專利名稱：一種高產丁醇的重組菌株及其構建方法
技術領域：
本發明屬于微生物工程技術領域，具體涉及一種高產丁醇的重組菌株及其構建方法。
背景技術：
丁醇是一種重要的化工原料，主要用于增塑劑、溶劑、萃取劑等。近年來發現丁醇的熱值、辛烷值與汽油相當，且能與汽油以任意比混合，可以使用現有的石油管道運輸方式，丁醇已成為被世界各國企業和研究機構強烈關注的一種極具潛力的新型生物燃料。丁醇主要有發酵和石油化工合成的方法生產。發酵法是糧食或其它淀粉質農副產品，經水解得到發酵液，然后在丙酮、丁醇梭菌作用下，經發酵制得丙酮、丁醇和乙醇的混合物，通常的比例為3 6 :1，再經精餾得到相應產品。80年代起石油化工業的迅猛發展，發酵法無法與以丙烯為原料的羰基合成法競爭，因此很少采用該方法生產丁醇產品。但是，近年來由于石油價格的飛速上漲，加之石油資源的日益緊缺，導致原油價格的持續上漲，通過石油化工方法生產丁醇、丙酮的成本大大提高，發酵法生產丙酮、丁醇的技術重新顯示出其優勢，特別是發酵法生產丙酮丁醇是以可再生資源替代不可再生的石油基原料制造，符合國家能源安全的長遠戰略。與化學合成法相比，發酵法具有以下優勢I)化工合成法以石油為原料，投資大，技術設備要求高；而微生物發酵法一般以淀粉質、紙漿廢液、糖蜜和木質纖維素等為原料，其工藝設備與酒精生產相似，原料價廉，來源廣泛，設備投資較小；2)發酵法生產條件溫和，一般常溫操作，不需貴重金屬催化劑；3)選擇性好、安全性高、副產物少，易于分離純化；4)降低了對有限石油資源的消耗和依賴。但目前，丁醇發酵缺乏經濟競爭力，其主要原因是1)用作發酵的碳源成本偏高；
2)發酵液中的丁醇濃度低；3)發酵過程中的丁醇選擇性不高。為了解決上述問題，使發酵法在經濟上具有較好的競爭能力，自上世紀六十年代以來，世界各國研究工作者在菌種改造、發酵原料、代謝途徑、產物分離等方面進行了大量研究，我國工作者也對丙酮丁醇發酵進行了一系列探索。
發明內容
本發明的目的是提供一種高產丁醇的重組菌株及其構建方法。本發明將丁醇產生菌的丁醇生物合成途徑的酶的基因克隆進入丙酮丁醇梭菌中，使丁醇生物合成途徑的酶過量表達，以提高丁醇的產量，從而實現了本發明的目的。本發明的高產丁醇的重組菌株是通過以下方法構建的，包括以下步驟將目的片段與表達載體相連得到重組表達質粒，然后將重組表達質粒轉化進入丙 酮丁醇梭菌中，從而得到高產丁醇的重組菌株；所述的目的片段為表達盒EC或丁醇脫氫酶基因bdh ;或表達盒EC、丁醇脫氫酶基因bdh和操縱子Sol中兩者或三者的結合；所述的表達盒EC，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 11所示；所述的操縱子Sol，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 16所示；所述的丁醇脫氫酶基因bdh，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 20所示。所述的表達盒EC具體是將氯霉素啟動子Pcm、β -羥丁酰-Cok脫氫酶基因hbd(其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 12所示)、乙酰-CoA乙酰基轉移酶(硫解酶)基因thl的自身啟動子Pthl、乙酰-CoA乙酰基轉移酶(硫解酶)基因thl (其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 13所示)、β -羥丁酰-CoA脫水酶(巴豆酸酶)基因crt的自身啟動子Pert、β -羥丁酰-CoA脫水酶(巴豆酸酶)基因crt (其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO. 14所示)、丁酰-Cok脫氫酶基因bed (其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 15所示)順序相連，得到表達盒EC。 