法及在食品制造中的應用的制作方法
獲得用于生產維生素K2的有益乳酸菌變種的方法及在食品制造中的應用本申請是原申請的申請日為2007年10月4日，申請號為200780037068. 5，發明名稱為《獲得用于生產維生素K2的有益乳酸菌變種的方法及在食品制造中的應用》的中國專利申請的分案申請。本發明涉及富含維生素和/或痕量元素營養食品的領域，以便改善人類的營養攝入量及在質和量上的營養平衡。本發明特別涉及使食物富含維生素K的方法。更具體地，本發明涉及獲得乳酸菌菌株變種的方法，所述乳酸菌變種在標準發酵條件下生產的維生素K2是相同條件下培養的初始乳酸菌菌株獲得的維生素K2的至少約
I.2 倍。本發明還涉及一種食品的制造方法，尤其是富含維生素K2的發酵產品和/或鮮奶產品的制造方法，以及由此獲得的食品。維生素K是一種脂溶性維生素，它呈現兩種自然形態維生素Kl (或葉綠醌)和維生素K2 (或甲基萘醌)。維生素Kl由植物合成。人們主要在綠色蔬菜(葉狀蔬菜)和豆油中獲得它。維生素Kl直接參與凝血過程。維生素K2由腸道菌群的細菌生產。它也微量存在于某些發酵食品(奶酪、基于發酵黃豆的亞洲典型產品如味噌和日本水豆豉等等)中。多數細菌有能力合成維生素K2。因此，除了腸道菌群的細菌以及，特別是大腸埃希氏菌、枯草芽孢桿菌和類桿菌屬的種，還可以列舉某些乳酸菌的種和亞種，如乳酸乳球菌乳亞種(lactococcus lactis spp. lactis)、乳酸乳球菌乳脂亞種(lactococcus lactis spp. cremoris)、乳明串珠菌、腸膜明串珠菌和丙酸桿菌的種。由所述細菌合成的維生素K2的含量通常在29至90微克/升發酵乳之間變化(Morishita等人，1999)。需要強調的是對維生素K2產量的測量通常從沉淀細胞的真空冷凍干燥制品實現，并且這些測量結果隨不同測試菌株在生產水平上呈現出很大的不均勻性，可能在一倍至三倍多之間變化(Morishita等人，1999 ;Parker等人,2003)。關于生物活動，維生素K2因其在軟組織鈣化上的作用而尤其被熟知。維生素K最初因為它在凝血過程中的重要作用而被描述。因此，嚴重缺乏維生素K會導致溢血，凝血時間異常延長，以及淤血。很長時間以來人們認為嚴重缺乏維生素K在成年中極為少見，對維生素K的需求可以靠多樣平衡的膳食以及體內腸細菌的生產來大大滿足。在這一方面，有嚴重缺乏可能的人主要是-新生兒，它們在出生時腸內沒有能產生維生素K的細菌； -肝臟、膽或腸道功能紊亂者(肝病患者、先天性粘液稠厚癥患者、結腸炎患者、痢疾患者等)；以及-長期服用抗生素的人。近期，人們發現維生素K對人類健康的影響不僅限于其在凝血機制中的作用。事實上，自從80年代起，維生素K也因其在骨代謝中的作用而聞名(Hart等人，1984 ；Hart等人，1985)。這種維生素在調節骨形成中的調節骨鈣蛋白活動的酶化學反應中作輔助因子(Hauschka PV等人，1989 ;Ducy P等人，1996)。它的作用更精確地說包括調節骨鈣蛋白的羧化，骨鈣蛋白是調節成骨過程的關鍵蛋白。如果缺乏維生素K，這一反應無法進行，會引發血液中脫羧骨鈣蛋白對羧化骨鈣蛋白比率的升高(Vaananen等人，1999)。西方國家人口統計學的發展表現為人口的逐漸老齡化，結果導致變性病理流行病的增長，尤其是骨質疏松。在這一方面，骨質疏松從此被認為是公眾健康的重大問題。在90年代建立的人口統計學估計敲響了警鐘，預計在未來的50年內這種病的發生率會顯著增長，尤其在老年人當中。所以采取措施預防這種疾病成為當務之急，事先稀少地檢查出并隨后處理。
