專利名稱：一種利用三孢布拉氏霉菌發酵制備β-胡蘿卜素的方法
技術領域：
本發明屬于生物發酵技術領域，具體涉及ー種利用三孢布拉氏霉菌發酵制備￠-胡蘿卜素的方法。
背景技術：
￠-胡蘿卜素不僅是VA原，具有預防眼疾、保護視カ的功能，而且還具有抑制細胞變異，抗癌、防癌、抗氧自由基、增強機體抵抗力、維護人體上皮組織正常的生理功能，以及促進兒童生長發育、美容等一系列重要作用，在世界許多國家被廣泛用作食品營養強化劑及添加剤。
目前￠-胡蘿卜素的制備方法主要包括以下幾種(1)天然￠-胡蘿卜素的提取。エ業生產中常從胡蘿卜、玉米、沙棘等富含￠-胡蘿卜素的植物中提取￠-胡蘿卜素。(2)
胡蘿卜素的化學合成。采用有機化工原料，通過化學反應合成￠-胡蘿卜素。3、生物合成法。采用微生物發酵法生產胡蘿卜素，從品質、技術、資源和成本等因素考慮均優于化學合成法。國內外微生物合成￠-胡蘿卜素的研究主要集中在絲狀真菌(三孢布拉氏霉菌)和紅酵母方面。除此之外，也有杜氏鹽藻提取法、螺旋藻提取法以及基因工程法用于￠-胡蘿卜素的生產研究。利用三孢布拉氏霉菌發酵制備的￠-胡蘿卜素是順反式￠-胡蘿卜素混合物，且利用三孢布拉氏霉菌發酵制備的￠-胡蘿卜素的培養基原料為天然物質，無毒無害。而人工合成的￠-胡蘿卜素幾乎全為反式異構體，比如中國專利CN101088989A公開了ー種利用C22 ニ炔多烯化合物為原料，與格氏試劑反應生成雙格氏化合物，所得的雙格氏化合物與2，2，6_三甲基環幾酮反應得到雙去氧￠-胡蘿卜素，其還原反應得到反式￠-胡蘿卜素。還有中國專利CN101081829A公開了ー種由維生素A衍生物與三苯基膦反應得到的有機膦鹽，在氧化劑存在下，進行偶聯反應得到反式￠-胡蘿卜素。又如中國專利CN1291608A公開了用砜的衍生物生產￠-胡蘿卜素的方法。另外，中國專利CN1215723A公開了ー種利用維俤希反應制備類胡蘿卜素的方法。中國專利CN1090271A公開了ー種￠-胡蘿卜素的化學合成方法，其包括三個步驟，由維生素醋酸酯經氫氧化鈉水溶液水解的到VA，在用氧化劑氧化VA得到維生素A醛，最后通過ニ價鈦偶聯維生素A醛而制得反式￠-胡蘿卜素。在生物合成P -胡蘿卜素法方面，中國專利CN101008000A公開了ー種利用粘性紅圓酵母生產￠-胡蘿卜素的方法，包括將粘性紅圓酵母活化、發酵培養一定時間離心得到菌體，采用酸熱法破碎菌體細胞，然后加入石油醚丙酮(1:1)的混合液，28°C震蕩Ih —般可得389ug/g。但在使用該方法制備￠-胡蘿卜素得率太低。另外，中國專利CN1193048A公開了ー種利用孢子接種在氣升發酵罐中培養絲狀真菌發酵制備￠-胡蘿卜素的方法，該エ藝包括一級種子培養和ニ級種子培養及發酵等エ藝，然而發酵培養基中植物油添加量較大，從而造成成本過高
發明內容
鑒于現有技術的不足，本發明的目的在于提供ー種利用微生物生產￠-胡蘿卜素的方法。利用本發明的方法可以獲得成本低、得率高且天然優質的￠-胡蘿卜素產品。為了實現本發明，發明人通過大量試驗反復研究，并終于獲得了如下制備￠-胡蘿卜素的方法
ー種利用三孢布拉氏霉菌發酵制備￠-胡蘿卜素的方法，包括如下步驟
(1)菌種活化在無菌環境下將三孢布拉霉正負菌株分別接種到斜面PDA培養基中，置于培養箱內，28°C培養4d，待三孢布拉霉正負菌株分別長出孢子后，在無菌條件下，用無菌生理鹽水將斜面培養基中孢子刮洗下來，并配制成均勻的孢子懸液，使正負菌孢子懸液的濃度分別達到正菌IO3個孢子/mL，負菌IO4個孢子/mL ；
(2)種子培養將正負菌分別以孢子懸液的方式接種到種子培養基中，種子培養基裝在 250mL的三角瓶中，裝液量50mL，培養溫度為28°C，轉速200 r/min，正菌培養時間為20h，負菌培養時間為24小時，得到三孢布拉霉正負菌株種子液；
(3)發酵培養將達到對數生長期的正負菌種子液按1:5的比例在無菌的條件下混合，再以1%_10%的接種量接入發酵培養基中培養144-168h ;所述發酵培養基的配制方法為取40. 8克麩皮，加入IOOOmL自來水，煮沸lh，雙層紗布過濾，濾液定容到IOOOmL得到麩皮浸出液；取IOOmL麩皮浸出液，加入麥芽糖7. 16克、硫酸鎂0. 04克，大豆粉I克，KH2PO4 0. 2克，大豆油I克，VB10. 001克，即得；
