專利名稱：檢測木薯細菌性萎蔫病菌的環介導恒溫擴增引物及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬生物檢測技術領域，具體涉及ー種檢測木薯細菌性萎蔫病菌的環介導恒溫擴增引物及試劑盒。
背景技術：
木薯細菌性萎蔫病菌導致的木薯細菌性萎蔫病是木薯上最為嚴重的病害，是木薯繁育的ー個重要限制因子。該病具有高風險、分布廣、可種傳的特點，是國際上的ー種重要的植物檢疫對象，在我國新出臺的《中華人民共和國進境植物檢疫危險性病、蟲、雜草名錄》被列為檢疫性病害。木薯感染此病后可造成木薯產量下降12%_100%，該病害在南非被首次報道，目前在除歐洲以外的全世界的許多國家都有報道。1973年該細菌病害在Nigeria發生時當年就造成木薯產量損失75%，并導致了嚴重的恐慌。木薯細菌性萎蔫病菌主要為害部位是木薯的葉片、莖部。屬系統性分布為害整株病害。葉片染病形成濕色角斑，濕度大時其上流膠，初為白色粘液，后變為黃褐色，致植株萎蔫、流膠。莖部染病常致莖凹陷，分泌出大量膠質物，加速葉片枯萎。塊根染病維管束變為黃褐色，根系及維管束出現干腐，嚴重的全株死亡。病菌在老熟莖桿的皮部里存活，主要靠帶菌的種莖進行遠距離傳播，此外雨水、昆蟲、病土及帶菌工具也可傳播。在嚴重的木薯細菌性萎蔫病的困擾下，全世界大部分易感病地區都降低了木薯的種植面積。因此需要建立一種準確、高效、快速的木薯細菌性萎蔫病的檢測方法，為木薯繁殖材料的檢疫工作提供技術支持。但目前還沒有能夠精確的檢測出檢測木薯細菌性萎蔫病菌的相關技木。
發明內容
本發明的目的是提供檢測木薯細菌性萎蔫病菌的環介導恒溫擴增引物及試劑盒，從而能夠精確快速的對木薯細菌性萎蔫病菌進行檢測，從而彌補現有技術的不足。本發明ー個方面涉及檢測木薯細菌性萎蔫病菌的環介導恒溫擴增引物，為引物F3、引物B3、引物FIP和引物BIP，其核苷酸序列分別為SEQ ID NO 1-4 0本發明另ー個方面提供ー種木薯細菌性萎蔫病菌的恒溫擴增快速檢測試劑盒，其中包括如下的組分(I)模板預處理反應液:3· 2μΜ引物FIP，3. 2μΜ引物ΒΙΡ，0· 4μΜ引物F3，0. 4μΜ引物 Β3，800 μ M dNTP, IXThermol Buffer ；所述引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP分別如SEQ ID NO :1、2、3和4所示;(2)溶液 I :lXThermol Buffer, O. 64U/ μ L Bst DNA Polymerase,所述IXThermol Buffer 成分為20mM Tris-HCl (pH8. 8)，IOmM KCl, IOmM (NH4)2S04,2mM MgSO4,0. 01%Triton X-100，pH 8.8。、
本發明的試劑盒用于檢測植物中的木薯細菌性萎蔫病菌。本發明的試劑盒根據木薯細菌性萎蔫病菌菌株的TAL效應器蛋白質(pthBXam)保守基因序列設計引物，從而保證了檢測方法的特異性。本發明采用改進的LAMP擴增技木，該技術特異性強，具有與PCR檢測方法相似靈敏度，并且不需要昂貴的PCR儀，只需普通的水浴鍋即可，檢測方法簡單、快速，特異性強、靈敏度高，特別適用于基層植保機構及植物產品公司與相關檢測部門。
圖I:本發明的引物檢測木薯細菌性萎蔫病菌LAMP的擴增圖譜，其中I空白對照、2陽性樣品、3-6陰性對照、M DNA Marker。
具體實施例方式LAMP引物的設計主要是針對靶基因的四個不同的區域，基于靶基因3'端的以及 5'端的4個不同的位點設計4個引物。利用設計的異引物并依靠高活性鏈置換DNA聚合酶，使得鏈置換DNA合成在不停地自我循環。本發明選用TAL效應器蛋白質(pthBXam)保守基因來設計LAMP引物。申請人在長期的研究中發現TAL效應器蛋白質(pthBXam)保守基因是木薯細菌性萎蔫病菌的特異序列之一，該序列在GenBank上的登錄號是HQl 13297. I。本發明提供的木薯細菌性萎蔫病菌的恒溫擴增快速檢測試劑盒，其中包括(I)模板預處理反應液其中包括3. 2 μ M引物FIP，3. 2 μ M引物BIP，O. 4 μ M引物F3，O. 4 μ M引物 Β3，800μΜ dNTP, IXThermol Buffer，和 ddH20。引物 FIP、BIP、F3 與 B3 的終濃度比為8 8 I I ο木薯細菌性萎蔫病菌引物F3 5' -CAGAACATCCCGACGCTG-3' (SEQ ID NO 1)B3 5' -GCCCTGTGGCCGTTGA-3' (SEQ ID NO 2)FIP 5' -AGCGCGACCGCTTAAGTCAAG-GTTCCGGCTTACATCCCCA-3' (SEQ ID NO 3)BIP 5' -GGCATTGCCGGCGATCACT-TCGAGCTTCGGAAAGGACCA-3' (SEQ ID NO 4)(2)溶液 I :lXThermol Buffer, O. 64U/ μ L Bst DNA Polymerase,和 ddH20。