全氟化合物降解菌基因、其合成方法及其應用的制作方法

專利名稱：全氟化合物降解菌基因、其合成方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種全氟化合物降解菌基因、及其合成方法及應用。
背景技術：
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一、PFOA在工業上的使用
全氟有機化合物(perfluorinated compounds,PFCs)由于分子中的C-H鍵全被C-F鍵所取代，而氟元素具有較大的電負性和較小的原子半徑，使其形成的C-F鍵高度極化，鍵能極大(484千焦每摩爾)，表現出以下兩方面的特殊性質
(1)氟碳鏈既疏水又疏油和氟碳鏈之間很弱的相互作用使這類物質在水中呈現很高的表面活性，這是其他任何非氟表面活性劑所不能達到的表面活性；
(2)氟原子獨特的幾何尺寸和電負性等因素使這類物質具有很高的熱穩定性、很高的耐強酸、高濃度堿和強氧化劑等化學穩定性；
全氟辛酸(PFOA)作為一種典型的全氟化合物，由于其具有優良的熱穩定性、化學穩定性、高表面活性和疏水、疏油等性能，被大量應用于聚合物添加劑、農用化學品、表面活性齊U、合成洗滌劑、化妝品、紡織品、毛毯制造、室內裝璜、皮革制品、不粘鍋和電子工業、藥物、航空業、電鍍等諸多領域。例I: PFOA作為工業原料在金屬表面處理特別是特殊涂層處理方面有較多的應用，最為典型的是制造特富龍(美國杜邦公司注冊的氟聚合物商標名)的基本加工助劑，也是人工制造的含氟聚合酸。二、全氟化合物的毒性與環境污染
從第一個全氟化合物被生產至今的50多年里，由于全氟化合物在全球范圍內的大量使用，隨著科學技術的發展和環境科學界對其研究的日益深入，人們逐漸認識到全氟化合物具有的化學穩定性及難降解性。在環境中長期存在會導致其具有極高的生物蓄積性，大量研究證實，全氟化合物在生物體內的蓄積水平高于己知的多氯聯苯、有機氯農藥等傳統型持久性有機污染物數百倍至數千倍。并且，伴隨著全氟化合物遠距離的環境遷移行為，全氟化合物及其相關化學品廣泛存在于大氣、水體、生物體的血液及肝臟內，甚至在北極地區也檢測到了該類物質的存在。根據經合組織(0ECD)2002年編寫的危害評估所得出的結論認為全氟化合物在環境中的存在持久性，及其毒性和生物累積潛力是關系到環境和人類健康的重要問題。參見祝凌燕，林加華.全氟辛酸的污染狀況及環境行為研究進展.應飯堂態學報，2008，19(5) : 1149-1157。三、PFOA的限制規定
全氟有機化合物一直被廣泛應用于工業生產及日常生活用品中，大量研究證實全氟有機化合物給環境帶來了嚴重危害，并可在生物體內產生積累，對動植物體和人類健康產生了危害。2000至2003年間全球最大的全氟化學品生產商3M公司宣布削減并最終停產了一類含氟化學產品，2004年加拿大環境部和衛生部對全氟化合物的風險預警作出評估，一些發達國家已經開始啟動了一些相關措施和相關的法律法規限制使用全氟化合物。四、全氟化合物污染治理技術
全氟化合物(PFCs)的降解技術主要包括焚燒降解、催化降解、等離子體等技術。現對幾種常見降解技術介紹如下
4.I. I微波等離子體降解技術
HARTZ等利用微波等離子體技術降解全氟化合物，通過等離子體反應裝置，在500至2000瓦的微波發射功率下降解全氟乙烷，主要產物有二氧化碳、一氧化碳、氟氣和氟化氫，并未發現四氟化碳的產生，去除率為99. 6% JCHRIS L H，JOHN ff B. Innovative surfacewave plasma reactor technique for PFC abatement. Environ Sci Technol, 1998，32(5) :682-687.) RADOIU對影響四氟化碳降解的因素進行了研究，四氟化碳作為最穩定的有機化合物之一，在900°C時，不與銅、鎳、鎢、鑰反應，僅在碳弧溫度下緩慢分解。RADOIU利用微波等離子體技術，在微波發射功率為1900瓦時，研究發現四氟化碳的去除率為98%。(MARI LENAT. R. Studies of 2. 45 GHz microwave induced plasma abatement of CF4. Environ SciTechnol, 2003，37(17) :3985-3988.)
XIE等研究發現通過添加氧氣或水可以提高反應器內羥基自由基和氧自由基的濃度，進而提高了四氟化碳的降解率。(H0NGDUAN X，BING S，XIA0MEI Z. Abatement ofperfuorocompounds with microwave plasma in atmospheric pressure environment.Jourmal of hazardous materials, 2009 (16SJ :765-769.)
4.I. 2水等離子體降解技術
KIM等研究了水等離子體降解技術的影響因素，發現增加電流及降低氣流速率，可以提高全氟化合物(PFCs)的去除率。在輸出功率為2. 5千瓦和6毫升每分鐘的水蒸氣流速下，對四氟化碳的去除率達到99%。(DONG Y K，DONGffHA P. Decomposition ofPFCs by steam plasma at atmospheric pressure. Surface & Coatings Technology,2008 (202) : 5280-5283.)
WATANABE等利用水等離子體技術處理聚四氟乙烯，發現對聚四氟乙烯的去除率達到99. 9%，降解產物主要為二氧化碳、一氧化碳、氫氣和氟化氫。(TAKAYUKI W，TAITRA T.Water plasma generation under atmospheric pressure for HFC destruction. ThinSolid Films, 2008 (516) :4391-4396.)
