一種體外生產牦牛胚胎的方法

專利名稱：一種體外生產牦牛胚胎的方法
技術領域：
本發明屬于牦牛繁殖領域，涉及牦牛胚胎生物技術，特別是涉及ー種體外生產牦牛胚胎的方法。
背景技術：
牦牛是青藏高原及其毗鄰地區特有的遺傳資源，是惟一能夠充分利用高寒高山草原進行動物性生產的優勢牛種，由于對高海抜地帶嚴寒、缺氧、缺草等惡劣條件的良好適應能力而成為高寒牧區最基本的生產生活資料。但特殊的生態環境條件，使牦牛形成了晩熟、繁殖力低的生態生理特性，導致牦牛遺傳進展緩慢、基因資源庫貧乏。牦牛胚胎生物技術國內外還未有效開展，牛卵母細胞的成熟率、受精卵的卵裂率 和囊胚的體外發育率結果均不穩定，牦牛胚胎體外生產更是一片空白。極有必要針對牦牛生態生理特性與環境特征，研制出ー種體外生產牦牛胚胎的技術與方法，配合應用胚胎生物技術，全面發揮優良牦牛的繁殖特性。同時，可為牦牛基因資源庫提供育種素材。

發明內容
本發明的目的在于建立體外生產牦牛胚胎的技術與方法，為牦牛胚胎生物技術的應用提供合理的技術路線，全面發揮優良牦牛遺傳潛力，豐富牦牛遺傳資源基因庫。本發明的另一目的是為稀有的牦牛遺傳資源保護，如野牦牛、天祝白牦牛，提供體外生產胚胎的技術與方法。本發明的技術方案為—種體外生產牦牛胚胎的方法，其步驟為(I)將采集的牦牛卵巢0_3h內用生理鹽水30_38°C帶回實驗室，用抽吸法獲取卵母細胞置于保存液中，保存液為PBS液添加聚こ烯醇O. 4mg/mL(防止細胞發生粘連)、牛血清白蛋白3mg/mL。(2)將卵母細胞用成熟液洗滌3次，培養27_28h。卵母細胞成熟液基礎液為Mediuml99,并添加丙酮酸鈉O. 2mmol/L,胎牛血清10%,促黃體素5mg/L,促卵泡素O. 5mg/L,雌ニ醇 lmg/L。(3)牦牛冷凍精液用改良的BO液上浮法處理。BO基礎液由112. OmM氯化鈉、4. 02mM氯化鉀、O. 83mM磷酸ニ氫鈉、O. 52mM氯化鎂、2. 25mM氯化鈣、13. 9mM葡萄糖及抗生素(75mg/L青霉素+50mg/L鏈霉素)組成。上浮法步驟為將1_4支牦牛冷凍精液細管于38°C水浴解凍，解凍后的精液加入盛有I. 0-1. 5mL BO獲能液的離心管底部，在C02培養箱中傾斜30-45°放置，使精子上浮。上浮Ih后，吸取上清液O. 5-1. 2mL,用洗精液離心洗滌兩次(800g離心8-10min)，再用獲能液上浮25_35min。獲能液由BO基礎液添加3. 108g/L碳酸氫鈉、O. 138g/L丙酮酸鈉、IOmM咖啡因、3mg/mL牛血清白蛋白組成。(4)步驟⑶處理的精子(O. 5-2X IO6個/mL)移入受精液中，受精液中含步驟(2)處理的卵母細胞。受精液由BO基礎液添加3. 108g/L碳酸氫鈉、O. 138g丙酮酸鈉、6mg/mL牛血清白蛋白、2mg/mL肝素組成。(5)受精16_18h后，用O. 2%透明質酸酶溶解卵丘細胞1-2分鐘，然后Voatex (漩渦震蕩)，脫除卵丘細胞。(6)將步驟(5)處理的受精卵移入顆粒細胞共培養體系中，每隔48h換1/2體積的培養液，培養144-168h后收集牦牛胚胎。培養液為基礎液M199添加10%胎牛血清。顆粒細胞共培養體系制備方法采集完卵母細胞后，取檢卵平皿中剰余的含顆粒細胞的卵泡液lmL，加2mL0. 2%透明質酸酶消化3_5min，用等量培養液終止消化后，200g離心5min，沉淀用5mL培養液再次懸浮,200g離心5min,最終的沉淀用培養液懸浮,用移液器將懸浮液加入培養液滴中，其最終濃度為IO6個/mL。本發明體外生產牦牛胚胎的技術參數為C02含量5% ，溫度38. 50C ;濕度飽和。

本發明體外生產牦牛胚胎的技術與方法與已有黃牛、奶牛胚胎生產技術與方法相比，具有以下特點(1)胚胎生產各技術環節操作時間不同，適宜高海抜地區牦牛胚胎體外生產；(2)成熟液、受精液依掘牦牛自身生態生理特性而配制；(3)牦牛成熟卵母細胞受精后，經透明質酸酶處理，有利于受精卵的早期發育；同時，建立的顆粒細胞共培養系統有效的克服了牦牛早期胚胎發育阻滯；(4)本技術對天祝白牦牛、野牦牛等優良品種遺傳資源的保存與利用提供了技術途徑。


