一種以PDDA-Fe₃O₄納米粒子為載體制備固定化葡萄糖氧化酶的方法

專利名稱：一種以PDDA-Fe₃O₄納米粒子為載體制備固定化葡萄糖氧化酶的方法
技術領域：
本發明涉及一種TODA-Fe3O4磁性納米粒子固定化葡萄糖氧化酶及其制備方法。
背景技術：
隨著生化工程技術的發展及紡織品綠色加工要求的提高，紡織品生物酶前處理已被公認為是一種符合環保要求的印染加工方法。其中葡萄糖氧化酶可以催化葡萄糖生成過氧化氫用于紡織品漂白，同時生成的葡萄糖酸內酯可進一步水解生成葡萄糖酸，能螯合水中具有催化過氧化氫分解作用的金屬離子，使得漂白過程中不需要再另外添加穩定劑，減少了化學試劑用量和環境污染，是一種具有發展前景的生物漂白技術。但游離的葡萄糖氧化酶存在使用穩定性差、酶處理后無法回收等缺點，導致酶制 劑無法再繼續利用，不利于實際的開發應用，這些問題阻礙了酶制劑工業化應用和推廣。固定化酶受非催化部分載體的物理和化學性質影響，可在活力、專一性、PH穩定性和溫度穩定性方面發生變化，具有貯存穩定性高、易回收、可重復使用等優點，近年來在紡織領域的應用研究日益受到關注。綜上所述，設計新型載體和運用當代高新技術，開發新型、高效固定化酶，進一步提高轉化率和生產能力，是未來研究的重點。

發明內容
本發明的目的在于提供了一種TODA-Fe3O4磁性納米粒子固定化葡萄糖氧化酶及其制備方法，本發明具有技術簡單易行、制備出的載體具有高比表面積和良好的生物相容性、酶負載量高、酶活性高、酶的熱穩定性和PH穩定性高，且在外加磁場作用下該固定化酶易于回收再利用的特點。為了達到上述目的，本發明的技術方案是—種以PDDA-Fe3O4納米粒子為載體制備固定化葡萄糖氧化酶的方法，包括以下步驟1)以聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20為原料制備TODA-Fe3O4磁性納米粒子；2)以TODA-Fe3O4磁性納米粒子為載體固定化葡萄糖氧化酶。所述的步驟I)采用二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20為原料于三頸燒瓶中，在精密增力電動攪拌器攪拌下，緩慢滴加NaOH溶液，反應結束后，反應體系變為黑色懸浮液，靜置一段時間，去除上清液，用蒸餾水反復洗滌至上清液無色后，置于烘箱中烘干，即得TODA-Fe3O4磁性納米粒子粉末。所述的二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)溶液的質量濃度為3-5% ；FeCl3 6H20溶液的摩爾濃度為0. 1-0. 3mol/L ；FeCl2 *4H20的摩爾濃度為0. 05-0. 15mol/L ;且所述的二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)溶液、FeCl3 *6H20溶液和FeCl2 *4H20的體積用量比為(5_15):(35-45):(35-45)。
所述的二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)溶液的質量濃度優選為4% ；FeCl3 6H20溶液的摩爾濃度優選為0. 2mol/L ；FeCl2 *4H20的摩爾濃度為0. lmol/L ;且所述的二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20的體積用量比優選為I :4 4。所述的步驟I)的反應溫度為20-40°C，反應時間為20-40min。所述的的步驟2)將步驟I)制備的TODA-Fe3O4磁性納米粒子粉末和酶加入到pH=6的緩沖溶液中，混合均勻后，加入戊二醛溶液，充分交聯；交聯完成后，用離心機以9000r/min的轉速離心5min，倒出離心液，用水沖洗附于離心管壁上的物質，再離心，倒去離心液，反復數次后，最終附于離心管壁上的物質即為固定化葡萄糖氧化酶。所述的TODA-Fe3O4納米粒子用量為0. 05-0. 15g ;所述的pH=6的緩沖溶液采用0. 