所述的操縱子Sol具體是將操縱子Sol啟動子Psoll、Psol2、醇脫氫酶基因adhE(其編碼蛋白的序列如SEQ ID NO. 17所示)、酰基-CoA轉移酶基因CtfA (其編碼蛋白的序列如SEQ ID NO. 18所示)、ctfB (其編碼蛋白的序列如SEQ ID NO. 19所示)順序連接，得到操縱子Sol。所述的丁醇脫氫酶基因bdh具體是將丁醇脫氫酶基因bdhA自身啟動子PbdhA、丁醇脫氫酶基因bdhA(其編碼蛋白的序列如SEQ ID NO. 21所示)、bdhB自身啟動子PbdhB、丁醇脫氫酶基因bdhB (其編碼蛋白的序列如SEQ ID NO. 22所示)順序連接，得到丁醇脫氫酶基因bdh。所述的表達載體優選為表達載體pMPl。所述的丙酮丁醇梭菌包括但不限于Clostridium acetobutylicum CICC8008、CICC8011、CICC8012、CICC8016、CICC8017和美國典型微生物菌種保藏中心ATCC所保藏的丙酮丁酉享梭菌(Clostridium acetobutylicum 或 Clostridium saccharobutylacetonicum或 Clostridium beijerinkii)ATCC 824、ATCC 3625、ATCC 4259、ATCC 8529、ATCC 10132、ATCC 25752、ATCC 27021、ATCC 35702、ATCC 39057、ATCC 39058、ATCC 39236、ATCC 43084、ATCC51743、ATCC 55025、ATCC 824D-5、BAA-117。本發明的第二個目的是提供本發明的高產丁醇的重組菌株在以淀粉類或糖類為原料生產丁醇中的應用。本發明的高產丁醇的重組菌株的培養可采用常規方法進行培養，采用典型培養基，其中含有碳源、氮源、礦物質、以及所需要的諸如氨基酸、維生素等微量有機營養物。另夕卜，合成或天然的培養基均可采用。只要菌株可以利用以進行培養，任何碳源和氮源均可采用。就碳源而言，諸如淀粉類、葡萄糖、木糖、甘油、果糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖、纖維素水解液、半纖維素水解液、淀粉水解物、糖蜜等糖類，以及諸如醋酸、檸檬酸等有機酸均可采用。就有機微量營養而言，氨基酸、維生素、脂肪酸、核酸，酵母提取物，麩皮、豆柏、玉米漿、大豆蛋白分解產物等物質均可采用。當某種營養缺陷型突變株的生長需要一種氨基酸或類似的物質時，優先添加該需要營養物。就礦物質而言，磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽、錳鹽等等均可采用。
培養方式為發酵溫度為30 42°C單釜或連續發酵，發酵時間36 108h，培養基中就會積累大量的丁醇。培養結束后，可以釆用常規蒸餾方法從發酵培養基中收集丁醇。利用本發明的方法構建的重組菌株，其能夠表達丁醇產生菌丁醇生物合成基因編碼的丁醇生物合成酶，從而使丁醇生物合成酶的活性提高，菌株的代謝強度得到提高，丁醇的產量和轉化率可得到進一步提高，有利于丁醇的工業化生產，具有廣闊的應用前景。
圖I是丁醇生物合成途徑不意圖，圖中ldh，乳酸脫氫酶lactate dehydrogenase ；pdc，丙酮酸脫羧酶 pyruvate decarboxylase ;hyd，氫化酶 hydrogenase ;pfor，丙酮酸鐵氧化還原蛋白氧化還原酶pyruvate:ferredoxin oxidoreductase ;thl，乙酸-CoA乙酉先基轉移酶(硫解酶)acetyl-CoAacetyltransferase (thiolase) ;hbd，β _ 輕丁酉先-CoA 脫氫酶 β -hydroxybutyryI-CoA dehydrogenase ；crt, β -輕丁酉先-CoA 脫水 酶(巴豆酸酶)3-hydroxybutyryI-CoA dehydratase (crotonase) ;bcd，丁酉先-CoA 脫氫酶 butyryl-CoA dehydrogenase ;aad，乙醒丁醒脫氫酶 Acetaldehyde butyraldehydedehydrogenase;bdhAB, 丁醇脫氣酶 butanol dehydrogenase ；adh,醇脫氫^ 