血清microRNA分子標志物及其應用的制作方法

專利名稱：血清microRNA分子標志物及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術與醫學領域，涉及一種血清HIiCT0RNA分子標志物及其應用，尤其涉及一種血清microRNA分子標志物及作為白癜風檢測方面的應用。
背景技術：
白癜風是一種常見的獲得性色素脫失性疾病，臨床表現為皮膚粘膜白斑，病理表現為表皮、粘膜或其他組織內黑素細胞的減少或消失。該病發無定處，但好發于顏面等暴露部位，所及之處皮膚色素完全脫失而成瓷白色，嚴重影響形象美觀，甚至毀損患者容貌，給患者帶來巨大精神痛苦，青少年多發易感，其造成的“毀容”后果，給患者帶來嚴重的心理問題。黑素細胞破壞的機制迄今尚未完全闡明，以往關于白癜風的發病機制的研究主要有以下幾種學說自身免疫學說、黑素細胞自毀學說、氧化應激學說、神經化學因子學說及遺傳學說等。然而，以上任何單一的機制均不能完全解釋白癜風的發病機理。隨著研究和認識 的深入，越來越多的學者認為，黑素細胞受損的啟動及其進程是多種遺傳學和表遺傳學改變積累所致細胞調節和生長失控的多階段復雜過程，是環境因素和遺傳因素共同作用的結果，由于本病的治療相對困難，療程長、收效慢、治愈率低，目前尚沒有滿意的治療方法。因此，預防和探索個體化的治療方案是白癜風疾病控制未來的主要方向，與個體罹患白癜風的易感性、治療反應及與疾病進程和預后相關的分子標志物的研究也日漸成為熱點。microRNA (miRNA)是真核生物中一類長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，在病毒、植物和動物中廣泛存在且進化保守，通過mRNA降解和轉錄后翻譯抑制兩種沉默機制參與基因表達調控。生理狀態下，miRNA表達譜和表達水平具有很強的組織特異性和時相性，機體在病理狀態下，miRNA表達譜和表達水平的變化，破壞了 miRNA對其靶基因原有的調控強度，這可能是miRNA參與疾病發生的關鍵。既往的研究發現miRNA和皮膚腫瘤、炎癥性皮膚病疾病、皮膚自身免疫性疾病、皮膚創傷愈合等發病有關，但目前關于miRNA在白癜風發病中的機制研究仍處于起步階段。常規研究多通過檢測病變組織miRNA表達譜與正常組織差異探究發病機制，其檢測技術復雜、創傷大，難以真正應用于臨床診斷，需找簡便、快捷的miRNA研究方法，對于大規模、快速篩查白癜風發病相關miRNA顯得十分重要。最近研究發現血清/血漿中存在著大量循環的miRNA，不同的疾病狀態miRNA表達譜也不同，而在正常人群中血漿miRNA則很穩定，提示血清/血漿miRNA可作為新的疾病標志物，成為疾病發生機制研究的一個新的切入點，有望應用于疾病的患病風險評估、診斷及治療。

發明內容
為了解決背景技術中存在的上述技術問題，本發明提供了一種血清microRNA分子標志物及其應用。本發明的技術解決方案是本發明提供了一種血清microRNA分子標志物，其特殊之處在于所述血清microRNA分子標志物是hsa-let_7b, miR-15b, miR-16, miR-25,miR-451中任意一個；
其中hsa-let-7b 的序列是UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU ；miR-15b 的序列是UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA ；miR-16 的序列是UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG ；miR-25 的序列是CAUUGCACUU⑶CUCGGUCUGA ；miR-451 的序列是AAACCGUUACCAUUACUGAGUU。
任何一個血清microRNA分子標志物作為檢測白癜風時的應用。任何一個血清mi cr0RNA分子標志物作為制備具有白癜風檢測能力試劑盒的應用。