圖I為卵母細胞及胚胎不同發育時期參照圖，其中，A :未成熟卵母細胞(d-1)，B :成熟卵母細胞(d0)，C 2細胞期胚胎(dl-2)，D 4細胞期胚胎(d2)，E 8細胞期胚胎(d2-3)，F 8-16細胞期胚胎(d3)，G :> 16細胞期胚胎(d3_4)，H :緊實桑椹胚(d4_5)，I 緊實桑椹胚-早期囊胚(d5-6)，J :早期囊胚(d6-7)，K :囊胚(d7-8)，L :孵化囊胚(d8_9)。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。實施例一體外生產50枚以內牦牛胚胎。(I)將采集的牦牛卵巢0_2h內用生理鹽水32_38°C帶回實驗室，用抽吸法獲取卵母細胞(圖1-A)置于保存液中，保存液為PBS液添加聚こ烯醇O. 4mg/mL、牛血清白蛋白jmg/mL0(2)將卵母細胞用卵母細胞成熟液洗滌3次，用成熟液在35mmX IOmm培養皿中制備5個50 μ L的培養液微滴，覆蓋石蠟油。培養28h后，卵母細胞形態見圖1-Β。卵母細胞成熟液基礎液為Mediuml99，并添加丙酮酸鈉O. 2mmol/L,胎牛血清10 %，促黃體素5mg/L，促卵泡素O. 5mg/L,雌ニ醇lmg/L。(3)牦牛冷凍精液用改良的BO液上浮法處理。上浮法步驟為將I支牦牛冷凍精液細管于38°C水浴解凍，解凍后的精液加入盛有I. OmL BO獲能液的離心管底部，在C02培養箱中傾斜30-45°放置，使精子上浮。上浮Ih后，吸取上清液0.5-0. 8mL，用洗精液離心洗滌兩次(800g離心8-10min)，再用獲能液上浮25_35min。獲能液由BO基礎液添加
3.108g/L碳酸氫鈉、O. 138g/L丙酮酸鈉、IOmM咖啡因、3mg/mL牛血清白蛋白組成。BO基礎液由112. OmM氯化鈉、4. 02mM氯化鉀、O. 83M磷酸ニ氫鈉、O. 52mM氯化鎂、2. 25mM氯化鈣、13. 9mM葡萄糖及抗生素(75mg/L青霉素+50mg/L鏈霉素)組成。(4)步驟(3)處理的精子(O. 5X IO6個/mL)移入50 μ L受精液中，受精液中含步驟(2)處理的卵母細胞。受精液由BO基礎液添加3. 108g/L碳酸氫鈉、O. 138g丙酮酸鈉、6mg/mL牛血清白蛋白、2mg/mL肝素組成。(5)受精16_18h后，用O. 2%透明質酸酶溶解卵丘細胞1-2分鐘，然后Voatex (漩渦震蕩)，脫除卵丘細胞。(6)將步驟(5)處理的受精卵移入顆粒細胞共培養體系中，每隔48h換1/2體積的培養液，第2天換液時，可觀察到2細胞期胚胎(圖1-C)、4細胞期胚胎(圖1-D)、8細胞期胚胎(圖トE)，培養144-168h后收集牦牛胚胎(圖1-1，1-J，トK)。培養液為基礎液M199 添加10%胎牛血清。顆粒細胞共培養體系制備方法采集完卵母細胞后，取檢卵平皿中剩余的含顆粒細胞的卵泡液lmL，加2mL0. 2%透明質酸酶消化3_5min，用等量培養液終止消化后，200g離心5min,沉淀用5mL培養液再次懸浮,200g離心5min,最終的沉淀用培養液懸浮，用移液器將懸浮液加入培養液滴中，其最終濃度為IO6個/mL。實施例ニ 體外生產100枚牦牛胚胎。(I)將采集的牦牛卵巢0_3h內用生理鹽水30_37°C帶回實驗室，用抽吸法獲取卵母細胞置于保存液中，保存液為PBS液添加聚こ烯醇O. 4mg/mL、牛血清白蛋白3mg/mL。(2)用成熟液在60mmX 15mm培養皿中制備6個100 μ L的培養液微滴，覆蓋石蠟油。將卵母細胞用成熟液洗滌3次，20-30個/滴，培養28h。卵母細胞成熟液基礎液為Mediuml99,并添加丙酮酸鈉O. 2mmol/L,胎牛血清10%,促黃體素5mg/L,促卵泡素O. 5mg/L,雌ニ醇 lmg/L。(3)牦牛冷凍精液用改良的BO液上浮法處理。BO基礎液由112. OmM氯化鈉、
4.02mM氯化鉀、O. 83mM磷酸ニ氫鈉、O. 52mM氯化鎂、2. 25mM氯化鈣、13. 9mM葡萄糖及抗生素(75mg/L青霉素+50mg/L鏈霉素)組成。上浮法步驟為將2支牦牛冷凍精液細管于38°C水浴解凍，解凍后的精液加入盛有I. 2mL BO獲能液的離心管底部，在C02培養箱中傾斜30-45°放置，使精子上浮。上浮Ih后，吸取上清液O. 8-1. OmL，用洗精液離心洗滌兩次(800g離心8-10min)，再用獲能液上浮25_35min。BO獲能液由BO基礎液添加3. 108g/L碳酸氫鈉、