4.I. 3填充床等離子體技術
填充床等離子體技術是采用介質阻擋放電的形式，將某種球形介質填充于2個放電電極之間，利用填充介質來改變反應特性，從而達到對全氟化合物有較好的去除效果。目前，利用較為廣泛的填充介質主要有銅、鋅及鋁等金屬氧化物，而且常常采用幾種金屬氧化物的混合物作為填充介質。YU等利用氧化銅、氧化鋅和三氧化二鋁作為填充介質，研究了電壓、停留時間、氧濃度、放電頻率等因素對四氟化碳降解的影響。(SHENG J Y，M00 B C. Oxidativeconversion of PFC via plasma processing with dielectric barrier discharges.Plasma Chemistry and Plasma Processing, 2001, (3):
311-327.)CHANG等通過改進填充介質而達到徹底清除四氟化碳和全氟乙烷的目的，反應產物主要為二氧化碳和極少的一氧化碳，從而有效地避免了二次污染。研究主要采用氧化銅/氧化鋅/氧化鎂/三氧化二鋁(各種成分的比例分別為64%，24%，2%，10%)復合介質作為催化齊U，對四氟化碳和全氟乙烷的去除率分別為66%，83%。(MOOBEEN C，HOWMING L. Abatementof perfluorocarbons with combined plasma catalysis in atmospheric-pressureenvironment. Catalysis Today, 2004(^^:109-115.)
SUZUKI等利用氫氧化鈣和氧化鈣作為填充介質，使得四氟化碳的降解率達到了99. 99%,(SUZUKI K，ISHIHAEA Y，SAKODA K，et al. Development of a high efficiencyPFC abatement system utilizing plasma and Ca(OH) JCaO under a decompressionatmosphere. IEEE ISSM Paper:ES-P-111, 2007.) OGATA等研究了單一填充介質二氧化鈦對三氟甲烷、一氯二氟甲烷、一氯三氟甲烷和四氟化碳混合氣體的去除效果，結果發現二氧化鈦不僅在高溫光照下起催化作用，而且在常溫的等離子體反應器內也具有催化能力。(ATSUSHI 0，HYUNH K，SHiIHRRU F，etal. Effects of catalysts and additives on fouorocarbon removal with surfacedischarge plasma. Applied Catalysis B:Environmental, 2004⑶175-180.)
4.I. 4光催化降解技術
化學降解技術除高溫燃燒和熱解等常用技術之外，光催化降解也是一種重要的有機污染物的化學降解技術。其原理是指有機污染物在光照下，通過催化劑實現降解。所以，光催化劑的活性是實現光催化降解的關鍵。通常，由于全氟有機物在紫外光區域內有吸收，所以一般采用紫外光源作為降解光源，而研究的重點在于催化劑的選擇。2003 2006年間，日本國家產業技術綜合研究院的Hori等連續報道了采用光催化方法降解全氟羧酸(PFCAs)的報道，即采用200瓦氙汞燈作為光源(主要波段220至460納米)，以雜多酸(H3PW12O4tl)作為均相催化劑，在0. 55兆帕的氧氣壓力下對全氟羧酸進行降角軍° (Hori H，Takano Y，Koike K，et al. Decomposition of environmentalIypersistent trifluoroacetic acid to fluoride ions by a homogeneous photocatalystin water . Environ. Sci. Technol. , 2003, 37(2) : 418^422.)
陳靜等人對全氟辛酸、全氟庚酸、全氟己酸、全氟戊酸和全氟丁酸等五種全氟羧酸在185納米真空紫外光下的光降解行為進行了研究。結果發現在185納米紫外光照下，全氟羧酸發生了顯著的降解，并生成氟離子。而在254納米的紫外光照下降解不明顯。液相/質譜分析表明，全氟辛酸光降解時會逐級生成短鏈的全氟庚酸、全氟己酸、全氟戊酸和全氟丁酸。在185納米光照下，全氟羧酸首先發生脫羧反應，進而與水反應生成少I個碳原子的全氟羧酸和氟離子。(陳靜，張彭義，等.全氟羧酸在185納米真空紫外光下的降解研究 環境科學，2007，28(4) : 773-776.)
HORI等嘗試用過硫酸鹽作為添加劑，光降解PF0A。結果發現過硫酸根在紫外光激發下產生兩個激發態的硫酸根，其在水溶液中具有很強的氧化能力，從而對全氟有機物起降解作用，這表明起催化作用的是激發態的硫酸根，而不是過硫酸鹽。(H0RI H，YAMAM0T0A, HAYAKAffA E, et al. Efficient decomposition of environmentalIy persistentperfluorocarboxylic acids by use of persulfate as a photochemical oxidant.Environ. Sci. Technol. , 2005, 39(7) : 2383-2388.)曲燕等人在第六屆全國環境化學大會中，報道了《光致水合電子還原降解水中全氟辛酸(PFOA)的研究》。文中著重論述了一種采用碘化鉀(KI)作為媒介光催化還原降解PFOA廢水的新方法。(曲燕，張超杰，周琪.光致水合電子還原降解水中全氟辛酸(PFOA)的研究.第六屆全國環境化學大會(水環境化學).)
曹夢華等人于2011年考察高碘酸鹽對PFOA的光化學降解行為的影響。(曹夢華，王貝貝，朱湖地，等.高碘酸鹽光化學降解水中PFOA研究.環境科學,2011, 32(1) : 130-134.)