酶alcohol dehydrogenase ;pta，憐酸乙酉先基轉移酶 phosphate acetyl transferase ;ack，乙酸激酶 acetate kinase ；ptb,憐酸丁酸基轉移酶 phosphate butyryltransferase ；buk，丁酸激酶butyrate kinase; CtfAB，乙酉先乙酉先-CoA酉先基-CoA轉移酶acetoacetyl-CoA:acyl-CoAtransferase ;Fd，鐵氧化還原蛋白ferredoxin ;Etf，電子轉移黃素蛋白electron transfer flavoprotein ;AAc，乙酉先乙酸acetoacetate ；AAc-CoAj 乙酉先乙酉先-CoAacetoacetyl-CoA ;Ac/Bu，acetate/butyrate ;Ac-CoA/Bu_CoA，acetyl-CoA/butyryl-CoA ；ox，被氧化的 oxidized ；red,被還原的 reduced. 圖2是重置PCR制備表達盒EC不意圖；圖3是表達載體pMPl圖譜；圖4是重組表達質粒pMPl-EC圖譜；圖5是重組表達質粒pMPl-Sol圖譜；圖6是重組表達質粒pMPl-Bdh圖譜；圖7是重組表達質粒pMPl-Sol-EC圖譜；圖8是重組表達質粒pMPl-EC-Bdh圖譜；圖9是重組表達質粒pMP I-Sol-EC-Bdh圖譜；圖10是重疊PCR制備表達盒EC瓊脂糖凝膠電泳圖，圖中Lane M:DL10，OOODNA Marker;lane l:Pcm_hbd PCR 產物(926bp) ;lane 2:Pthil_thil PCR 產物(1391bp); lane 3:Pcm-hbd-Pthil~thiI PCR 產物(2317bp) ; lane 4:Pcrt-crt-bcd PCR 產物(2117bp) ; lane 5: Pcm-hbd-Pthi l~thi 1-Pcrt-crt-bcd PCR 產物(4434bp)。圖11是重組表達質粒驗證瓊脂糖凝膠電泳圖，圖中Lane M:DL 10，OOODNAMarker; lane I :p IMP IBamHI 單切產物(4695bp) ; lane 2:表達盒 EC PCR 產物(4434bp) ;lane 3:Sol 操縱子 PCR 產物(4755bp) ; lane 4: 丁醇脫氫酶基因 Bdh 基因 PCR產物(2930bp);lane5:pMPl-ECBamHI 單切產物(9129bp) ；lane 6:pIMPl-Sol SmaI 單切產物(9456bp) ；lane7:pIMPl-Bdh BamHI 單切產物(7632bp) ；lane 8:pIMPl-Sol-ECSmaI 單切產物(I389Obp) ;lane9:pMPI-EC-Bdh Sail 單切產物(l2066bp) ；lane10:pIMPI-SoI-EC-Bdh KpnI 單切產物(16827bp) ；lane 11 :pIMPl-Sol-EC SmaI 酶切產物;lane 12:pIMPl-EC-Bdh SmaI 酶切產物；lanel3:pMPl-Sol-EC_Bdh SmaI 酶切產物。
具體實施例方式以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。實施例I :一、表達盒EC、操縱子Sol和丁醇脫氫酶基因bdh的制備。
I) 丁醇產生菌丁醇生物合成途徑的酶的基因的解析及表達盒的制備丁醇生物合成途徑示意圖如圖I所示，丁醇生物合成途徑的酶的基因的表達強度是通過啟動子控制的，本發明采用的啟動子如表I所示。目的基因的獲得以及目的基因與啟動子的融合是通過PCR實現的。表I :所米用啟動子功能區序列
啟動了--35區 -10區RBS
PcmTTGAAATATAATAGGGAGG
FthlTTGATATATAATAGGAGG
PcrtTTGAAATATAATAGGAGG
VsaI \TTGACCTATAATAAGAAG
PsollTTGCAGCCAAATAAGAAG
PbdhATTGTATTAAAATAGGAGG