O.138g/L丙酮酸鈉、IOmM咖啡因、3mg/mL牛血清白蛋白組成。(4)步驟(3)處理的精子(I X IO6個/mL)移入100 μ L受精液微滴中，受精液中含步驟⑵處理的卵母細胞。受精液由BO基礎液添加3. 108g/L碳酸氫鈉、O. 138g丙酮酸鈉、6mg/mL牛血清白蛋白、2mg/mL肝素組成。(5)受精16_18h后，用O. 2%透明質酸酶溶解卵丘細胞1-2分鐘，然后Voatex (漩渦震蕩)，脫除卵丘細胞。(6)將步驟(5)處理的受精卵移入顆粒細胞共培養體系中，每隔48h換1/2體積的培養液，第3天換液時，可觀察到8細胞期胚胎(圖1-E) ,8-16細胞期胚胎(圖1-F)、>16細胞期胚胎(圖1-G)，培養144-168h后收集牦牛胚胎(圖1_J，1_K)。培養液為基礎液Μ199添加10%胎牛血清。顆粒細胞共培養體系制備方法采集完卵母細胞后，取檢卵平皿中剰余的含顆粒細胞的卵泡液lmL，加2mL0. 2%透明質酸酶消化3_5min，用等量培養液終止消化后，200g離心5min,沉淀用5mL培養液再次懸浮,200g離心5min,最終的沉淀用培養液懸浮，用移液器將懸浮液加入培養液滴中，其最終濃度為IO6個/mL。實施例三體外生產150枚牦牛胚胎。(I)將采集的牦牛卵巢0_3h內用生理鹽水32_37°C帶回實驗室，用抽吸法獲取卵母細胞置于保存液中，保存液為PBS液添加聚こ烯醇O. 4mg/mL、牛血清白蛋白3mg/mL。(2)將卵母細胞用成熟液洗滌3次，移入含成熟液ImL/孔的四孔培養板中，覆蓋石蠟油，每孔30-50個卵母細胞，培養27-28h。卵母細胞成熟液基礎液為Mediuml99，并添加丙酮酸鈉O. 2mmol/L,胎牛血清10%,促黃體素5mg/L,促卵泡素O. 5mg/L,雌ニ醇lmg/L。(3)牦牛冷凍精液用改良的BO液上浮法處理。BO基礎液由112. OmM氯化鈉、
4.02mM氯化鉀、O. 83mM磷酸ニ氫鈉、O. 52mM氯化鎂、2. 25mM氯化鈣、13. 9mM葡萄糖及抗生素(75mg/L青霉素+50mg/L鏈霉素)組成。上浮法步驟為將3支牦牛冷凍精液細管于38°C水浴解凍，解凍后的精液加入盛有I. 5mL BO獲能液的離心管底部，在C02培養箱中傾斜30-45°放置，使精子上浮。上浮Ih后，吸取上清液1.0-1. 2mL，用洗精液離心洗滌兩次(800g離心8-10min)，再用獲能液上浮25_35min。BO獲能液由BO基礎液添加3. 108g/L碳酸氫鈉、
O.138g/L丙酮酸鈉、IOmM咖啡因、3mg/mL牛血清白蛋白組成。(4)步驟(3)處理的精子(2X IO6個/mL)移入ImL受精液中，受精液中含步驟⑵處理的卵母細胞。受精液由BO基礎液添加3. 108g/L碳酸氫鈉、O. 138g丙酮酸鈉、6mg/mL牛血清白蛋白、2mg/mL肝素組成。(5)受精16_18h后，用O. 2%透明質酸酶溶解卵丘細胞1-2分鐘，然后Voatex (漩渦震蕩)，脫除卵丘細胞。(6)將步驟(5)處理的受精卵移入顆粒細胞共培養體系中，每隔48h換1/2體積的培養液，第5天換液時，可觀察到緊實桑椹胚(圖l-Η)、緊實桑椹胚-早期囊胚(圖1-1)，培養168h后收集牦牛胚胎(圖1-K)，培養192h后，可觀察到孵化囊胚(圖1-L)。培養液為基礎液M199添加10%胎牛血清。顆粒細胞共培養體系制備方法采集完卵母細胞后，取檢卵平皿中剩余的含顆粒細胞的卵泡液lmL，加2mL0. 2%透明質酸酶消化3_5min，用等量培養液終止消化后，200g離心5min,沉淀用5mL培養液再次懸浮,200g離心5min,最終的沉淀用培養液懸浮，用移液器將懸浮液加入培養液滴中，其最終濃度為IO6個/mL。本發明不限于以上實施例，按照本發明技術方案的各種組合也是本發明所要保護的內容。
權利要求
