專利名稱：靶向raf1抗乙腦病毒寡核苷酸的結構和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程藥物領域，具體地說是一種靶向RAFl蛋白激酶(RAF1，c-Raf, v-raf-leukemia viral oncogene I)治療流行性乙型腦炎病毒(簡秤乙腦病毒，JEV)感染的反義寡核苷酸(ASODN,antisense oligodexynucleotide)的序列、結構及其治療藥物。
背景技術：
乙腦病毒在分類上屬于黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus)成員。流行性乙型腦炎(簡稱乙腦)國際上稱為日本腦炎(Japanese encephalitis)。本病是由日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus)經蚊蟲媒介盯咬傳播而引起的一種中樞神·經系統感染的急性傳染病，也是一種人獸共患的自然疫源性疾病。臨床上以高熱、意識障礙、抽搐、呼吸衰竭及腦膜刺激征為特征。病死率較高，而且后遺癥嚴重，本病對人類健康危害較大。乙腦主要在亞洲以及東南亞熱帶和亞熱帶地區的一些國家流行，我國除少數省，自治區外，大部分地區都有乙腦流行。據統計，乙型腦炎病毒每年至少造成至少50000例臨床病例，其中多數為十歲以下兒童，導致約10000人死亡，有15000人左右留有嚴重的永久性神經系統損傷。由于乙腦是一種人畜共患的自然疫源性疾病，在一般情況下乙腦病毒在蚊-豬-蚊中循環，一旦自然條件適宜，人群免疫力下降，就有可能發生人間乙腦流行或爆發，因此必須加強乙腦的預防與控制。但是目前臨床上還沒有針對乙腦的特異性治療方法和特效的治療藥物，接種疫苗仍是唯一最重要的控制措施。目前用于免疫預防的滅活疫苗主要有鼠腦純化滅活疫苗和地鼠腎細胞滅活疫苗，它們已廣泛使用多年，對乙腦發病率的下降起到了非常重要的，但是副反應大，價格較高。活疫苗和減毒活疫苗的作用比滅活更有優勢，但是國際上對該疫苗安全性和生產過程質量控制方面還沒有認可，因此其安全性等方面還需積累更多資料。因此，研究特異性高、毒副作用小的新型抗乙腦病毒感染的藥物對治療與預防病毒感染及其相關性疾病具有重要現實意義。病毒是一種嚴格的細胞內寄生物。病毒感染致病涉及病毒與機體兩個復雜生物系統及其二者間的相互作用。一方面，宿主表現出對病毒感染的主動限制；另一方面，病毒會主動地通過對宿主細胞的生物大分子進行修飾，以使宿主細胞為它的復制、轉錄等提供必需的細胞機器。在短時間內不影響細胞存活且能為宿主細胞所能容忍的前提下，增強抗病毒信號或者阻斷病毒復制所需的宿主細胞因子可以有效的抗病毒以及降低耐藥毒株產生的頻率。經研究已經證明，RAFl蛋白激酶作為重要的轉錄因子參與了細胞增殖與分化、凋亡、周期調控和細胞能量代謝等多個生物過程，而且該基因的抑制物有抗腫瘤作用已經得到廣泛的研究。根據本發明，與人RAFl基因的mRNA互補結合的寡核苷酸能有效的抑制乙腦病毒并保護細胞使其免于乙腦病毒所致細胞病變，針對RAFl的反義寡核苷酸能特異性抑制乙腦病毒的感染復制。因此，設想其可能具有抗乙腦病毒感染的作用，從而對乙腦病毒感染相關疾病的治療起到良好的效果。有可能成為治療及預防乙腦病毒感染相關疾病的新型生物工程藥物。核酸藥物是一類全新的基因靶向創新藥物，長期以來一直是國際研究的熱點，特別是近幾年小核酸的發現進一步將核酸藥物的研究推向一個前所未有的發展高潮。反義寡核苷酸是一類經過人工合成的寡核苷酸片段，長度多為15 30個核苷酸。通過堿基互補的原理，干擾相關基因的轉錄和翻譯，或者整個基因組的復制，其優點在于其理論上的高度靶特異性，是一種理想的具有精確選擇性的基因靶向治療藥物。由于反義寡核苷酸作用的高度特異性，因此被認為是極具潛力的抗腫瘤和抗病毒新藥。國外已有一些著名制藥企業已將反義藥物作為其新藥研究開發的重點方向之一
發明內容
本發明的目的在于提供一種靶向RAFl阻斷乙腦病毒復制、抑制這些病毒致病的寡核苷酸序列、結構及其藥物。本研究的內容是針對RAFlmRNA (NM_002880)，利用網上服務器Soligo設計了 20條針對RAFl的反義寡核苷酸，從設計的這20個堿基長度的反義寡核苷酸序列中進行初步篩選。結果顯示RAF1-19和RAFl-IO抑制病毒所致細胞病變作用最佳。在BHK21細胞系中以RAF1-19為代表進一步評價了抑制乙腦病毒致CPE及抑制乙腦病毒復制的特異性、劑量依賴性。表I反義寡核苷酸的分子設計