2mol/L磷酸氫二鈉溶液和0. lmol/L檸檬酸溶液的混合溶液，用量為15_25mL ;所述的酶采用葡萄糖氧化酶(商品名葡萄糖氧化酶Sigma酶活力10000u)用量為0. 3_2mg ;所述的戊二醛用量為0.01-0. 04mg。所述的TODA-Fe3O4納米粒子用量優選為0. IOg ;所述的pH=6的緩沖溶液用量優選為20mL ;所述的酶采用葡萄糖氧化酶(葡萄糖氧化酶Sigma IOOOOu)用量優選為I. 05mg ;所述的戍二醒用量優選為0. 02mgo所述的交聯溫度為10_40°C，交聯時間為0. 5-2. 5h。所述的交聯溫度為20°C，交聯時間為lh。本發明的有益效果為(I) TODA-Fe3O4磁性納米粒子制備和酶的固定化技術簡單易行，且制備出的載體具有高比表面積和良好的生物相容性。(2) I3DDA是一種帶正電的離子聚合物，將其用于納米Fe3O4的制備過程中，可以充當穩定劑的作用，能較好地抑制Fe3O4納米粒子的聚集,從而形成均勻的F1DDA-Fe3O4復合物。同時由于I3DDA的存在，使得Fe3O4納米粒子表面帶上正電荷，有利于帶負電荷的葡萄糖氧化酶的固定。(3)本發明的TODA-Fe3O4磁性納米粒子固定化葡萄糖氧化酶的酶負載量高、酶活性高、酶的熱穩定性和PH穩定性高，且在外加磁場作用下該固定化酶易于回收再利用。
具體實施例實施例I 本實施例的一種以TODA-Fe3O4納米粒子為載體制備固定化葡萄糖氧化酶的方法，包括以下步驟1)以聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20為原料制備TODA-Fe3O4磁性納米粒子；所述的步驟I)采用二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20為原料于三頸燒瓶中，其中二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)溶液的質量濃度為4% ；FeCl3 6H20溶液的摩爾濃度為0. 2mol/L ；FeCl2 4H20的摩爾濃度為0. lmol/L ;且所述的二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20的體積用量比為I :4 :4。然后在精密增力電動攪拌器攪拌下，緩慢滴加NaOH溶液，反應溫度為30°C，反應時間為30min。反應結束后，反應體系變為黑色懸浮液，靜置一段時間，去除上清液，用蒸餾水反復洗滌至上清液無色后，置于烘箱中烘干，即得I3DDA-Fe3O4磁性納米粒子粉末。2)以TODA-Fe3O4磁性納米粒子為載體固定化葡萄糖氧化酶。將步驟I)制備的I3DDA-Fe3O4磁性納米粒子粉末和葡萄糖氧化酶溶液加入到pH=6的緩沖溶液中，混合均勻后，加入戊二醛溶液，充分交聯；交聯溫度為20°C，交聯時間為60min。交聯完成后,用離心機以9000r/min的轉速離心5min,倒出離心液,用水沖洗附于離心管壁上的物質，再離心，倒去離心液，反復數次后，最終附于離心管壁上的物質即為固定化葡萄糖氧化酶。其中I3DDA-Fe3O4納米粒子用量為0. IOg ;所述的pH=6的緩沖溶液采用0. 2mol/L磷酸氫二鈉溶液和0. lmol/L檸檬酸溶液的混合溶液，用量為20mL ;所述的酶采用葡萄糖氧化酶(葡萄糖氧化酶Sigma IOOOOu)用量為I. 05mg ;所述的戊二醛用量分別為0. 01mg、0. 02mg、0. 03mg和0. 04mg的條件下；分別制備固定化酶,研究戍二醒用量對固定化葡萄糖氧化酶活力的影響，結果如表I所示，表I為戊二醛用量對固定化酶活力影響表。由表I可得戊二醛用量為0. 02mg時固定化酶活力最強。本實施例的制備方法具有以下優點(I) I3DDA-Fe3O4磁性納米粒子制備和酶的固定化技術簡單易行，且制備出的載體具有高比表面積和良好的生物相容性。(2) I3DDA是一種帶正電的離子聚合物，將其用于納米Fe3O4的制備過程中，可以充當穩定劑的作用，能較好地抑制Fe3O4納米粒子的聚集,從而形成均勻的F1DDA-Fe3O4復合物。 