1.一種體外生產牦牛胚胎的方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)將采集的牦牛卵巢0-3h內用生理鹽水30-38°C帶回實驗室，用抽吸法獲取卵母細胞置于保存液中； (2)將卵母細胞用成熟液洗滌3次，培養27-28h； (3)牦牛冷凍精液用改良的BO液上浮法處理； (4)步驟(3)處理的精子移入受精液中，受精液中含步驟(2)處理的卵母細胞； (5)受精16-18h后，用O.2%透明質酸酶溶解卵丘細胞l-2min，然后Voatex漩渦震蕩，脫除卵丘細胞； (6)將步驟(5)處理的受精卵移入顆粒細胞共培養體系中，每隔48h換1/2體積的培養液，培養144-168h后收集牦牛胚胎。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述體外生產牦牛胚胎的技術參數為CO2含量5% ;溫度38. 5 0C ;濕度飽和。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中的保存液為PBS液添加聚乙烯醇O. 4mg/mL、牛血清白蛋白3mg/mL。
4.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中卵母細胞成熟液基礎液為Mediuml99,并添加丙酮酸鈉O. 2mmol/L,胎牛血清10%,促黃體素5mg/L,促卵泡素O. 5mg/L,雌二醇 lmg/L。
5.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中上浮法步驟為將1-4支牦牛冷凍精液細管于38°C水浴解凍，解凍后的精液加入盛有I. 0-1. 5mL BO獲能液的離心管底部，在CO2培養箱中傾斜30-45°放置，使精子上浮；上浮Ih后，吸取上清液O. 5-1. 2mL,用洗精液離心洗滌兩次，再用獲能液上浮25-35min ;所述獲能液由BO基礎液添加3. 108g/L碳酸氫鈉、O. 138g/L丙酮酸鈉、IOmM咖啡因、3mg/mL牛血清白蛋白組成；所述BO基礎液由112. OmM氯化鈉、4. 02mM氯化鉀、O. 83mM磷酸二氫鈉、O. 52mM氯化鎂、2. 25mM氯化鈣、13. 9mM葡萄糖及抗生素組成；所述抗生素為75mg/L青霉素+50mg/L鏈霉素；所述0)2培養箱中C02含量5% ;溫度38. 5 0C ;濕度飽和。
6.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中，受精液由BO基礎液添加·3.108g/L碳酸氫鈉、O. 138g丙酮酸鈉、6mg/mL牛血清白蛋白、2mg/mL肝素組成。
7.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟￠)中，培養液為基礎液M199添加10%胎牛血清；顆粒細胞共培養體系制備方法采集完卵母細胞后，取檢卵平皿中剩余的含顆粒細胞的卵泡液ImLjp 2mL0. 2%透明質酸酶消化3_5min，用等量培養液終止消化后，200g離心5min,沉淀用5mL培養液再次懸浮,200g離心5min,最終的沉淀用培養液懸浮，用移液器將懸浮液加入培養液滴中，其最終濃度為IO6個/mL。
全文摘要
本發明公開了一種體外生產牦牛胚胎的方法，由下述時間點控制卵巢保存時間0-3h，卵母細胞成熟時間27-28h，成熟卵母細胞體外受精時間16-18h，受精卵培養時間144-168h。并提供了牦牛卵母細胞成熟液、卵母細胞體外受精液的基本組成，確保體外生產胚胎的質量和效率，防止卵母細胞不完全成熟或多精受精。該技術與方法全面，可完全應用于牦牛胚胎體外生產，能夠有效提高牦牛的繁殖效率，保護牦牛種質資源。
文檔編號C12N5/073GK102703378SQ201210206870
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月12日 優先權日2011年12月6日
發明者丁學智, 包鵬甲, 朱新書, 梁春年, 裴杰, 褚敏, 郭憲, 閻萍 申請人:中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所