從此人們認為預防骨質疏松應該從幼年開始，經過最佳的骨質增長階段，并在一生中繼續維護骨量(bone mass)o眾所周知營養因素在骨儲備(bone reverse)的發展和維護中起重要作用。直到現在，設想和建議用來預防骨質疏松的營養策略主要集中在兩個重要因素上，它們是鈣質和維生素D。然而，人們現在知道其他營養因素可以有顯著的益處。因其在成骨過程中的重要作用，維生素K在文獻中越來越成為維持人類一生中骨健康的有前途的途徑。建議的人類含維生素K的營養供給(I. 5微克/天/千克體重)是只考慮到維生素K凝血作用而確定的。然而，近期研究提出，如果同時考慮到維生素K在骨代謝中的作用，這一建議的營養供給最終估計不足(Ronden等人，1998)。雖然維生素K的需求仍然不被了解，但不足的供給導致成人骨量低并增大骨折的危險(Hart 等人，1985 ；Knapen 等人，1989 ；Szulc 等人，1993 ；Booth 等人,2000)。此外，對絕經期女性治療措施的研究指出維生素K可以在這一目標減少骨質虧損(Shiraki等人，2000 ;Braam等人，2003)。最終，對動物的研究提出它在骨量增長的高峰過程中起到促進作用，協同維生素D會起到更好的效果。然而，明確地聯系維生素K和骨質增長的研究目前只在動物中進行過。另外，最近研究為維生素K在骨代謝和，尤其在骨量的組成和維持上的作用提供了額外的有利證據(Booth 等人,2000 ；Shiraki 等人,2000 ；Braam 等人,2003 ；Hirano 和Ishi，2002)。與成人情況不同的是，目前沒有可利用的數據證明維生素K對兒童的骨代謝有促進的作用。人們只知道為了最大量儲備骨質并保護成人不得骨質疏松，在增長期優化骨量十分重要。不管怎樣，如今全部數據表明改善食品中維生素K的含量是使人構造和維護優良骨結構(bone structure)的有利的和有前途的途徑。在這種情況下，在食品市場上已經存在富含維生素K的工業產品。特別可以列舉某些含有乳酸菌的乳制品，如“Petits Gervais aux Fruits”在法國被Demanderesse出售。然而可以注意到，一方面，這些產品的維生素K含量通常依賴于使用的發酵類型，另一方面，傳統在乳制品中使用的乳球菌屬的菌株不能生產足量的維生素K來真正滿足人口的需求，甚至不足以減緩可能出現的維生素K的缺乏。因此目前需要一種食品生產技術，特別是生產富含維生素K滿足需求的發酵制品和/或鮮乳制品，如有必要，能夠彌補維生素K的缺陷，無論是在兒童和青少年還是在成年人和老年人中。在下文中，術語“維生素K2”和“維生素K”不加區別，指代維生素K2。本發明目的是滿足這一需要提出使用乳酸菌菌株新變種制備食品，特別是發酵制品和/或鮮乳制品，生產的維生素K遠遠多于衍生它們的最初菌株。此外，在他們工作過程中，發明者校準了乳酸菌的實現條件，相對于傳統生產條件明顯促進了維生素K的生產。因此，在食品制備的后期，如發酵制品和/或鮮乳制品的制備，增加維生素K2的含量，可以在發明者認為能特別促進維生素K2生產的實現條件下有利地使用“過剩生產者”這一維生素K的變種，它是本發明的目標也是2006年10月4日的法國專利申請No. 06/08690的發明目的。術語“變種”在這里包括
-自然變種，也就是說在選擇壓力作用下從一種參照乳酸菌菌株自發獲得的變種；自然變種不經過任何人工基因處理，而是主要從參照菌株通過突變和選擇而獲得；以及-突變株，在其染色體組中有一個或多個由基因工程技術誘發的突變，也就是說靠應用在參照菌株上的誘導突變技術，特別是借助載體的轉基因技術。可以注意到，在某些國家(特別是在歐洲)，食品工業在開發含有微生物特別是活體微生物的用于人類和/或動物食品的產品時應采取預防措施。實際上，轉基因有機體(這里是微生物)(轉基因有機體或突變體)會在消費者中引起畏懼和擔憂。這種對轉基因有機體不利的負面形象在某些國家表現為公眾傾向于“抵制”含有轉基因有機體的食品。另外，消費者總是苛求推薦給他們的食品內容以及產品包含的各成分來源的透明度，在這一情況下，工業界會被迫推薦近乎專一的，甚至是專一的無轉基因有機體的產品。在本發明所處的情況下，專一地利用自然菌株或來自自然菌株的變種來生產源于工業并含有微生物的食品是很有優勢的。根據第一方面，本發明涉及獲得某乳酸菌菌株自然變種的方法，所述變種在標準發酵條件下可以比在相同條件下培養的所述乳酸菌菌株生產更多的維生素K2，倍數至少等于I. 2，所述方法至少包括a)標準發酵條件下在選擇性介質上培養所述乳酸菌菌株，所述介質誘發細胞內氧化還原狀態的改變；以及b)將與相同條件下培養的乳酸菌菌株相比，生產至少I. 2倍的維生素K2的變種選擇出來。所述“變種”在本發明的意義下是能夠比衍生它們的菌株生產更多維生素K2的乳酸菌菌株。