一種具有白癜風檢測能力試劑盒，其特殊之處在于所述具有白癜風檢測能力試劑盒包括反轉錄系統、擴增系統以及引物系統；所述反轉錄系統由E. coli Poly (A) Polymerase (Poly A 加尾酶)、10XPoly(A) Polymerase Buffer (IOXPoly A 加尾反應緩沖溶液)、5XrATP solution (5XATP 溶液)、10 X RT primer (10 X反轉錄引物)、10 X RT Buffer (10 X反轉錄緩沖液)、超純dNTPMixture、RNasin (RNA 酶)、Quant RTase (反轉錄酶)、RNase_freeddH20 組成；所述擴增系統由2XmiRcute miRNA premix、reverse primer (反向引物)組成；所述引物系統由hsa-let_7b, miR_15b, miR-16, miR-25, miR-451 中的任意一個的擴增引物組成其中hsa-let-7b 的正向引物是5’ -CCTGAGGTAGTAGGTTGTGTGGTT-3’miR-15b 的正向引物是5’ -TAGCAGCACATCATGGTTTACA-3’miR-16 的正向引物是5’ -TAGCAGCACGTAAATAITGGCG-3’miR-25 的正向引物是5’ -GCAITGCACTTGTCTCGGTCTG-3，miR-451 的正向引物是5’ -CGAAACCGTTACCATTACTGAGTT-3’。本發明的優點是本發明所提供的血清microRNA分子標志物及其應用，該分子標志物包括hsa-let_7b, miR_15b, miR-16, miR-25, miR-451中任意一個，這些分子標志物都能夠用于檢測白癜風，本發明所提供的血清microRNA分子標志物及其應用中，由于血清具有取材方便，無創傷性，并可連續體外檢測的優點，因此從血清中尋找生物標志物可以將白癜風的早期篩查和診斷提高至一個新的水平；同時，通過實時熒光定量PCR技術對白癜風臨床樣本的血清水平miRNA的檢測，定量準確，相對于芯片技術或者分子雜交技術，改方法簡單快速且經濟實用；第三，該疾病標志物可與其他分子指標相結合，為白癜風篩查，診斷，治療與預后提供新的綜合性試劑盒，方便臨床應用。


圖Ia 是 hsa-let-7b，miR_15b，miR-16, miR-25, miR-451 在白癜風黑素細胞系PIG3V總RNA中的特異性表達電泳圖；圖Ib 是 hsa-let_7b,miR-15b,miR-16,miR-25,miR-451 在白癒風白斑組織總 RNA中的特異性表達電泳圖 Ic 是 hsa-let-7b，miR_15b，miR-16, miR-25, miR-451 在血清總 RNA 中的特異性表達電泳圖；圖2是本發明所提供的血清microRNA表達水平的5 CT值分布圖；圖3是血清中miRNA的Pearson相關性分析；圖4a是本發明所提供的hsa-let_7b miRNA白癜風血清樣本和正常血清樣本經RT-qPCR分析圖；圖4b是本發明所提供的miR_15b miRNA白癜風血清樣本和正常血清樣本經RT-qPCR分析圖；
圖4c是本發明所提供的miR-16miRNA白癜風血清樣本和正常血清樣本經RT-qPCR分析圖；圖4d是本發明所提供的miR_25miRNA白癜風血清樣本和正常血清樣本經RT-qPCR分析圖；圖4e是本發明所提供的miR_451miRNA白癜風血清樣本和正常血清樣本經RT-qPCR分析圖。
具體實施例方式本發明目的在于提出hsa-let_7b, miR_15b, miR-16, miR-25, miR-451 中任意一個能作為白癜風的發生風險的分子標志物應用于醫藥領域，從而提供一種性價比高、易于推廣應用的白癜風外周血診斷方法；hsa-let-7b ；UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU (MIMAT0000063)miR-15b ；UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA (MIMAT0000417)miR-16 ；UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG (MIMAT0000069)miR-25 ;CAUUGCACUU⑶CUCGGUCUGA (MIMAT0000081)miR-451 ；AAACCGUUACCAUUACUGAGUU (MIMAT0001631)本發明還同時提供了上述任何一個血清microRNA分子標志物作為檢測白癜風時的應用，尤其是任何一個血清microRNA分子標志物作為制備具有白癜風檢測能力試劑盒的應用。