李振明等人在持久性有機污染物論壇2010暨第五屆持久性有機污染物全國學術研討 會論文集中報道了利用納米氧化銦光催化降解全氟辛酸的研究，發現納米氧化銦可以快速降解PF0A。(李振明，邵田，張彭義.納米氧化銦光催化降解全氟辛酸的研究.持久性有機污染物論壇2010暨第五屆持久性有機污染物全國學術研討會，2010.)
4. 1.5超聲波降解技術
MORIffAKI等利用超聲波對全氟有機物進行降解，其原理是依靠超聲波在液體中產生的氣穴現象對全氟有機物進行降解。實驗中由于氬氣具有很高的多元系數，使反應體系具有更高的溫度，因此在氬氣的存在時會顯著加快PFOA的降解過程。實驗測得，在氬氣氣氛下超聲降解PFOA的半衰期為22分鐘。(M0RIWAKI H，TAKAGI Y，TANAKA M, et al.Sonochemical decomposition of perfluorooctane sulfonate and perfluorooctanoicacid. Environ. ScL TechnoL，2005，39(9) : 3388-3392.)
4.1.6微生物降解技術
微生物降解技術通常具有高效、穩定性好、安全和無二次污染等特性，是治理含氟化合物殘留問題的有效途徑之一。近十幾年來，隨著基因工程技術的發展，利用微生物降解含氟化合物的研究日益增多與深入。吳敏等人從長期受全氟有機物污染的污泥中馴化分離得到了數株優勢降解菌，研究證明以全氟有機物為唯一碳源的兩株優勢菌種對多種全氟有機物都具有一定的濃度耐受能力。(吳敏，周鈕明，薛靜，等.含氟有機化合物優勢降解菌的篩選.江蘇環境科
2003, 7^^ :30-32.)
邱吉國等人從污水處理池的活性污泥中分離了一株乙羧氟草醚的降解細菌，命名為YFl0文中著重對影響菌株降解效果的環境因素進行了單變量考查。該菌株能以苯酚、鄰苯二酚、對苯二酚、鄰氯苯酚、苯甲酸、龍膽酸和對硝基苯酚為底物生長，但不能利用3-苯氧基苯甲酸為唯一碳源生長。(邱吉國，鄭金偉，張雋，等.乙羧氟草醚降解菌Pseudomonassp. YFl的分離、鑒定與降解特性 應用與環境生物學報，2009,15(5))
吳敏等人從活性污泥中篩選獲得兩株能以含氟有機化合物為唯一碳源生長的降解菌Zl和Z3。生物忍耐力實驗結果表明當全氟辛酸濃度高達1000毫克每升時，Zl和Z3不能正常生長，見表2:(吳敏，周鈺明，薛靜，等.含氟有機化合物優勢降解菌的篩選.江蘇環境科技，2003,16(1) : 30-31.)
并且通過液-質色譜聯用檢測技術對Zl和Z3的降解特性進行考查，結果發現全氟辛酸是通過與羧基相鄰碳上的一個氟被氫取代而被降解菌株所利用的。氟苯酚作為典型的單取代氟化合物，是一種重要的化工原料和有機中間體，主要應用于合成含氟農藥、醫藥、染料和感光材料等精細化工品。在生產使用過程中，造成嚴重的生物累積，危害著人類健康。
張超杰等人通過氣質聯用儀器檢測了微生物降解間氟苯酚的中間降解產物，初步確定3-氟鄰苯二酚和4-氟鄰苯二酚為中間降解產物，參見張超杰，周琪，陳玲，等.間氟苯酚的好氧生物降解性及降解途徑研究.|##學，2006，少)1841-1845.)氣質聯用儀器進一步檢測表明間氟苯酚羥基化的產物先鄰位開環，再環化脫氟。Goldman, Tonomura and Kelly 等人證實了假單胞桿菌屬(pseudomonads)能夠順利降解氟乙酸鹽為乙醇酸鹽，并釋放出氟負離子，參P. Goldman, J. Biol.^e .240(1965)3434 - 3438。H. Kawasaki, N. Esaki 等人通過分析 X. autotrophicus GJlO 菌株的 Asp-105 和His-272的核苷酸序列，提出了氟乙酸的催化降解機理。其中，Asp-105作為親核試劑取代氟乙酸中的F_離子，形成酯中間體。然后，在His-272活化水分子作用下酯發生水解，重新釋放出 Asp-105 酶。參見 J.-Q. Liu, T. Kurihara, S. Ichiyama, M. Miyagi, S. Tsunasawa,H. Kawasaki, K. Soda, N. Esaki,.
J. Biol. Chem 273 (1998) 30897 - 30902。Bertau在研究乙烯醇濃度如何影響面包酵母催化的對應選擇性時，也發現了氟負離子的存在，參見0. Cabon, D. Buisson, M. Larcheveque, R. Azerad, Tetrahedron:Asywm.6(1995)2199 - 2210。Reineke等人研究Pseudomonas sp. strain B13分泌的馬來酸醋酸還原酶對含氟馬來酰醋酸的微生物降解作用。發現降解過程中需要Two equivalents of NADH (煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)還原型輔酶(可以提供氫負離子)，參見S. R. Kaschabek, ff. Reineke,J. BacterioL 177 (1995) 320 - 325。氯氟氰菊酯是一種具有高效、廣譜的含氟殺蟲劑，對多種鱗目幼蟲都有很好的效果，亦可有效地防治某些地下害蟲。2010年，張建云等人發表了《I株氟氯氰菊酯降解菌GZ-3的分離和鑒定》的文章。筆者通過富集篩選的方法，從農藥污染的土壤中篩選到I株氟氯氰菊酯降解菌GZ-3，通過16SrDNA序列測定，初步鑒定該菌為銅綠假單胞菌。將與其最相近的25個16SrDNA核糖核酸序列構建進化樹，該文對氟氯氰菊酯降解的研究較為簡單，對降解產物和可能的機理沒有說明。而且銅綠假單胞菌是一種常見的致病菌，將其作為工程菌應用于生物修復之前，必須對其生物安全性進行嚴格評價。何志橋等人采用臭氧法降解含氟苯模擬廢水，主要考察了反應液初始酸堿度、反應物初始濃度、臭氧投量、反應溫度對臭氧氧化降解氟苯反應速率的影響，測定主要中間降解產物為苯酚、苯醌、呋喃二酮、亞聯苯等。(何志橋，宋爽，楊岳平，等.臭氧法降解水中氟苯的動力學研究 高校化學工程學報 2007，W d 298-303.)