同時由于I3DDA的存在，使得Fe3O4納米粒子表面帶上正電荷，有利于帶負電荷的葡萄糖氧化酶的固定。(3)本實施例的TODA-Fe3O4磁性納米粒子固定化葡萄糖氧化酶的酶負載量高、酶活性高、酶的熱穩定性和PH穩定性高，且在外加磁場作用下該固定化酶易于回收再利用。實施例2本實施例的一種以TODA-Fe3O4納米粒子為載體制備固定化葡萄糖氧化酶的方法，包括以下步驟1)以聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20為原料制備TODA-Fe3O4磁性納米粒子；所述的步驟I)采用二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20為原料于三頸燒瓶中，其中二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)溶液的質量濃度為4% ；FeCl3 6H20溶液的摩爾濃度為0. 2mol/L ；FeCl2 4H20的摩爾濃度為0. lmol/L ;且所述的二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20的體積用量比為I :4 :4。然后在精密增力電動攪拌器攪拌下，緩慢滴加NaOH溶液，反應溫度為30°C，反應時間為30min。反應結束后，反應體系變為黑色懸浮液，靜置一段時間，去除上清液，用蒸餾水反復洗滌至上清液無色后，置于烘箱中烘干，即得TODA-Fe3O4磁性納米粒子粉末。2 )以TODA-Fe3O4磁性納米粒子為載體固定化葡萄糖氧化酶。將步驟I)制備的I3DDA-Fe3O4磁性納米粒子粉末和葡萄糖氧化酶加入到pH=6的緩沖溶液中，混合均勻后，加入戊二醛溶液，充分交聯；交聯溫度為20°C，交聯時間為60min。交聯完成后，用離心機以9000r/min的轉速離心5min，倒出離心液，用水沖洗附于離心管壁上的物質，再離心，倒去離心液，反復數次后，最終附于離心管壁上的物質即為固定化葡萄糖氧化酶。其中I3DDA-Fe3O4納米粒子用量為0. IOg ;所述的pH=6的緩沖溶液采用0. 2mol/L磷酸氫二鈉溶液和0. lmol/L檸檬酸溶液的混合溶液，用量為20mL ;所述的酶采用葡萄糖氧化酶(葡萄糖氧化酶Sigma IOOOOu)用量為0. 35mg、0. 7mg、l. 05mg、l. 4mg和I. 75mg的條件下；所述的戊二醛用量為0. 02mg。分別制備固定化酶，研究酶用量對固定化葡萄糖氧化酶活力的影響，結果如表2所示，表2為酶用量對固定化酶活力影響表。由表2可得酶用量為I. 05mg時固定化酶活力最強。
本實施例的制備方法具有以下優點(I) I3DDA-Fe3O4磁性納米粒子制備和酶的固定化技術簡單易行，且制備出的載體具有高比表面積和良好的生物相容性。(2) I3DDA是一種帶正電的離子聚合物，將其用于納米Fe3O4的制備過程中，可以充當穩定劑的作用，能較好地抑制Fe3O4納米粒子的聚集,從而形成均勻的F1DDA-Fe3O4復合物。同時由于I3DDA的存在，使得Fe3O4納米粒子表面帶上正電荷，有利于帶負電荷的葡萄糖氧化酶的固定。(3)本實施例的TODA-Fe3O4磁性納米粒子固定化葡萄糖氧化酶的酶負載量高、酶活性高、酶的熱穩定性和PH穩定性高，且在外加磁場作用下該固定化酶易于回收再利用。實施例3 本實施例的一種以TODA-Fe3O4納米粒子為載體制備固定化葡萄糖氧化酶的方法，包括以下步驟1)以聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20為原料制備TODA-Fe3O4磁性納米粒子；所述的步驟I)采用二烯丙基二甲基 胺鹽酸鹽(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20為原料于三頸燒瓶中，其中二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)溶液的質量濃度為4% ；FeCl3 6H20溶液的摩爾濃度為0. 