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1RAFl-I反義GTCTTCC AAGCTCCCTGTAT
2RAFI-2反義GCTGATAGCCAAACTGCTGA
3RAFI-3反義AAGTCTGACATCGAAATCCA
4RAFI-4反義GTCTG AC ATCGA A ATCC ATT
5RAFI-5反義GCATCCTCAATCATCCTGCT
6RAFI-6反義AGGGCTGAAGGTGAGGCTGA
7RAFI-7反義CCACG AGGCCTAATTTTGTT
8RAFI-8反義GACATGCAGGTGTTTGTAGA
權利要求
1.與人RAFlmRNA互補的寡核苷酸，分布在5’非編碼區、編碼區和3’非編碼區，其長度是10_30個喊基。
2.根據權利要求I所述寡核苷酸，其特征是所述的寡核苷酸序列結構選自下列之一1)GTCTTC CAA GCT CCC TGTAT ；2)GCTGATAGC CAAACT GCT GA ；3)AAGTCT GAC ATC GAAATC CA ；4)GTCTGA CAT CGAAAT CCA TT ；5)GCATCC TC A ATC ATC CTG CT ；6)AGGGCT GAA GGT GAG GCT GA ；7)CCACGA GGC CTA ATT TTG TT ；8)GACATG CAG GTG TTT GTA GA ；9)CGGGCA ATG TCA ATT AGC TG ；10)TGGAAG ACA GGA TCT GGG GA ；11)CGCTGA TAG CCA AAC TGC TG ；12)GGAGAA GTC TGA ACA CTG CA ；13)CACAAG TCT GAC ATC GAA AT ；14)CAGGGT GGT GCT GAC CAT GT ；15)GCTGAA GGT GAG GCT GAT TC ；16)GGGCTG AAG GTG AGG CTG AT ；17)ACCTTT AGG ATC TTT ACT GC ；18)GCCAGG TTG TCC TTT GTC AT ；19)GGGCAA TGT CAA TTA GCT GG ；20)AAATAG TCC ATT CCC TGA GC。
3.根據權利要求2所述的寡核苷酸，其特征是所述的寡核苷酸序列結構選自下列之1)TGGAAG ACA GGA TCT GGG GA ；2)GGAGAA GTC TGA ACA CTG CA ；3)CAGGGT GGT GCT GAC CAT GT ；4)GGGCTG AAG GTG AGG CTG AT ；5)GGGCAA TGT CAA TTA GCT GG。
4.根據權利要求3所述的寡核苷酸，其特征是所述的寡核苷酸序列結構如下1)TGGAAG ACA GGA TCT GGG GA ；2)GGGCAA TGT CAA TTA GCT GG。
5.根據權利要求4所述的寡核苷酸，其特征是所述的寡核苷酸序列結構如下I)GGG CAA TGT CAA TTA GCT GG。
6.根據權利要5所述的寡核苷酸，其特征為所述的寡核苷酸包含了與GGGCM TGT CAATTA GCTGG具有60%及其以上連續相同序列的任何長度寡核苷酸。
7.根據權利要求1-6所述寡核苷酸，其特征是該寡核苷酸經過不同化學修飾。
8.根據權利要求7所述寡核苷酸，其化學修飾為硫代修飾。
9.權利要求1-8中所述的任一寡核苷酸或其組合在制備治療和預防乙腦病毒感染及其相關性疾病的藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種反義寡核苷酸藥物的結構和用途。具體說是發現靶向RAF1蛋白激酶(RAF1，c-Raf，v-raf-leukemia viral oncogene 1)的反義寡核苷酸的結構以及這些反義寡核苷酸在制備治療乙腦病毒感染及其相關性疾病的藥物中的用途。
文檔編號C12N15/113GK102776188SQ201210187109
公開日2012年11月14日 申請日期2012年6月8日 優先權日2012年6月8日
發明者伯曉晨, 何麗娜, 張莉, 李康, 楊靜, 王升啟, 韓明明 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所