通常，微生物降解酶比菌株本身具有更好的降解能力，且降解酶比較穩定，降解具有廣譜性。林淦和姚威運用超聲波細胞粉碎法，提取了陰溝腸桿菌W-I中的粗酶液，通過農藥降解特性實驗和氣質聯用檢測技術，充分證明該粗酶液對氟氯氰菊酯具有降解作用，參見林淦，姚威.陰溝腸桿菌w-1粗酶液對氯氟氰菊酯的降解效果及其作用機理.江蘇農業科學，2006，191-192，198。在2009年，徐蓮等人從農藥廠的廢水排放口附近的活性污泥中也分離到一株能以功夫菊酯為惟一碳源生長的細菌GF-3。應用滲透休克原理進行酶定域試驗，結果表明絕大多數降解酶屬于胞外酶，參見徐蓮，張麗萍，劉怡辰，等.功夫菊酯降解菌GF-3的篩選鑒定及其降解特性研究.皮#1##學學瘦，2009，激O 1545-1551。最重要的是，該研究通過質粒消除及電泳檢測分析發現功夫菊酯的降解與質粒無關，該降解基因不存在于質粒中。降解技術的比較
微波等離子體、水等離子體和填充床等離子體技術都屬于低溫等離子體技術，對含氟有機化合物降解的不足之處在于副產物較多、能耗高、儀器設備要求高、費用大、易造成二次污染及影響降解的因素復雜等幾方面。而光催化降解技術目前常用的光催化劑比較單一，大多數研究都集中在采用二氧化鈦或其復合型作為光催化劑。所以，光催化降解技術的發展需要解決的問題是(1)如何合成更多具有較高催化活性的光催化劑；(2)催化劑的分
離回收與再利用技術；(3)設計低耗高能的光源和儀器設備等幾方面。微生物降解法與它們不同，其實質是有機污染物在生物或其酶的作用下的一系列的酶促反應，主要通過細菌或其他微生物的酶系活動來分解有機物質。其降解方式主要有以下三種
(1)共代謝降解是指一些難降解的有機物通過微生物的作用能改變其化學結構，但不能被微生物用作碳源和能源，而必須從其它底物中獲取大部分或全部碳源和能源的代謝過程;
(2)生長代謝是指微生物可將某些污染物作為其生長的碳源和能源物質加以分解和利用的代謝過程。其中，許多有毒物質都可以像天然有機化合物那樣作為微生物的生長基質；
(3)礦化作用是指在土壤微生物的作用下，土壤中有機態化合物轉化為無機態化合物過程的總稱。復雜的有機物質經過微生物酶的一系列作用，可以使其最終被分解二氧化碳和水等簡單的無機(礦質)化合物，同時釋放出能量。余慧等人曾撰文又指出，要能轉化含氟有機化合物，必須有能分解代謝碳-氟鍵(C-F)的酶。酶作用于碳-氟鍵(C-F)并使其斷裂，有以下四種情況
(I)氧化脫鹵依靠單、雙加氧酶作用于鹵代有機底物上產生鹵化氫，鹵離子會自發的從不穩定的鹵化氫中釋放出來；(2)消除脫鹵在脫氫脫鹵酶的催化脫鹵作用下，脫鹵形成雙鍵；(3)取代脫鹵在鹵代水解酶的催化作用下發生水解取代反應，達到脫鹵的目的；(4)還原脫鹵在提供電子供體的條件下，從一個分子上去除鹵代原子的同時添加一個電子到這個分子上。另外，某些厭氧細菌，可以利用特殊的鹵代有機物作為呼吸過程的電子受體。在應用微生物降解技術處理污染物時，最終產物大都是無毒無害的、穩定的物質，如二氧化碳、水和氮氣。這種治理污染物的方法可以有效避免污染物的多次轉移，一般可以做到一步到位。因此，它是一種安全而徹底消除污染的好方法。目前，微生物降解技術已成為環境保護中應用最廣、最為重要的技術之一，在處理環境污染物方面具有速度快、消耗低、效率高、成本低、反應條件溫和、以及無二次污染等特點。而且，隨著現代生物技術的發展，尤其是基因工程、細胞工程和酶工程等生物技術的飛速發展和應用，使其具有更高的效率、更低的成本和更好的專一性，從而大大強化了微生物降解的處理過程。因此，在水和大氣污染的治理、有毒有害物質的降解、廢物資源化、環境監測和污染環境的修復等環境保護的各個方面，都發揮著極為重要的作用。

發明內容
本發明的目的之一在于提供一種全氟化合物降解菌基因。該基因能夠順利實現碳-氟鍵(C-F)的切斷，釋放出了氟負離子。本發明的目的之二在于提供該基因的合成方法。本發明的目的之三在于提供該基因降解全氟化合物的方法，即能夠順利實現這一類全氟化合物的微生物降解，同時實現碳-氟鍵(C-F)的有效切斷，從而為全氟化合物的工業污染提供一種有效的解決途徑；
為達到上述目的，本發明的基本原理為
自然界中本身并不存在能夠順利降解全氟化合物的菌株，本發明通過梯度增加全氟化合物在富集培養基中的濃度作為環境限制因子，選取恰當的培養時間，給予土壤液中微生 物菌群足夠適應與競爭時間，最終通過馴化、基因誘變、基因組重組及基因組雜交等過程，誘導合成相應的全氟有機化合物降解酶，建立新的酶系統，篩選獲得能夠以全氟有機化合物作為碳源和能源生長，并能夠順利切斷碳-氟鍵(C-F)的降解菌株；
首先，采用富集篩選的方法，并且梯度增加全氟化合物在富集培養基中的濃度，作為微生物菌群生長的環境限制因子，經過長期的誘變和馴化微生物，能夠篩選獲得在含有一定濃度全氟化合物的富集培養基中正常生長的微生物；