2mol/L ；FeCl2 4H20的摩爾濃度為0. lmol/L ;且所述的二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20的體積用量比為I :4 :4。然后在精密增力電動攪拌器攪拌下，緩慢滴加NaOH溶液,反應溫度為40°C,反應時間為30min。反應結束后，反應體系變為黑色懸浮液，靜置一段時間，去除上清液，用蒸餾水反復洗滌至上清液無色后，置于烘箱中烘干，即得I3DDA-Fe3O4磁性納米粒子粉末。2)以TODA-Fe3O4磁性納米粒子為載體固定化葡萄糖氧化酶。將步驟I)制備的I3DDA-Fe3O4磁性納米粒子粉末和葡萄糖氧化酶加入到pH=6的緩沖溶液中，混合均勻后，加入戊二醛溶液，充分交聯；交聯時間為60min。交聯完成后，用離心機以9000r/min的轉速離心5min，倒出離心液，用水沖洗附于離心管壁上的物質，再離心，倒去離心液，反復數次后，最終附于離心管壁上的物質即為固定化葡萄糖氧化酶。其中TODA-Fe3O4納米粒子用量為0. IOg ;所述的pH=6的緩沖溶液采用0. 2mol/L磷酸氫二鈉溶液和0. lmol/L檸檬酸溶液的混合溶液，用量為20mL ;所述的酶采用葡萄糖氧化酶(葡萄糖氧化酶Sigma IOOOOu)用量為I. 05mg ;所述的戊二醛用量為0. 02mg。交聯時的溫度分別為10°C、20°C、3(rC和40°C的條件下，分別制備固定化酶，研究交聯溫度對固定化葡萄糖氧化酶活力的影響，結果如表3所示；表3為交聯溫度對固定化酶活力的影響。由表3可得交聯溫度為20°C時固定化酶活力最強。本實施例的制備方法具有以下優點(I) I3DDA-Fe3O4磁性納米粒子制備和酶的固定化技術簡單易行，且制備出的載體具有高比表面積和良好的生物相容性。(2) I3DDA是一種帶正電的離子聚合物，將其用于納米Fe3O4的制備過程中，可以充當穩定劑的作用，能較好地抑制Fe3O4納米粒子的聚集,從而形成均勻的F1DDA-Fe3O4復合物。同時由于I3DDA的存在，使得Fe3O4納米粒子表面帶上正電荷，有利于帶負電荷的葡萄糖氧化酶的固定。(3)本實施例的TODA-Fe3O4磁性納米粒子固定化葡萄糖氧化酶的酶負載量高、酶活性高、酶的熱穩定性和PH穩定性高，且在外加磁場作用下該固定化酶易于回收再利用。實施例4本實施例的一種以TODA-Fe3O4納米粒子為載體制備固定化葡萄糖氧化酶的方法，包括以下步驟1)以聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20為原料制備TODA-Fe3O4磁性納米粒子；所述的步驟I)采用二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20為原料于三頸燒瓶中，其中二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)溶液的質量濃度為4% ；FeCl3 6H20溶液的摩爾濃度為0. 2mol/L ；FeCl2 4H20的摩爾濃度為0. lmol/L ;且所述的二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20的體積用量比為I :4 :4。然后在精密增力電動攪拌器攪拌下，緩慢滴加NaOH溶液，反應溫度為30°C，反應時間為30min。反應結束后，反應體系變為黑色懸浮液，靜置一段時間，去除上清液，用蒸餾水反復洗滌至上清液無色后，置于烘箱中烘干，即得I3DDA-Fe3O4磁性納米粒子粉末。2)以TODA-Fe3O4磁性納米粒子為載體固定化葡萄糖氧化酶。將步驟I)制備的I3DDA-Fe3O4磁性納米粒子粉末和葡萄糖氧化酶溶液加入到PH=6的緩沖溶液中，混合均勻后，加入戊二醛溶液，充分交聯；交聯溫度為20°C，交聯完成后，用離心機以9000r/min的轉速離心5min，倒出離心液，用水沖洗附于離心管壁上的物質，再離心，倒去離心液，反復數次后，最終附于離心管壁上的物質即為固定化葡萄糖氧化酶。