本發明還同時提供了一種具有白癜風檢測能力的試劑盒，該試劑盒由反轉錄系統，擴增系統和引物系統組成；所述反轉錄系統由E. coli Poly (A) Polymerase>10XPoly (A) PolymeraseBuffer>5XrATP solution、10XRT primer、10XRT Buffer、超純 dNTP Mixture、RNasin、Quant RTase、RNase-free ddH20 組成；所述擴增系統由2 XmiRcute miRNA premix、reverse primer 組成；引物系統由hsa-let_7b, miR_15b, miR-16, miR-25, miR-451 中的任意一個的擴增引物組成hsa-let-7b 的引物是CCTGAGGTAGTAGGITGTGTGGITmiR-15b 的引物是TAGCAGCACATCATGGITTACAmiR-16 的引物是TAGCAGCACGTAAATAITGGCGmiR-25 的引物是GCAITGCACTTGTCTCGGTCTG
miR-451 的引物是CGAAACCGTTACCATTACTGAGIT。在本發明中，具有白癜風檢測能力的試劑盒的使用步驟如下；I)獲取來源于被檢測個體的血液樣本；2)利用特異性的檢測技術檢測樣本中生物標志物的表達；3)判定被檢測個體是否是患有白癜風上述步驟2)中的生物標志物的檢測是對分離的血清或血漿中純化的RNA樣本進行檢測。特異性檢測技術為實時定量PCR技術。本發明通過實驗方法發現了 5條miRNA可作為白癜風早期篩查與臨床診斷的血清 學生物標志物；具體如下UmiRNA在血清中的特異性表達如圖I所示，進過RT-PCR定性檢測及PCR產物序列測定和分析表明，在白癜風黑素細胞系PIG3V總RNA (圖la)，白癜風白斑組織總RNA (圖lb)，血清總RNA (圖Ic)中均檢測到目標 miRNA 的特異性表達，說明 hsa-let_7b,miR-15b,miR-16,miR-25 和 miR-451 等 5種RNA在白癜風黑素細胞系，白癜風白斑組織及血清中均存在，為后續實驗提供基礎。2、miRNA在血清中的個體差異性分析如圖2 所示，hsa-let-7b, miR_15b，miR-16, miR-25 和 miR-451 共 5 條 miRNA 表達水平的S CT值分布較集中。各miRNA表達水平經pearson相關性分析得到R值接近1，P〈0. 05。該結果說明Pearson相關性分析結果可靠,且miRNA的表達在個體間相關性好,個體差異性很小。(圖3)3、臨床白癜風血清樣本的檢測分析如圖4所示，經臨床白癜風血清樣本和正常血清樣本各80例的RT-qPCR分析作圖可得，hsa-let-7b (圖 4a), miR_15b (圖 4b), miR-16 (圖 4c), miR-25 (圖 4d)和 miR-451(圖4e)5條miRNA白癜風血清樣本中檢測所得的S Ct顯著低于正常血清樣本的S Ct值，從而推得該5條miRNA在白癜風血清樣本中的表達顯著高于正常血清樣本。也即該5條miRNA可特異性檢測白癜風，是白癜風發生標志物。且當檢測樣本中hsa-let-7b 8 Ct ^ 8. 46 ；miR-15b 8 Ct ^ 8. 42 ；miR-16 8 Ct ^ 5. 80 ；miR-25 8 Ct ^ 4. 50 ；miR-451 8 Ct ^ 2. 60 時，提示是白癜風患者。為使本發明的目的，技術方案和有點更加清楚，下面通過實施例對本發明進行更加詳細的說明。實施例I :生物標志物及檢測引物本發明提供了一組miRNA 生物標志物，包含 hsa-let-7b,miR-15b,miR-16,miR-25和miR-451。該組生物標志物的具體序列如下hsa-let-7b UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU (SEQ ID NO 1)miR-15b UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA (SEQ ID NO :2)miR-16 UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG (SEQ ID NO :3)miR-25 :CAUUGCACUU⑶CUCGGUCUGA (SEQ ID NO :4)miR-451 AAACCGUUACCAUUACUGAGUU (SEQ ID NO :5)Poly (A)加尾法miRNA經過Poly (A)加尾反應后,利用通用引物反轉錄成cDNA。在PCR擴增過程中，需要針對miRNA的具體序列設計特異性PCR引物，用SYBR-green顯色實時定量地檢測目標miRNA的擴增情況。