其次，鑒定微生物切斷碳-氟鍵(C-F)的能力，從而才可以確定篩選獲得的微生物是否對全氟有機化合物具有降解能力，鑒定手段主要采用離子色譜及核磁共振技術；
再對具有降解能力的微生物進行分離純化，目的是獲取一株具有高效降解能力的純菌株。分離純化采用的主要方法是利用固體平皿稀釋涂布和反復劃線分離的方法，同時通過普通光學顯微鏡(革蘭氏染色法)和透射電子顯微鏡(TEM)觀察，獲得能夠順利降解全氟化合物的純菌株；
最后，對純菌株進行分子生物學水平的鑒定，主要采用聚合酶鏈式擴增技術(PCR技術)，然后將測到的序列與美國國立生物技術信息中心(The National Center forBiotechnology Information)中已知的細菌序列相比較,根據親緣關系遠近最終確定種屬。一般來說，90%以上的同源性就可以確定到屬，但確定到種的可能性很小。根據上述原理，本發明采用以下技術手段
一種全氟化合物降解菌基因，其特征在于該降解菌基因的序列為SEQ ID N0:1所示的堿基序列。一種合成上述的全氟化合物降解菌基因，其特征在于該方法的具體步驟為
a.培養質量分數為1% 50%的土壤溶液，充分靜置后，取上清液作為初始菌種液；添加全氟有機化合物作為菌株生長的誘變因子，使其初始濃度為10毫克每升至I X IO5克每升，在37攝氏度和100至200轉每分鐘轉速下培養至菌液渾濁；以10%轉接量梯度增加全氟化合物的濃度，至全氟化合物的終濃度達到初始濃度的I至10倍左右倍，在同樣條件下培養至菌液渾濁；
b.將步驟a所得菌液采用稀釋涂布和反復劃線分離方法，獲得能夠正常生長的微生
物；
具體稀釋步驟如下第一步從步驟a所得的渾濁菌液取出50至100微升左右，加入到含有3至5毫升無菌水的10毫升規格的小試管內。然后，振蕩小試管使菌液與無菌水混合均勻；
第二步從第一步混合好的小試管內再取出50至100微升液體，加入到第二支含有3至5毫升無菌水的10毫升規格的小試管內，振蕩混合均勻；
第三步再從第二步混合好的小試管內再取出50至100微升液體，加入到第三支含有3至5毫升無菌水的10毫升規格的小試管內，振蕩混合均勻；
如此，重復上述操作，從上一次混合好的液體中取出50至100微升液體，加入到下一支提前準備好的含有3至5毫升無菌水的10毫升規格的小試管內，振蕩混合均勻；
重復操作10至15次；并按順序分別對每一只試管進行編號1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或I到15 ；
第四步，從每個編號的小試管內分別吸取相同體積的液體(10至200微升范圍內均可)，分別加入到提前制作好的每個無菌固體培養皿中，然后，用無菌涂棒把液體在固體培養皿中涂抹均勻，并編好相應號碼，放入37攝氏度的生化培養箱中培養至出現菌落。c.采用基因組試劑盒對步驟b所得微生物進行基因組DNA快速提取，即得到全氟化合物降解菌基因。上述步驟c的具體方法為將上述步驟b所得微生物配制成菌體密度(0D_)約為1. 0左右濃度的菌液備注沒有加菌的培養液作為測吸光度時的空白對照，培養約7至12小時的菌液作為被測試對象，采用721型紫外分光光度計在波長600納米處，與空白對照培養基同時測定吸光度，空白對照培養液菌體密度(0D_值)調節為零，這時儀器上讀出的數字即為菌體密度(0D_值)。在IOOOOrpm轉速下離心分離30s ;棄上清液，再加入Digestion消化液,并吹打均勻；再加入10mg/mL蛋白酶K,混均勻后在56°C水浴鍋內消化30 60min至完全透明；消化完全后，再加入RNase酶,室溫消化5min ;加入BD Buffer混均，在70°C溫度下消化IOmin ;加入無水乙醇混均；將所有液體移入回收柱(快速分離、基因組提取試劑盒獲取基因DNA，這個試劑盒是廠家配制好的，基因組提取這步實驗所用的試劑除乙醇外自己準備和回收柱即專用柱都包含在內，產品名稱是EZ-IO Spin ColumnBacterial Genomic DNA MiniPreps Ki),在轉速為 12000rpm 的離心機內離心 3min ;舍棄上清液，加入PW Solution,在轉速為IOOOOrpm下離心Imin,離心后棄上清液；在轉速為IOOOOrpm下離心2min ;將專用柱子移入離心管內，在吸附膜正中央加入經65°C 80°C下預熱后的Elution Buffer,在60°C水浴鍋內水浴5min ;水浴結束后，在轉速為IOOOOrpm下離心Imin即得到基因組提取液。一種降解全氟化合物的方法，采用上述的降解菌基因，其特征在于該方法的具體步驟為
補充內容如下
第一步，在250毫升或500毫升的錐形瓶內，配制50至100毫升的液體培養基或100至200毫升，在121攝氏度的高壓滅菌鍋里高壓滅菌20分鐘；滅菌結束后，取出培養瓶放入溫度為50攝氏度左右的烘箱內烘干；烘干后，再打開無菌操作工作臺內的紫外燈，對培養瓶內培養基液進行30分鐘的紫外滅菌；