其中TODA-Fe3O4納米粒子用量為0. IOg ;所述的pH=6的緩沖溶液采用0. 2mol/L磷酸·氫二鈉溶液和0. lmol/L檸檬酸溶液的混合溶液，用量為20mL ;所述的酶采用葡萄糖氧化酶(葡萄糖氧化酶Sigma IOOOOu)用量為I. 05mg ;所述的戊二醛用量為0. 02mg。交聯時的時間分別為0. 5h、lh、l. 5h、2h和2. 5h的條件下,制備固定化酶,研究交聯時間對固定化葡萄糖氧化酶活力的影響，結果如表4所示，表4為交聯時間對固定化酶活力的影響表。由表4可得交聯時間為I小時固定化酶活力最強。本實施例的制備方法具有以下優點(I) I3DDA-Fe3O4磁性納米粒子制備和酶的固定化技術簡單易行，且制備出的載體具有高比表面積和良好的生物相容性。(2) I3DDA是一種帶正電的離子聚合物，將其用于納米Fe3O4的制備過程中，可以充當穩定劑的作用，能較好地抑制Fe3O4納米粒子的聚集,從而形成均勻的F1DDA-Fe3O4復合物。同時由于I3DDA的存在，使得Fe3O4納米粒子表面帶上正電荷，有利于帶負電荷的葡萄糖氧化酶的固定。(3)本實施例的TODA-Fe3O4磁性納米粒子固定化葡萄糖氧化酶的酶負載量高、酶活性高、酶的熱穩定性和PH穩定性高，且在外加磁場作用下該固定化酶易于回收再利用。實施例5本實施例的一種以TODA-Fe3O4納米粒子為載體制備固定化葡萄糖氧化酶的方法，包括以下步驟1)以聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20為原料制備TODA-Fe3O4磁性納米粒子；所述的步驟I)采用二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20為原料于三頸燒瓶中，其中二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)溶液的質量濃度為4% ；FeCl3 6H20溶液的摩爾濃度為0. 2mol/L ；FeCl2 4H20的摩爾濃度為0. lmol/L ;且所述的二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20的體積用量比為I :4 :4。然后在精密增力電動攪拌器攪拌下，緩慢滴加NaOH溶液，反應溫度為30°C，反應時間為30min。反應結束后，反應體系變為黑色懸浮液，靜置一段時間，去除上清液，用蒸餾水反復洗滌至上清液無色后，置于烘箱中烘干，即得TODA-Fe3O4磁性納米粒子粉末。2 )以TODA-Fe3O4磁性納米粒子為載體固定化葡萄糖氧化酶。將步驟I)制備的I3DDA-Fe3O4磁性納米粒子粉末和葡萄糖氧化酶加入到pH=6的緩沖溶液中，混合均勻后，加入戊二醛溶液，充分交聯；交聯溫度為20°C，交聯時間為60min。交聯完成后，用離心機以9000r/min的轉速離心5min，倒出離心液，用水沖洗附于離心管壁上的物質，再離心，倒去離心液，反復數次后，最終附于離心管壁上的物質即為固定化葡萄糖氧化酶。其中I3DDA-Fe3O4納米粒子用量為0. IOg ;所述的pH=6的緩沖溶液采用0. 2mol/L磷酸氫二鈉溶液和0. lmol/L檸檬酸溶液的混合溶液，用量為20mL ;所述的酶分別采用固定化葡萄糖氧化酶和游離葡萄糖氧化酶，用量為I. 05mg ;所述的戊二醛用量為0. 02mg。分別制備固定化酶和游離酶；其中固定化酶和游離酶活力如表5所示，表5為游離酶和固定化酶的活力比較表。由表5可得固定化酶活力比游離酶活力強。本實施例的制備方法具有以下優點(I) I3DDA-Fe3O4磁性納米粒子制備和酶的固定化技術簡單易行，且制備出的載體具有高比表面積和良好的生物相容性。(2) I3DDA是一種帶正電的離子聚合物，將其用于納米Fe3O4的制備過程中，可以充當穩定劑的作用，能較好地抑制Fe3O4納米粒子的聚集,從而形成均勻的F1DDA-Fe3O4復合物。