特異性PCR引物具體信息如下hsa-let-7b CCTGAGGTAGTAGGTTGTGTGGTT (SEQ ID NO :6)miR-15b TAGCAGCACATCATGGTTTACA (SEQ ID NO :7)miR-16 TAGCAGCACGTAAATATTGGCG (SEQ ID NO :8)miR-25 GCATTGCACTTGTCTCGGTCTG (SEQ ID NO :9)miR-451CGAAACCGTTACCATTACTGAGTT (SEQ ID NO :10)實施例2 :實驗材料及實驗試劑本發明中使用白癜風黑素細胞系PIG3V、白癜風白斑組織及20例臨床正常血清樣本(其中包括男性10例、女性10例)、20例臨床白癜風血清樣本。上述均為離體組織。 實驗試劑均為常用的分子生物學試劑,主要有mirVana miRNA Isolation Kit(Catalog#1560,1561, Ambion)試劑盒，Trizol試劑，氯仿,異丙醇，乙醇等常規生化試劑均購于 sigma 公司。E. coli Poly (A) Polymerase>10XPoly (A) Polymerase Buffer >5 XrATP solution、10 X RT primer、10 X RT Buffer> 超純 dNTPMixture、RNasin、QuantRTase^RNase-free ddH20、2 XmiRcute miRNA premix、2XTaq MasterMix^reverse primer均購自QIAGEN公司。實施例3 =Poly (A)加尾法檢測白癜風黑素細胞系、白斑組織及血清中miRNA的表達I、MicroRNA 的提取細胞系和組織microRNA 的提取，按照 mirVana miRNA Isolation Kit(Catalog#1560,1561,Ambion)試劑盒所提供的操作步驟,提取上述細胞系和組織樣本的總RNA，分裝-80 V冰箱凍存，直至檢測。血清中mi croRNA的提取，由于細胞系和組織中可以使用U6作為內參照，而血清中沒有內參照，加入人工合成的線蟲cel-miR-39作為檢測樣本的外參照，200 y L血清中加入 5 u L 濃度為 5fmol/ U L 的 cel-miR-39。混合后按照 mirVana miRNA IsolationKit (Catalog#1560,1561, Ambion)試劑盒所提供的操作步驟,提取上述血清中總RNA,分裝-80 V冰箱凍存，直至檢測。2, miRNA 3’ 末端進行加 Poly (A)處理在3個無RNase的0. 2mL PCR管中分別加入I ii g白癜風PIG3V黑素細胞系總RNA、I u g白斑組織總RNA、I u g血清提取得到的RNA，再依次加入0. 4 y L E. coli Poly(A)Polymerase (5U/ u L), 2 u L IOXPoly (A) Polymerase Buffer, 4 u L 5XrATPsolution,RNase-free ddH20補至總體積20 ii L,混勻離心后,在PCR儀中進行Poly (A)加尾反應,反應參數設置為37°C 60min。3、cDNA 合成分別取上述Poly (A)反應液 2 ii L，再加入 2 ii L 10XRT primer,2u L 10XRTBuffer, I u L 超純 dNTP Mixture (2. 5mM each), IuL RNasin (40U/ u L), 0. 5 u L QuantRTase, RNase-free ddH20補至總體積20 U L,混勻離心后,在PCR儀中進行反轉錄反應,反應參數設置為37°C 60min。得模板cDNA。由于采用Poly(A)加尾法，反轉錄得到的cDNA可以作為通用模板用于檢測miRNA，因此對應白癜風黑素細胞系、白斑組織及血清共有3個模板cDNA。
4、cDNA產物進行PCR擴增反應在0. 2mL PCR 管中依次加入 10 U L 2 X Taq MasterMix, 0. 4 U L reverse primer(IOuM),對應的miRNA特異性正向引物(10 y M)各0. 4 y L，I y L模板cDNA (步驟2所得)和去離子水8. L,總體積為20ii L。混勻離心后在PCR儀中進行擴增反應。反應參數為94°C 2min，循環條件為94°C 15s，60°C 30s, 72°C lmin，共35個循環。反應結束后取4 y L反應液，進行3%瓊脂糖凝膠電泳。電泳結果如圖I所示。圖I中的M代表2000bp DNA Ladder其中最下面一條帶為lOObp。根據該圖，可得知經過RT-PCR定性檢測及PCR產物序列測定和分析表明，在白癜風黑素細胞系PIG3V總RNA，白斑組織總RNA，血清總RNA中均檢測到目標 miRNA 的特異性表達，說明 hsa_let_7b, miR_15b, miR-16, miR-25 和 miR-451 等 5 種miRNA在白癜風黑素細胞系PIG3V，白斑組織，血清中均存在，為后續實驗提供基礎。5、cDNA進行熒光定量PCR