第二步，采用根據權利要求I所述的降解菌，按體積百分比為百分之五到百分之二十取出權利要求I已經獲得的菌液加入到第一步的液體培養基；第三步，再在第二步的液體培養基中加入全氟有機化合物初始濃度為100毫克每升至 IXlO5克每升；
第四步，在35至38攝氏度，轉速為100至200轉每分鐘的振蕩培養箱中培養至菌液完全渾濁培養時間肉眼觀察渾濁或根據需要可以根據菌體密度OD_值大小判斷，一般在
0.5至I. 0較好，完全渾濁后結束培養；
第五步，從培養液中取出10至50毫升，離心后取上清液體，然后，從上清液體里取7至10毫升用作離子色譜測定分析液；
第六步，剩下的培養液，根據全氟有機化合物的性質選擇極性相似的有機溶劑進行萃取，分別收集有機層和水層，再采用旋轉蒸發儀對有機相和水相進行旋干；
第七步，水相旋干瓶內加入氣代乙醇或重水進行H1 NMR和19F NMR檢測分析；
第八步，有機旋干瓶內加入等體積的三氟乙酸乙酯標準溶液作為內標濃度已知和DMS0-d6，進行H1 NMR和19F NMR檢測分析；根據19F NMR測試結果中氟信號強度比，計算出全氟化合物大致的降解率。采用本發明的降解菌基因對全氟化合物進行降解，其降解率可達到75%左右；本發明對利用微生物降解技術來實現全氟化合物工業污染的治理具有重要的理論指導及實際應用價值。


圖I為PFOA降解菌的菌落形態。圖2為PFOA降解菌的革蘭氏染色，油鏡觀察放大倍數IOX 100。圖3為PFOA降解菌的電子透射電子顯微鏡(TEM)。圖4為PFOA降解菌的基因組DNA片段凝膠電泳檢測結果。圖5為PFOA降解菌PCR擴增的凝膠電泳檢測。
圖6為PFOA降解菌系統發育樹的構建。圖7為培養基pH值對菌株生長的影響。(4,0.492)、(5，0. 512)、(6，0. 513)、(7，0. 522)、(8，0. 527)、(9，0. 522)、(10，0. 465)。圖8為接菌體積數對菌株生長的影響。(2%，0.58) (5%, 0. 62) (10%, 0. 65)(15%, 0. 71) (20%, 0. 69)
圖 9 為菌株對 PFOA 濃度的耐力實驗。(100mg/L，0. 57)、(200mg/L, 0. 98), (5OOmg/L, I. 01)、(1500mg/L, 0. 99)、(2000 mg/L, 0. 83)、(5000 mg/L, 0. 19)。圖10 為通氧量對菌株生長的影響。(30mL/250mL, 0. 39)、(60mL/250mL, 0. 48)、(90mL/250mL, 0. 61)、(120mL /250mL, 0. 68)、(150m /250 mL, 0. 61)、(180m /250 mL, 0. 54)。圖11 為原料 PFOA 的 F19NMR 譜。圖12為PFOA降解后的19FNMR譜。圖13為PFOA降解產物的離子色譜。圖14為用氟化鉀配制氟標準色譜。圖15為PFOA降解產物離子色譜實驗數據。圖16為LB培養基中PFOS降解產物的離子色譜。圖17為無機鹽培養基(MSN)中PFOS降解產物的離子色譜。
圖18為PFOS在兩種培養基中降解的離子色譜的實驗數據。
具體實施例方式以下以PFOA為例，說明發明的具體實施方法 一、降解菌的富集篩選
實施例一配制質量分數為1%的土壤溶液，在37攝氏度和一定轉速的振蕩培養箱中培養一定時間。充分靜置后，上清液作為初始接種菌液。首先，在100毫升篩選培養基中添加PFOA作為菌株生長誘變因子，使其初始濃度約為100毫克/每升，再添加10毫升土壤上清液于篩選培養基中，在37攝氏度、一定轉速的恒溫振蕩培養箱中培養至菌液渾池；其次，以10%轉接量、吸取10毫升新鮮菌液轉接至另一瓶100毫升的新鮮篩選培養基中，此時，PFOA濃度增加至150毫克每升，在同樣條件下振蕩培養至菌液渾濁；每隔I天左右轉接一次，梯度增加PFOA濃度至340毫克每升。然后，對最后一次新鮮菌液進行固體平皿稀釋涂布，置于37攝氏度生化培養箱中培養，獲得能夠在含有PFOA濃度為340毫克每升的培養基中正常生長的微生物。實施例二 本實施例與實施例基本相同，所不同的是將土壤溶液的濃度配制成質量分數為10%，PFOA的初始濃度為1000mg/L。實施例三本實施例與實施例基本相同，所不同的是將土壤溶液的濃度配制成質量分數為30%的土壤溶液，PFOA的初始濃度為10000mg/L。實施例四本實施例與實施例基本相同，所不同的是將土壤溶液的濃度配制成質量分數為50%，PFOA的初始濃度為100000mg/L。對上述篩選獲得的純菌株的形狀、大小和顏色等形態進行觀察。