同時由于I3DDA的存在，使得Fe3O4納米粒子表面帶上正電荷，有利于帶負電荷的葡萄糖氧化酶的固定。 (3)本實施例的TODA-Fe3O4磁性納米粒子固定化葡萄糖氧化酶的酶負載量高、酶活性高、酶的熱穩定性和PH穩定性高，且在外加磁場作用下該固定化酶易于回收再利用。實施例6本實施例的一種以TODA-Fe3O4納米粒子為載體制備固定化葡萄糖氧化酶的方法，包括以下步驟1)以聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20為原料制備TODA-Fe3O4磁性納米粒子；所述的步驟I)采用二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20為原料于三頸燒瓶中，其中二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)溶液的質量濃度為3% ；FeCl3 6H20溶液的摩爾濃度為0. lmol/L ；FeCl2 4H20的摩爾濃度為0. 05mol/L ;且所述的二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20的體積用量比為1:7:7。然后在精密增力電動攪拌器攪拌下，緩慢滴加NaOH溶液,反應溫度為20°C,反應時間為40min。反應結束后，反應體系變為黑色懸浮液，靜置一段時間，去除上清液，用蒸餾水反復洗滌至上清液無色后，置于烘箱中烘干，即得I3DDA-Fe3O4磁性納米粒子粉末。2)以TODA-Fe3O4磁性納米粒子為載體固定化葡萄糖氧化酶。將步驟I)制備的I3DDA-Fe3O4磁性納米粒子粉末和葡萄糖氧化酶溶液加入到pH=6的緩沖溶液中，混合均勻后，加入戊二醛溶液，充分交聯；交聯溫度為10°C，交聯時間為2. 5h。交聯完成后,用離心機以9000r/min的轉速離心5min,倒出離心液,用水沖洗附于離心管壁上的物質，再離心，倒去離心液，反復數次后，最終附于離心管壁上的物質即為固定化葡萄糖氧化酶。其中I3DDA-Fe3O4納米粒子用量為0. 15g ;所述的pH=6的緩沖溶液采用0. 2mol/L磷酸氫二鈉溶液和0. lmol/L檸檬酸溶液的混合溶液，用量為25mL ;所述的酶采用葡萄糖氧化酶(葡萄糖氧化酶Sigma 10000U)，用量為2mg ;所述的戊二醛用量為0. 04mg。制備固定化酶。本實施例的制備方法具有以下優點(I) I3DDA-Fe3O4磁性納米粒子制備和酶的固定化技術簡單易行，且制備出的載體具有高比表面積和良好的生物相容性。(2) I3DDA是一種帶正電的離子聚合物，將其用于納米Fe3O4的制備過程中，可以充當穩定劑的作用，能較好地抑制Fe3O4納米粒子的聚集,從而形成均勻的F1DDA-Fe3O4復合物。同時由于I3DDA的存在，使得Fe3O4納米粒子表面帶上正電荷，有利于帶負電荷的葡萄糖氧化酶的固定。(3)本實施例的TODA-Fe3O4磁性納米粒子固定化葡萄糖氧化酶的酶負載量高、酶活性高、酶的熱穩定性和PH穩定性高，且在外加磁場作用下該固定化酶易于回收再利用。實施例7 本實施例的一種以TODA-Fe3O4納米粒子為載體制備固定化葡萄糖氧化酶的方法，包括以下步驟1)以聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20為原料制備TODA-Fe3O4磁性納米粒子；所述的步驟I)采用二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20為原料于三頸燒瓶中，其中二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)溶液的質量濃度為5% ；FeCl3 6H20溶液的摩爾濃度為0. 3mol/L ；FeCl2 4H20的摩爾濃度為0. 15mol/L ;且所述的二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20的體積用量比為1:3:3。