在新的0. 2mL PCR 反應管中依次加入 10 u L 2 XmiRcute miRNA premix,0. 4 u Lreverse primer (lOuM),對應的 miRNA 特異性正向引物(10 u M)各 0. 4 u L, 2 u L 模板cDNA (步驟2所得)和去離子水7. 2 ii L，總體積為20 u L。混勻離心后在RT-qPCR儀中進行擴增反應。反應參數為94°C 2min，循環條件為94°C 20s, 60°C lmin，共40個循環。通過該反應可得該5條基因在不同樣本中的表達量，進而進行后續分析。6、數據處理熒光定量PCR定量檢測miRNA的相對表達變化量時，表達量倍數的變化用公式 RQ=2_S 5CT, 6 6 Ct= 6 Clvitiligo- 6 Clcontrol 其中細胞系和組織中 S
Cl1Vitiligo CTmiR ^TU6
血中 3 CTvitilig0-CTmiE-CTcel_miE_39o 細胞系和組織中 S CTcontrol-CTmiR-CTU6 ;血 ^ 中^ CTcontrol_CTmiR_CTcel—miR—39。 統計學分析采用SPSS16. 0統計分析軟件，Excel2003等數據分析工具，當相對標準誤(STDEV) < 0. 5，p值< 0. 05時，認為結果在統計學上有顯著性差異。如圖3所示,分析內容為miRNA在血清中表達的個體差異性分析。該結果說明miRNA可作為白癜風的生物標志物。實施例4 :利用本發明提供的試劑盒檢測樣本中miRNA的表達—種用于篩查和診斷白癜風病人療效和預后的試劑盒，由擴增系統和引物系統組成。其中，反轉錄系統由Poly (A)加尾酶、反轉錄酶、反轉錄體系緩沖液和RNA酶抑制劑組成；擴增系統由含Taq酶的miRNA表達定量檢測混合液組成；引物系統由hsa_let_7b，miR-15b, miR-16, miR-25和miR-451特異性引物和通用引物組成；具體為反轉錄系統由E. coli Poly (A) Polymerase 加尾酶、IOXPoly (A)Po I ymeraseBuf f er > Quant RTase 反轉錄酶、反轉錄體系 10XRT Buffer 緩沖溶液和 RNase抑制劑組成；擴增系統由含Taq酶的miRNA表達定量檢測混合液組成，包括2XmiRcutemiRNApremix ；引物系統由hsa-let-7b，miR_15b，miR-16, miR-25 和 miR-451 特異性引物和reverse primer通用引物組成，同實施例I中序列。該實施例中，分別以80個健康人和80個白癜風患者血清為樣本，分別用5種不同的microRNA生物標志物進行試驗，從而獲得如圖4所述結果。具體如下
I、血清 microRNA 的提取血清中microRNA的提取,200 UL血清中加入5iiL濃度為5fmol/ ii L的cel-miR-39。混合后按照 mirVana miRNA Isolation Kit (Catalog#1560，1561，Ambion)試劑盒所提供的操作步驟，提取上述血清中總RNA。2, miRNA 3’ 末端進行加 Poly (A)處理在0. 2mL PCR管中加入I y g血清提取得到的RNA，再依次加入0. 4 y L E. coliPoly (A) Polymerase (5U/ U L),2li L 10 X Poly (A) Polymerase Buffer, 4 U L5 XrATPsoIution, RNase-free ddH20補至總體積20 U L,混勻離心后，在PCR儀中進行Poly(A)加尾反應，反應參數設置為37°C 60min。3、cDNA 合成分別取上述Poly (A)反應液 L，再加入 2 ii L IOXRT primer，2 ii L10 X RTBuffer, I u L 超純 dNTP Mixture (2. 5mM each), I u L RNasin (40U/u L),0. 5 u LQuant RTase, RNase-free ddH20補至總體積20 ii L,混勻離心后，在PCR儀中進行反轉錄反應，反應參數設置為37°C 60min。