具體操作是首先，在37攝氏度和一定轉速下的恒溫振蕩培養箱中，發酵培養3毫升新鮮菌液；其次，吸取100微升新鮮發酵液用無菌水進行KT1至10,梯度稀釋；最后，從10_1(1稀釋菌液內吸取100微升涂布于固體平皿中，在37攝氏度恒溫生化培養箱中培養至出現菌落；然后，進行菌落形態的觀察并記錄結果。PFOA降解菌的菌落形態見圖1，由圖可知該菌落呈黃色、圓形、邊緣整齊、表面光滑而飽滿、中間凸起且易挑取。對上述b篩選獲得的純菌株的光學顯微鏡觀察(通常采用革蘭氏染色法進行顯微鏡觀察時樣品的制備)的具體實施步驟如下首先，取一定數量已擦干的載玻片，分別在火焰上烤一下用筆標記的涂菌部位以便除去油脂；第二、分別滴一滴無菌水在各個載玻片上，再從剛培養出菌落的固體培養基上分別挑取少量菌體涂在載玻片上，盡量使菌體涂布的薄而均勻；第三、晾干各個載玻片后，分別使各個載玻片通過火焰2或3次以便固定菌膜；第
四、滴加草酸銨結晶紫液于各個載玻片上的涂菌部位進行染色，然后分別用水沖洗涂片；第
五、分別滴加I滴碘液于各個載玻片上進行染色，再分別用水沖洗涂片；第六、對每個載玻片連續滴加乙醇(95%)進行脫色；最后、分別對每個載玻片滴加蕃紅復染數分鐘，再水洗至流出的水無顏色后在光學顯微鏡下用油鏡進行觀察(放大一定倍數)。PFOA的光學顯微鏡觀察結果見圖2。對獲得的篩選獲得的純菌株進行透射電子顯微鏡(TEM)表征。其具體實施步驟如下首先，在固體培養基平皿中培養出要進行透射電子顯微鏡表征的降解菌落，培養時盡量保證出現單個菌落，且剛出現菌落時就結束培養；然后，在真空條件下，用電子散射能力強的重金屬原子來噴鍍樣品表面，這樣在樣品和沒有噴鍍的區域形成較強的反差，而沒有噴鍍的部分成為了樣品的投影，根據投影可以觀察細菌的鞭毛。PFOA降解菌的透射電子顯微鏡觀察結果見圖3，由圖可知該降解菌不含鞭毛且呈橢圓形。二、降解菌株基因組DNA (脫氧核糖核酸)片段的提取；
在37攝氏度和一定轉速下只需要發酵培養3毫升至5毫升新鮮菌液；其次，再采用基因組試劑盒(Named EZ-IO Spin Column Bacterial Genomic DNA MiniPreps Kit)快速提取方法對全氟有機化合物的降解菌進行基因組DNA (脫氧核糖核酸)快速提取。具體實施步驟如下(I)吸取1.5mL新鮮菌液于I. 5mL離心管內，在轉速為IOOOOrpm的離心機內離心30s ； (2)離心結束后去上清,再加入180MLDigestion消化液,這時需要把離心管地底部沉淀用移液槍吹打均勻；(3)再加入20ML10mg/mL蛋白酶K，混均勻后在56°C水浴鍋內消化3(T60min至完全透明；(4)消化完全后，再加入20ML RNase酶，室 溫消化5min ；(5)加入20ML BD Buffer混均，在70°C水浴鍋內消化IOmin ；(6)加入20ML無水乙醇混均,這時所有液體移入專用柱內，在轉速為12000rpm的離心機內離心3min ； (7)舍棄管內液體，加入50ML Pff Solution,在轉速為IOOOOrpm下離心lmin,離心后棄下液；重復此步驟一次；(8)專用柱子在轉速為IOOOOrpm下離心2min ； (9)柱子移入干凈的I. 5mL離心管內，在吸附膜正中央加入50ML Elution Buffer (被加入前需在65°C 80°C下預熱)，在60°C水浴鍋內水浴5min ;(10)水浴結束后，在轉速為IOOOOrpm下離心Imin即得到50ML基因組提取液；最后，通過瓊脂凝膠電泳檢測技術對提取的基因組DNA片段進行提取效果的分析。PFOA降解菌的基因組DNA片段凝膠電泳檢測結果見圖4。三、降解菌基因組DNA片段的聚合酶鏈式反應(PCR)；
聚合酶鏈式反應的反應體系(1X50微升)設置如下10XPCR緩沖液(1X5)微升、上下游引物各(1X1 )微升、Taq DNA聚合酶(1X0.25)微升、dNTP混合液(1X4)微升、無菌去離子水(1X37.75)微升，基因組DNA I微升。PFOA降解菌基因組DAN片段的聚合酶鏈式反應結果的凝膠電泳檢測結果見圖5，其中，上下游引物設計如下(5-ACACATGCAAGTCGAGCGGT-3')和(5- TCATGAATCACAAAGTGGTAAGCG-3')。PFOA降解菌的聚合酶鏈式反應擴增后產物經切膠回收、純化后，連同設計的特定引物(5-ACACATGCAAGTCGAGCGGT-3,)和(5- TCATGAATCACAAAGTGGTAAGCG-3')送到上海生物科技公司進行核糖核酸序列測定。利用DNAstar軟件對上下游引物分別測序的結果進行分析，最終得到長度為1433kb (是1433kb)的序列。四、降解菌系統發育樹的構建