更精確地，本發明的變種能夠生產的維生素K2是初始菌株生產的維生素K2的至少I. 2倍。更優的是，根據本發明的變種生產維生素K2的產量比相同標準發酵條件下培養的初始乳酸菌菌株的產量更多，倍數至少約等于I. 5。這個倍數還可以更好，更優選約等于I. 7，更優選約等于I. 8，更優選約等于I. 9。這個倍數值更優的是至少約等于2、2. 2,2. 4、2. 5、2. 7、2. 8、2. 9、3。“參照”或“初始”的乳酸菌菌株是衍生了本發明的變種的菌株。這些菌株可以是自然菌株或者它們本身就是某個變種，也就是說自然變種或突變株。在本發明的范圍內，“實驗室條件”是完全標準的發酵條件并被所屬領域技術人員所熟知。因此，詞組“實驗室條件”和“標準發酵條件”在這里完全是同意詞。在本發明意義下最優的“實驗室條件”如下在商用介質M17 (DifcoTM M17)或等同的介質上預先培養菌株。接下來的培養中借助預培養實現1%的接種。培養溫度為大約30° C。要記住實驗室條件可以由本領域技術人員根據其總體的知識按需要來改變，有可能在常規的校準實驗之后。培養基是適于培養乳酸菌菌株特別是乳球菌屬的某些種的菌株的介質。根據一種最佳的實現方式，乳酸菌菌株從乳球菌屬(Lactococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、腸球菌屬(Enterococcus)和丙酸桿菌屬(Propionibacterium)中選擇。它特別是從乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)、假腸膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、葡聚糖明串珠菌、屎腸球菌(Enterococcus faecium)、丙酸桿菌的種。
優選地，如下文所述，在根據本發明的方法中，要實現一個從含有桿菌肽或氧化劑如過氧化物的培養基中選擇的選擇性介質。如此實現的選擇性介質可以誘發細胞內氧化還原狀態的變化。有利的是，這一變化和從表I列出的I 27號基因中選擇的至少一種基因的表達在所述變種中相對于衍生它的乳酸菌菌株中的變化相關聯表I
權利要求
1.乳酸菌菌株自然變種，該自然變種為乳酸乳球菌乳脂亞種(LactococcusIactissubsp. cremoris) CNCM 1-3558,所述乳酸菌菌株自然變種在標準發酵條件下可以比在相同條件下培養的所述乳酸菌菌株生產更多的維生素K2，倍數至少等于I. 2。
2.權利要求I記載的乳酸菌菌株自然變種的生物學純培養物。
3.包括權利要求I記載的變種的乳酸酵素。
4.制造富含維生素K2食品的方法，其至少包括 a)在所述產品的中間制備階段，使用權利要求I記載的變種和/或者權利要求3記載的酵素；以及 b)獲得所述富含維生素K2的產品。
5.根據權利要求4記載的方法獲得的富含維生素K2的食品。
6.根據權利要求5記載的食品，其特征在于，它是一種發酵產品和/或鮮乳制品。
7.權利要求I記載的變種和/或者權利要求3記載的酵素的用途，其用于制備富含維生素K2的食品。
8.根據權利要求7記載的用途，其特征在于，所述富含維生素K2的食品使食用者的骨骼更強壯。
全文摘要
本發明涉及獲得用于生產維生素K2的有益乳酸菌變種的方法及在食品制造中的應用，具體涉及一種乳酸菌菌株自然變種，該自然變種為乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus lactis subsp.cremoris)CNCM I-3558，所述乳酸菌菌株自然變種在標準發酵條件下可以比在相同條件下培養的所述乳酸菌菌株生產更多的維生素K2，倍數至少等于1.2。
文檔編號C12R1/01GK102732457SQ20121018741
公開日2012年10月17日 申請日期2007年10月4日 優先權日2006年10月4日
發明者佩吉·加羅, 克洛艾·貝亞爾, 加埃勒·凱雷, 吉約姆·戈貝爾, 熱拉爾·利波夫斯基, 納塔利亞·博基爾, 讓-米歇爾·福里 申請人:達能日爾維公司