然后在精密增力電動攪拌器攪拌下，緩慢滴加NaOH溶液，反應溫度為40°C，反應時間為20min。反應結束后，反應體系變為黑 色懸浮液，靜置一段時間，去除上清液，用蒸餾水反復洗滌至上清液無色后，置于烘箱中烘干，即得TODA-Fe3O4磁性納米粒子粉末。2)以TODA-Fe3O4磁性納米粒子為載體固定化葡萄糖氧化酶。將步驟I)制備的I3DDA-Fe3O4磁性納米粒子粉末和葡萄糖氧化酶加入到pH=6的緩沖溶液中，混合均勻后，加入戊二醛溶液，充分交聯；交聯溫度為40°C，交聯時間為0. 5h。交聯完成后，用離心機以9000r/min的轉速離心5min，倒出離心液，用水沖洗附于離心管壁上的物質，再離心，倒去離心液，反復數次后，最終附于離心管壁上的物質即為固定化葡萄糖氧化酶。其中I3DDA-Fe3O4納米粒子用量為0. 05g ;所述的pH=6的緩沖溶液采用0. 2mol/L磷酸氫二鈉溶液和0. lmol/L檸檬酸溶液的混合溶液，用量為15mL ;所述的酶采用葡萄糖氧化酶(葡萄糖氧化酶Sigma 10000U)，用量為0. 3mg;所述的戊二醛用量為0.04mg。制備固定化酶。本實施例的制備方法具有以下優點(I) I3DDA-Fe3O4磁性納米粒子制備和酶的固定化技術簡單易行，且制備出的載體具有高比表面積和良好的生物相容性。(2) I3DDA是一種帶正電的離子聚合物，將其用于納米Fe3O4的制備過程中，可以充當穩定劑的作用，能較好地抑制Fe3O4納米粒子的聚集,從而形成均勻的F1DDA-Fe3O4復合物。同時由于I3DDA的存在，使得Fe3O4納米粒子表面帶上正電荷，有利于帶負電荷的葡萄糖氧化酶的固定。(3)本實施例的TODA-Fe3O4磁性納米粒子固定化葡萄糖氧化酶的酶負載量高、酶活性高、酶的熱穩定性和PH穩定性高，且在外加磁場作用下該固定化酶易于回收再利用。表I
權利要求
1.一種以TODA-Fe3O4納米粒子為載體制備固定化葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于包括以下步驟1)以聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20為原料制備I3DDA-Fe3O4磁性納米粒子；2)以TODA-Fe3O4磁性納米粒子為載體固定化葡萄糖氧化酶。
2.如權利要求I所述的一種以TODA-Fe3O4納米粒子為載體制備固定化葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于所述的步驟I)采用二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽溶液、FeCl3 GH2O溶液和FeCl2 *4H20為原料于三頸燒瓶中，攪拌下，緩慢滴加NaOH溶液，反應結束后，反應體系變為黑色懸浮液，靜置一段時間，去除上清液，用蒸餾水反復洗滌至上清液無色后，置于烘箱中烘干，即得I3DDA-Fe3O4磁性納米粒子粉末。
3.如權利要求I或2所述的一種以TODA-Fe3O4納米粒子為載體制備固定化葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于所述的二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽溶液的質量濃度為3-5%;FeCl3 6H20 溶液的摩爾濃度為 0. 1-0. 3mol/L ；FeCl2 4H20 的摩爾濃度為 0. 05-0. 15mol/L ;且所述的二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20的體積用量比為(5-15):(35-45):(35-45)。