根據PFOA降解菌的核糖核酸序列測序結果，進入美國國家生物技術信息中心(National Center For Biotechnology Information),通過與已知細菌進行核糖核酸序列比對(Blast)，把與其同源性最接近的25個已知序列用以構建系統發育樹，表示種屬間的親近關系，結果見圖6:
五、降解菌的碳源、氮源利用和生理生化特性的鑒定
對PFOA降解菌進行生理生化特性的鑒定，主要包括PFOA降解菌對碳源、氮源利用率、產酶特性及代謝產物等幾方面，具體鑒定指標的選擇需要根據PFOA降解菌的16SrDNA核糖核酸序列測定分析結果，再參考《伯杰氏系統細菌學手冊》(第八版)進行選擇。PFOA降解菌的生理生化特性鑒定結果見下表I :表I PFOA降解菌的生理生化特性鑒定
權利要求
1.一種全氟化合物降解菌基因，其特征在于該降解菌基因的序列為SEQ ID N0:1所示的堿基序列。
2.一種合成根據權利要求I所述的全氟化合物降解菌基因，其特征在于該方法的具體步驟為 配制質量分數為1% 50%的土壤溶液,充分靜置后,取上清液作為初始菌種液；添加全氟有機化合物作為菌株生長的誘變因子，使其初始濃度為100毫克每升至 I X IO5克每升，在37攝氏度和100 200轉每分鐘轉速下培養至菌液渾濁；以10%轉接量接入新鮮菌液，并梯度增加全氟化合物的濃度，至全氟化合物的終濃度達到初始濃度的I 10倍，在同樣條件下培養至菌液渾濁； 將步驟a所得菌液采用稀釋涂布和反復劃線分離方法，獲得能夠正常生長的微生物；具體稀釋步驟如下 b-1.從步驟a所得的渾濁菌液取出50 100微升，加入到含有3 5毫升無菌水內；然后，振蕩小試管使菌液與無菌水混合均勻，得混合液，編號標記； b-2.將步驟b-1所得混合液中再取出50 100微升液體，加入到第二支含有3至5毫升無菌水的10毫升規格的小試管內，振蕩混合均勻；重復操作10 15次；并按順序依次編號; b-3.從每個編號中取出混合液均勻涂抹在固體培養皿中，并編好相應號碼，放入37攝氏度的生化培養箱中培養至出現菌落； 采用基因組試劑盒對步驟b所得微生物進行基因組DNA快速提取，即得到全氟化合物降解菌基因。
3.根據權利要求2所述的全氟化合物降解菌基因，其特征在于上述步驟c的具體方法為 C-1.將上述步驟b所得微生物配制成菌體密度OD_為0. 8 I. 2濃度的菌液，培養7 12小時的菌液作為被測試對象，將沒有加菌的培養液作為測吸光度時的空白對照；c-2.在IOOOOrpm轉速下離心分離30s ;棄上清液,再加入Digestion消化液,并吹打均勻；再加入10mg/mL蛋白酶K,混均勻后在56°C水浴鍋內消化3(T60min至完全透明；消化完全后，再加入RNase酶,室溫消化5min ;加入BD Buffer混均,在70°C溫度下消化IOmin ;加入無水乙醇混均；將所有液體移入回收柱內，在轉速為12000rpm的離心機內離心3min ；舍棄上清液，加入PW Solution,在轉速為IOOOOrpm下離心Imin,離心后棄上清液；在轉速為IOOOOrpm下離心2min ;將回收柱移入離心管內，在吸附膜正中央加入經65°C 80°C下預熱后的Elution Buffer,在60°C水浴鍋內水浴5min ;水浴結束后,在轉速為IOOOOrpm下離心Imin即得到基因組提取液。
4.一種降解全氟化合物的方法，采用根據權利要求I所述的降解菌基因，其特征在于該方法的具體步驟為 a.將降解菌加入到液體培養基中，降解菌的體積為液體培養基的5% 20%； b.再在步驟a所得液體培養基中加入濃度為100mg/L IX 105g/L每升的全氟有機化合物； c.在35 38攝氏度，轉速為100 200轉每分鐘的振蕩培養箱中培養至菌液完全渾濁；d.從步驟c所得液體培養基中取出10 50毫升，離心后取上清液體，然后，從上清液體里取7 10毫升用作離子色譜測定分析液； e.剩下的液體培養基進行萃取，分別收集有機層和水層，再采用旋轉蒸發儀對有機相和水相進行旋干； f.水相旋干瓶內加入氣代乙醇或重水進行H1NMR和19F NMR檢測分析； g.有機旋干瓶內加入等體積的三氟乙酸乙酯標準溶液作為內標和DMS0-d6，進行H1NMR和19F NMR檢測分析；根據19F NMR測試結果中氟信號強度比，計算出全氟化合物大致的降解率。
全文摘要
本發明涉及一種全氟化合物降解菌基因、及其合成方法及應用。該降解菌基因的序列為SEQIDNO1所示的堿基序列。采用本發明的降解菌基因對全氟化合物進行降解，其降解率可達到75%左右。本發明對利用微生物降解技術來實現全氟化合物工業污染的治理具有重要的理論指導及實際應用價值。
文檔編號C12N15/10GK102703473SQ201210190868
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月12日 優先權日2012年6月12日
發明者羅會華, 郝健, 馬中良 申請人:上海大學