PbdhBTTGTAATAAAATAGGAGG50 μ L PCR 反應體系包括dNTP 4μ L, IOXPS buffer (Mg2+plus) 5 μ L，正向引物(20 μ mol/L) I μ L，反向引物(20 μ mol/L) I μ L, DNA 模板 100 μ g, PrimeSTAR HSDNAPolymerase 0. 5 μ L, dd H20 補至 50yL。PCR 反應條件94°C預變性 5min ;98°C變性10s，退火15s，72°C延伸，循環30次；72°C延伸IOmin ;4°C保存。PCR實驗中的退火溫度和延伸時間根據引物退火溫度和反應產物的長度設定，具體如表2所示。2)表達盒 EC 的制備是以 Clostridium acetobutylicum ATCC43084 基因組 DNA 為模板通過重疊PCR獲得的，其合成示意圖如圖2所示，具體步驟如下a)第一輪 PCR 分別獲得相應產物 Pcm-hbd、Pthl-thl 和 Pcrt-crt-bcd。以Clostridium acetobutylicum ATCC43084基因組DNA為模板,分別以Pl (其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示)P2 (其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示)、P3 (其核苷酸序列如SEQ IDNO. 3所示)P4 (其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示)和P5 (其核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示)P6 (其核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示)為引物進行PCR，PCR反應體系與步驟I)基本相同，只是引物不同，其反應條件與步驟I)基本相同，只是退火溫度和延伸時間如表2所示,對PCR產物進行電泳和膠回收，由此分別獲得片段Pcm-hbd、Pthil_thl和Pcrt-crt-bcd(其電泳圖如圖10所示)。b)第二輪PCR:將片段Pcm-hbd和Pthl-thl等摩爾比混合，以P1P4為引物進行PCR (PCR反應體系與步驟I)基本相同，只是引物不同，其反應條件與步驟I)基本相同，只是退火溫度和延伸時間如表2所示)，對PCR產物進行電泳和膠回收，由此獲得片段Pcm-hbd-PthI-thI (其電泳圖如圖10所不)。c)第三輪PCR :將片段Pcm-hbd-Pthl-thl和Pcrt-crt-bcd等摩爾比混合，以P1-P6為引物進行PCR (PCR反應體系與步驟I)基本相同，只是引物不同，其反應條件與步驟I)基本相同，只是退火溫度和延伸時間如表2所示)，對PCR產物進行電泳和膠回收，由此獲得片段Pcm-hbd-Pthil-thl-Pcrt-crt-bcd (其電泳圖如圖10所示),經測序，其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 11 所不,將片段 Pcm-hbd-Pthil-thl-Pcrt-crt-bcd 命名為表達盒 EC。重疊PCR制備表達盒EC瓊脂糖凝膠電泳圖如圖10所示。3)操縱子 Sol 的擴增是以 Clostridium acetobutylicum ATCC824 基因組 DNA 為模板，以P7 (其核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示)-P8 (其核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所·示)為引物，進行PCR (PCR反應體系與步驟I)基本相同，只是引物不同，其反應條件與步驟I)基本相同，只是退火溫度和延伸時間如表2所示)，對PCR產物進行電泳(其電泳圖如圖11所示)和膠回收，測序，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 16所示，由此獲得操縱子Sol。