得模板cDNA。4、cDNA進行熒光定量PCR在新的0. 2mL PCR 反應管中依次加入 10 u L 2 XmiRcute miRNA premix,0. 4 u Lreverse primer (lOuM),對應的 miRNA 特異性正向引物(10 u M)各 0. 4 u L, 2 u L 模板cDNA (步驟2所得)和去離子水7. 2 ii L，總體積為20 u L。混勻離心后在RT-qPCR儀中進行擴增反應。反應參數為94°C 2min，循環條件為94°C 20s, 60°C lmin，共40個循環。通過該反應可得該5條基因在不同樣本中的表達量，進而進行后續分析。5、數據處理熒光定量PCR定量檢測所得miRNA的5 Ct值，采用Excel 2003數據分析工具，當相對標準誤(STDEV) < 0. 5，認為結果可靠。如圖4所示，可得5條miRNA在白癜風血清/正常血清樣本中的S Ct值比較分析。分析結果顯示該5條miRNA在白癜風血清樣本中檢測所得的S Ct值顯著低于正常血清樣本的6(^值。從而推得該5條miRNA在白癜風血清樣本中的表達顯著高于正常血清樣本。也即該5條miRNA可特異性檢測白癜風，是白癜風標志物。且當檢測樣本中 hsa-let-7b 8 Ct ^ 8. 46 ；miR-15b 8 Ct ^ 8. 42 ；miR-16 8 Ct ^ 5. 80 ； miR-25 8 Ct ^ 4. 50 ；miR-451 8 Ct ^ 2. 60 時，提示是白癜風患者。
權利要求
1.一種血清microRNA分子標志物，其特征在于所述血清microRNA分子標志物是hsa_let_7b, miR_15b, miR-16, miR-25, miR-451 中任意一個； 其中 hsa-let-7b 的序列是UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU ； miR-15b 的序列是UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA ； miR-16 的序列是UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG ； miR-25 的序列是CAUUGCACUU⑶CUCGGUCUGA ； miR-451 的序列是:AAACCGUUACCAUUACUGAGUU。
2.根據權利要求I所述的任何一個血清microRNA分子標志物作為檢測白癜風時的應用。
3.根據權利要求2所述的任何一個血清microRNA分子標志物作為制備具有白癜風檢測能力試劑盒的應用。
4.一種具有白癜風檢測能力試劑盒，其特征在于所述具有白癜風檢測能力試劑盒包括反轉錄系統、擴增系統以及引物系統； 所述反轉錄系統由 E. coli Poly (A) Polymerase>10XPoly (A) Polymerase Buffer>.5 XrATP solution、10 X RT primer、10 X RT Buffer、超純 dNTP Mixture、RNasin、QuantRTase、RNase-free ddH20 組成； 所述擴增系統由 2XmiRcute miRNA premix、reverse primer 組成； 所述引物系統由hsa-let_7b, miR_15b, miR-16, miR-25, miR-451中的任意一個的擴增引物組成 其中 hsa-let-7b 的正向引物是5’ -CCTGAGGTAGTAGGITGTGTGGIT-3’ ； miR-15b 的正向引物是5’ -TAGCAGCACATCATGGITTACA-3’ ； miR-16 的正向引物是5’ -TAGCAGCACGTAAATAITGGCG-3’ ； miR-25 的正向引物是5’ -GCAITGCACTTGTCTCGGTCTG-3’ ； miR-451 的正向引物是5’ -CGAAACCGTTACCATTACTGAGIT-3’。
全文摘要
本發明涉及一種血清microRNA分子標志物及作為白癜風檢測方面的應用。該血清microRNA分子標志物是hsa-let-7b，miR-15b，miR-16，miR-25，miR-451中任意一個。
文檔編號C12Q1/68GK102757965SQ20121020791
公開日2012年10月31日 申請日期2012年6月21日 優先權日2012年6月21日
發明者李凱, 李春英, 王剛, 石瓊, 郭森, 高天文 申請人:李春英