4.如權利要求3所述的一種以TODA-Fe3O4納米粒子為載體制備固定化葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于所述的二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽溶液的質量濃度為4% ；FeCl3 6H20溶液的摩爾濃度為0. 2mol/L ；FeCl2 *4H20的摩爾濃度為0. lmol/L ;且所述的二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽溶液、FeCl3 6H20溶液和FeCl2 4H20的體積用量比為I :4 :4。
5.如權利要求2所述的一種以TODA-Fe3O4納米粒子為載體制備固定化葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于所述的步驟I)的反應溫度為20-40°C，反應時間為20-40min。
6.如權利要求I所述的一種以TODA-Fe3O4納米粒子為載體制備固定化葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于所述的步驟2)將步驟I)制備的TODA-Fe3O4磁性納米粒子粉末和酶液加入到pH=6的緩沖溶液中，混合均勻后，加入戊二醛溶液，充分交聯；交聯完成后，用離心機以9000r/min的轉速離心5min，倒出離心液，用水沖洗附于離心管壁上的物質，再離心，倒去離心液，反復數次后，最終附于離心管壁上的物質即為固定化葡萄糖氧化酶。
7.如權利要求6所述的一種以PDDA-Fe3O4納米粒子為載體制備固定化葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于所述的I3DDA-Fe3O4納米粒子用量為0. 05-0. 15g ;所述的pH=6的緩沖溶液采用0. 2 mol/L磷酸氫二鈉溶液和0. I mol/L檸檬酸溶液的混合溶液，用量為15_25mL ；所述的酶采用葡萄糖氧化酶(葡萄糖氧化酶Sigma IOOOOu)用量為0. 3-2mg ;所述的戍二醒用量為 0. 01-0. 04mg。
8.如權利要求7所述的一種以TODA-Fe3O4納米粒子為載體制備固定化葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于所述的I3DDA-Fe3O4納米粒子用量為0. IOg ;所述的pH=6的緩沖溶液(配方0. 2 mol/L磷酸氫二鈉溶液+0. I mol/L檸檬酸溶液)用量為20mL ;所述的酶采用葡萄糖氧化酶(葡萄糖氧化酶Sigma IOOOOu)用量為I. 05mg ;所述的戊二醛用量為0. 02mg。
9.如權利要求6所述的一種以TODA-Fe3O4納米粒子為載體制備固定化葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于所述的交聯溫度為10-40°C，交聯時間為0. 5-2. 5h。
10.如權利要求9所述的一種以TODA-Fe3O4納米粒子為載體制備固定化葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于所述的交聯溫度為20°C，交聯時間為lh。
全文摘要
本發明公開了一種以PDDA-Fe3O4納米粒子為載體制備固定化葡萄糖氧化酶的方法，包括以下步驟1)以聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽溶液、FeCl3·6H2O溶液和FeCl2·4H2O為原料制備PDDA-Fe3O4磁性納米粒子；2)以PDDA-Fe3O4磁性納米粒子為載體固定化葡萄糖氧化酶。本發明具有技術簡單易行、制備出的載體具有高比表面積和良好的生物相容性、酶負載量高、酶活性高、酶的熱穩定性和pH穩定性高，且在外加磁場作用下該固定化酶易于回收再利用的特點。
文檔編號C12N11/14GK102796724SQ20121019934
公開日2012年11月28日 申請日期2012年6月13日 優先權日2012年6月13日
發明者白剛, 劉艷春, 錢紅飛 申請人:紹興文理學院