4)丁醇脫氫酶基因Bdh基因的擴增是以Clostridium acetobutylicum ATCC43084基因組DNA為模板，以P9 (其核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示)-PlO (其核苷酸序列如SEQID NO. 10所示)為引物，進行PCR (PCR反應體系與步驟I)基本相同，只是引物不同，其反應條件與步驟I)基本相同，只是退火溫度和延伸時間如表2所示)，對PCR產物進行電泳(其電泳圖如圖11所示)和膠回收,測序,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 20所示，由此獲得丁醇脫氫酶基因bdh。表2 =PCR反應相關信息
反應目的正向引物反向引物退火溫度(V)延伸時間(S)產物長度(bp)
擴增 Pcm-hMPlP'，55(U926
擴爾 PtM-MP3P453901391
fMTPcm-hbd-mi-thlPlP453I^U2317
擴增 Pcr -crt-fci/P5P6511%2117
融合
PlP6532704434
Pcm-hhd- thl-thl-Vcrt-crt-hcd
擴增操縱_1^01P7P85330047M
擴增'Γ醇脫氫酶基因Λ*Ρ9PlO53180O二、構建重組表達質粒將PCR獲得的表達盒EC通過SalI和BamHI雙酶切，與同樣經過SalI和BamHI雙酶切的表達載體PMPl相連，得到重組表達質粒pMPl-EC，P IMP I-EC圖譜如圖4所示；
將PCR獲得的操縱子Sol通過SalI單酶切，與同樣經過SalI單酶切的表達載體PlMPl相連，得到重組表達質粒pMPl-Sol，P IMP I-So I圖譜如圖5所示；將PCR獲得的丁醇脫氫酶基因Bdh通過SmaI單酶切，與同樣經過SalI單酶切的表達載體P頂Pl相連，得到重組表達質粒PMPI-Bdh，P IMP I-Bdh圖譜如圖6所示；將PCR獲得的操縱子Sol通過SalI單酶切，與同樣經過SalI單酶切的重組表達質粒pMPl-EC相連，得到重組表達質粒pMPl-Sol-EC，p IMP I-So I-EC圖譜如圖7所示；將PCR獲得的丁醇脫氫酶基因Bdh通過SmaI單酶切，與同樣經過SalI單酶切的重組表達質粒pMPl-EC相連，得到重組表達質粒PMPI-EC-Bdh，PMPI-EC-Bdh圖譜如圖8所示；將PCR獲得的丁醇脫氫酶基因Bdh通過SmaI單酶切，與同樣經過SalI單酶切的重組表達質粒pMPl-Sol-EC相連，得到重組表達質粒PMPI-SoI-EC-Bdh，PMPI-SoI-EC-Bdh圖譜如圖9所示。重組表達質粒驗證瓊脂糖凝膠電泳圖如圖11所示。三、構建重組菌株a)重組表達質粒甲基化修飾將上述重組表達質粒P IMP I-EC, pMPl-Sol、p IMP I-Bdh, p IMP I-So I-EC,p IMP I-EC-Bdh 和 p IMP I-So I-EC-Bdh 分別電轉化到含有質粒 pANl 的 E. coli ER2275中(pANl含有來源于Bacillus subtilis噬菌體Φ 3T的甲基轉移酶Φ 3T I基因)(Mermelstein LD, Papoutsakis ET (1993) In vivo methylation in Escherichia coliby the Bacillus subtilis phage Φ3TImethyl-transferase to protect plasmidsfrom restriction upon transformation of Clostridium acetobutylicum ATCC 824.Appl Environ Microbiol 59:1077 - 1081)。并將轉化后的細胞涂布于含有100 μ g/mL的氨芐青霉素和30 μ g/mL氯霉素的LB平板上，挑取單菌落富集培養，PCR驗證陽性克隆子后，提取陽性克隆子的質粒即為甲基化的重組表達質粒，由此分別得到甲基化的重組表達質粒P IMP I-EC, pMPl-Sol、pMPl-Bdh、p IMP I-So I-EC, p IMP I-EC-Bdh 和 pMPl-Sol-EC-Bdh。