IXThermol Buffer 反應緩沖液成分為20mM Tris_HCl(pH8. 8)，IOmM KCl, IOmM(NH4)2SO4,2mM MgSO4,0. 01%Triton X-100，和 ddH20, pH 8. 8。本發明提供的利用上述試劑盒檢測木薯細菌性萎蔫病菌的方法，包括下列步驟( I)待檢樣品或細菌DNA的提取提取待檢樣品核酸，其中提取的樣品DNA OD260/OD280在I. 6-2. O范圍內，濃度在IO-IOOng/μ L 范圍內。(2)模板預處理將裝有23 μ L模板預處理反應液的反應管加入2 μ L待檢模板DNA于94°C水浴5min后迅速放入59°C的水浴中45s ;然后94°C水浴25s和59°C水浴45s過程反復進行6個循環，產物用于LAMP模板。(3) LAMP 恒溫擴增將上述經過處理的模板預處理溶液25 μ L加入25 μ L溶液I中，63°C加熱60min，80°C IOmin,降溫至 4°C。(4)核酸凝膠電泳檢測
核酸擴增完成后，在反應管中加入6XLoading buffer (組分30mM EDTA ；36%(v/V) Glycerol ;0· 05%(w/v) Xylene Cyanol FF ；0. 05% (w/v) BromophenoI Blue),取產物 10 μ L加入2%的瓊脂糖凝膠板的樣品孔中，IOOv電壓，電泳30-40分鐘，電泳成像系統拍照。擴增結果在瓊脂糖凝膠電泳上為梯形核酸條帶，如果出現條帶可以判斷為陽性，否則為陰性。下列實施例進ー步說明本發明，但不應當作對本發明的限制。實施例I :對木薯細菌性萎蔫病菌標準樣品的檢測利用木薯細菌性萎蔫病菌環介導恒溫擴增檢測試劑盒，檢測木薯細菌性萎蔫病菌的標準樣品 (I)待檢樣品和木薯細菌性萎蔫病菌DNA的提取提取待檢樣品核酸，其中提取的樣品DNA 0D26(l/0D28(l在1.6-2. O范圍內，濃度在IO-IOOng/μ L 范圍內。(2)模板預處理將裝有23 μ L模板預處理反應液的反應管加入2 μ L待檢樣品模板DNA于94°C水浴5min后迅速放入59°C的水浴中45s ;然后94°C水浴25s和59°C水浴45s過程反復進行6個循環，產物用于LAMP模板。取2份模板預處理反應液23 μ L，分別加入2 μ L ddH20和木薯細菌性萎蔫病菌DNA，重復上述相同步驟，產物用作LAMP模板，分別作為陰性對照和陽性對照；(3) LAMP 恒溫擴增將上述經過處理的模板預處理溶液25 μ L加入25 μ L溶液I中，63°C加熱60min，80°C IOmin,降溫至 4°C。(4)核酸凝膠電泳檢測核酸擴增完成后，在反應管中加入6XLoading buffer，取產物10 μ L加入凝膠板的樣品孔中，電泳40分鐘，電泳成像系統拍照。檢測結果如圖I所示。結果表明，本發明設計的引物能夠檢測木薯細菌性萎蔫病菌；不會產生假陰性或假陽性。利用本發明的試劑盒對疑似感染了木薯細菌性萎蔫病菌的樣品進行檢測，結果為陽性。對該樣品的細菌培養檢測證實了本發明的試劑盒的可靠性。
權利要求
1.一種檢測木薯細菌性萎蔫病菌的環介導恒溫擴增引物，為引物F3、B3、FIP和BIP，其核苷酸序列分別為SEQ ID NO 1-40
2.一種木薯細菌性萎蔫病菌的恒溫擴增快速檢測試劑盒，其中包括如下的組分 (1)模板預處理反應液3.2 ii M引物FIP，3. 2 ii M引物BIP，0. 4 ii M引物F3，0. 4 ii M弓I物 B3，800iiM dNTP, IXThermol Buffer ；(2)溶液I :lXThermol Buffer, 0. 64U/ u L Bst DNA Polymerase,所述 IXThermol Buffer 成分為20mM Tris-HCl (pH8. 8), IOmM KCl, IOmM (NH4)2SO4,2mM MgSO4,0. 01%Triton X-100，pH 8.8。
3.權利要求2所述的試劑盒用于檢測植物中的木薯細菌性萎蔫病菌。
全文摘要
本發明涉及檢測木薯細菌性萎蔫病菌的環介導恒溫擴增引物及試劑盒。所述的引物的核苷酸序列分別為SEQ ID NO1-4。試劑盒內有模板預處理反應液、恒溫擴增反應液Ⅰ。檢測木薯細菌性萎蔫病菌的方法包括細菌DNA的提取、模板預處理、LAMP恒溫擴增、核酸檢測。本發明的試劑盒根據木薯細菌性萎蔫病菌菌株的TAL效應器蛋白質(pthBXam)保守基因序列設計引物，保證了檢測方法的特異性。本發明采用改進的LAMP擴增技術，該技術特異性強，具有與PCR檢測方法相似靈敏度，并且不需要昂貴的PCR儀，只需普通的水浴鍋即可，檢測方法簡單、快速，特異性強、靈敏度高，特別適用于基層植保機構及植物產品公司與相關檢測部門。
文檔編號C12Q1/68GK102676688SQ20121018981
公開日2012年9月19日 申請日期2012年6月8日 優先權日2012年6月8日
發明者倪新, 厲艷, 吳興海, 封立平, 王英超, 甘琴華, 紀瑛 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心