b)甲基化的重組表達質粒轉化丙酮丁醇梭菌強化梭菌培養基(RCM)組成(g/L):酵母粉3 ;蛋白胨10 ;牛肉膏10 ;葡萄糖5 ;可溶性淀粉10 ;乙酸鈉3 ；L-半胱氨酸鹽酸鹽O. 5，余量為水，pH6. 8。厭氧的條件下培養丙酮丁醇梭菌C. acetobutylium (用兩種丙酮丁醇梭菌分開做實驗，C. acetobutylium ATCC824 和 C. acetobutyliumATCC43084)至 OD600 值 O. 8 時，4°C、5000rpm離心收集菌體，用預冷的ETB溶液(O. 27mol/L蔗糖，O. 005mol/L磷酸二氫鈉，PH7. 4)洗滌2次，最后用適量ETB溶液懸浮菌體，分裝。將甲基化的重組質粒載體(甲基化的重組表達質粒 pMPl-EC、pIMPl-Sol, p IMP I-Bdh, p IMP I-So I-EC, p IMP I-EC-Bdh 或p IMP I-So I-EC-Bdh )與菌體混合，置于冰上lOmin，然后將混合物轉移至O. 4cm電擊杯進行轉化，電轉化參數為電壓2kV，電容25 μ F，電阻°ο，電擊持續時間13ms。電轉化完畢后立即將菌體轉至RCM培養基中，復壯6-8h，涂布于含有40ug/mL的紅霉素RCM平板上，37°C培養36h出現轉化子。對轉化子按照步驟a)的方法進行PCR驗證陽性克隆子后，即得到含有重 組表達質粒的重組菌株。由此分別獲得含重組表達質粒pMPl_Sol、pMPl-Bdh、pMPl-EC、P IMP I-So I-EC, p IMP I-EC-Bdh 和 pMPl-Sol-EC-Bdh 的重組菌株。
四、重組菌株發酵生產丁醇種子活化培養基質量分數5%的玉米醪。121°C高壓蒸汽滅菌2h。糖發酵培養基質量分數8%的玉米醪與質量分數5%的葡萄糖以3 7的質量比混合定量。115°C高壓蒸汽滅菌40min。分別取4 °C保藏的含重組表達質粒pMPl-Sol、pMPl-Bdh、pMPl-EC、pIMPl-Sol-EC、p IMP I-EC-Bdh 和 pIMPl-Sol-EC-Bdh 的丙酮丁醇梭菌 C. acetobutylium 抱子(C. acetobutylium ATCC824 和 C. acetobutyliumATCC43084)，沸水浴 90s 后迅速用冷水冷卻，以殺死營養體及較弱的孢子。將經過熱處理的孢子接入種子活化培養基(250mL三角瓶裝200ml活化培養基)，37°C恒溫培養12h后即可用于接種糖發酵培養基，然后在糖發 酵培養基中，37°C培養72h，用氣相色譜測定培養物中丁醇、丙酮和乙醇的含量。氣相色譜HP6820 (Hewlett packard corporation，USA)，毛細管色譜柱 Agilet FFAP，氫火焰檢測器。初溫90°C ;終溫2301;升溫速率15°C /min。進樣口溫度200°C，檢測器溫度250°C，進樣量0. 5 μ L，內標物丁醇。測定結果如表3和表4所示表3 C. acetobutylium ATCC824重組菌株的丁醇發酵參數
含的重組表達質粒T醇(g/L) 丙酮(g/L) 乙醇(g/L) 總溶剖(g/L)
-(ATCC824)7.893.470.9412.30
pIMPl-Sol7.803.421.4512.67
pIMPl-Bdh8.343.280.9212,54
pIMPl-EC9.323.180.8413.34
pIMPl-Sol-iEC10.213.06I .OH14.35
pIMPl-EC-Bdh11.632.780.6515.06
pIMPl-Sol-EC-Bdh12.252.650.9515.85表4 C. acetobutylium ATCC43084重組菌株的丁醇發酵參數
含的重組表達質粒 Γ醇(g/L) 丙_ (g/L) 乙醇(g/L) 總溶劑(g/L)
-(ATCC43084)8.933J11.5314.17
pIMPl-Sol8.803.622.2814.70
pIIVlPl-Bdh9.453,731.2414.42
pIMP!-ECiU.75}.()5i.2S15.08
pIMP I-Sol-EC11.822.561.9216.30
pIMP I-EC-Bdh13.922.631.0617.61
pIMPl-Sol-EC-Bdh14.652.42I 318.39
由表3和表4可以看出，轉入了重組表達質粒的重組菌株，除了轉入重組表達質粒pIMPl-Sol的重組菌株，其丁醇產量與野生型的未轉入重組表達質粒的菌株基本一樣夕卜，其他轉入重組表達質粒 P 頂P I-Bdh, P IMP I-EC, pIMP 1-Sol-EC, pIMP I-EC-Bdh 和ρΜΡΙ-Sol-EC-Bdh的重組菌株，其丁醇的產量都得到了很大的提高，差異顯著。雖然轉入重組表達質粒pIMPl-Sol的重組菌株，其丁醇產量與野生型的未轉入重組表達質粒的菌株基本一樣，但是其乙醇產量顯著高于野生型 菌株。
權利要求
1.一種高產丁醇的重組菌株的構建方法，其特征在于，包括以下步驟 將目的片段與表達載體相連得到重組表達質粒，然后將重組表達質粒轉化進入丙酮丁醇梭菌中，從而得到高產丁醇的重組菌株； 所述的目的片段為表達盒EC或丁醇脫氫酶基因bdh ;或表達盒EC、丁醇脫氫酶基因bdh和操縱子Sol中兩者或三者的結合； 所述的表達盒EC，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 11所示； 所述的操縱子Sol，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 16所示； 所述的丁醇脫氫酶基因bdh，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 20所示。
2.根據權利要求I所述的構建方法，其特征在于，所述的表達載體為表達載體pIMPl。
3.根據權利要求I所述的構建方法，其特征在于，所述的丙酮丁醇梭菌為Clostridiumacetobutylicum CICC8008、CICC8011、CICC8012、CICC8016、CICC8017、丙酮丁醇梭菌ATCC 824、ATCC 3625、ATCC 4259、ATCC 8529、ATCC 10132、ATCC 25752、ATCC 27021、ATCC35702、ATCC 39057、ATCC 39058、ATCC 39236、ATCC 43084、ATCC 51743、ATCC 55025、ATCC824D-5 或BAA-117。
4.一種按照權利要求1、2或3所述的高產丁醇的重組菌株的構建方法構建得到的高產丁醇的重組菌株。
5.權利要求4所述的高產丁醇的重組菌株在以淀粉類或糖類為原料生產丁醇中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種高產丁醇的重組菌株及其構建方法。該方法是將目的片段與表達載體相連得到重組表達質粒，然后將重組表達質粒轉化進入丙酮丁醇梭菌中，從而得到高產丁醇的重組菌株；所述的目的片段為表達盒EC或丁醇脫氫酶基因bdh；或表達盒EC、丁醇脫氫酶基因bdh和操縱子Sol中兩者或三者的結合；所述的表達盒EC，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述的操縱子Sol，其核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；所述的丁醇脫氫酶基因bdh，其核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。本發明重組菌株能夠表達丁醇產生菌丁醇生物合成基因編碼的丁醇生物合成酶，從而使丁醇生物合成酶的活性提高，菌株的代謝強度得到提高，丁醇的產量和轉化率可得到進一步提高，有利于丁醇的工業化生產。
文檔編號C12R1/145GK102703493SQ20121020676
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月20日 優先權日2012年6月20日
發明者侯小虎, 張海榮, 熊蓮, 陳新德, 陳雪芳, 黃超 申請人:中國科學院廣州能源研究所