(4)^ -胡蘿卜素提取將發酵培養后的培養物過濾洗清，-70°C 50°C恒溫真空干燥過夜，得到干菌體，用研磨法粉碎細胞，加入體積比為I :1的丙酮-石油醚混合液后研磨萃取，直至菌體無色為止，過濾萃取后的上清液，得萃取液，結晶，干燥。優選地，步驟(3)的發酵培養為搖瓶中發酵培養，接種量為6%，在溫度為28°C，初始pH為6. 5，搖床轉速為200 r/min，裝液量50 mL/250 mL三角瓶條件下，震蕩培養144-168h。優選地，步驟(3)的發酵培養為IOL機械攪拌發酵罐培養，裝液量為6-7L，轉速為100-200rpm,通氣量為I. 5-2. 0 VVM,罐壓0. 03-0. 06MPa,滅完菌pH為6-7,罐溫26-28°C，三孢布拉氏霉正負菌種子液按1:5，接種量為6%-10%，發酵35_40h后加入濃度為
0.l%-0. 5%^ -紫羅蘭酮，培養時間為144-168h。優選地，步驟(3)的發酵培養為100L機械攪拌發酵罐培養，裝液量為50-60 L，轉速為0 rpm，通氣量為I ”] ，罐壓0.03-0.0610^，滅完菌？11為6-7，罐溫26-28で，三孢布拉氏霉正負菌種子液按1:5接入，接種量為1%_3%，發酵35-40h后加入濃度為
0.l%-0. 5%^ -紫羅蘭酮，培養時間為144-168h。優選地，步驟(2)的種子培養基配方為(W/V)::玉米粉3%、大豆粉3%、KH2PO40. 1%, MgSO4 0.02%、Vbi 0.001%、pH 6.5。進ー步優選地，所述三孢布拉氏霉菌為三孢布拉氏霉正菌ATCC 14271 ( + )和三孢布拉氏霉負菌ATCC 14272 (_)。與現有技術相比，本發明利用三孢布拉氏霉菌發酵制備￠-胡蘿卜素的方法具有如下優點和顯著的進步性
I)成本低。本方法加入了較低量的植物油，節省了成本與資源。所采用的培養基均為天然無毒無害的基質，且使用了廉價的農副產品(麩皮浸出液)，培養基固形物含量低(大豆粉 1%)。2)得率高。利用本發明的エ藝方法獲得了較高的￠-胡蘿卜素得率(干菌絲體含量)2%-5%。
圖I利用三孢布拉氏霉菌發酵制備P -胡蘿卜素的流程エ藝圖。
具體實施例方式以下通過實施例形式對本發明的上述內容再作進ー步的詳細說明，但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實施例，凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。實施例一搖瓶中發酵培養制備富含P -胡蘿卜素菌株
1.菌株
三孢布拉氏霉菌ATCC 14271 ( + )和ATCC 14272 (-)
2.培養基
I)斜面PDA培養基的制備及組成取新鮮未發芽的土豆200g,去皮,切成3mmX3mm的塊狀，加入800-1000ml水，煮沸30min，然后用紗布過濾，濾液中加入蔗糖(或葡萄糖)20g，瓊脂15-20g，溶化后補水至1000ml，自然pH，分裝到試管中(每管51111)，121で滅菌301^11，制成斜面。2)種子培養基配方為(W/V):玉米粉 3%、大豆粉 3%、KH2P04 0. l%、MgS04 0 . 02%、VB1
0.001%、pH 6. 5。3)麩皮浸出液的制備方法取40. 8克麩皮，加入IOOOmL自來水，煮沸lh，雙層紗布過濾，濾液定容到IOOOmL得到麩皮浸出液。4)發酵培養基的配方取IOOmL麩皮浸出液，加入麥芽糖7. 16克、硫酸鎂0. 04克，大豆粉I克，KH2PO4O. 2克，大豆油I克，VB10. 001克。3.菌種活化
在無菌環境下將三孢布拉霉正負菌株分別接種到斜面PDA培養基中，置于培養箱內，28°C培養4d，待三孢布拉霉正負菌株分別長出孢子后，在無菌條件下，用無菌生理鹽水將斜面培養基中孢子刮洗下來，并配制成均勻的孢子懸液，使正負菌孢子懸液的濃度分別達到正菌IO3個孢子/mL，負菌IO4個孢子/mL。4.種子擴大培養
將正負菌分別以孢子懸液的方式接種到種子培養基中，種子培養基裝在250mL的三角瓶中，裝液量50mL，培養溫度為28°C，轉速200 r/min，正菌培養時間為20h，負菌培養時間為24小時，得到三孢布拉霉正負菌株種子液。5.發酵培養
將達到對數生長期的正負菌種子液按1:5的比例在無菌的條件下接入到發酵培養基，接種量為6%，在溫度為28°C，初始pH為6. 5，搖床轉速為200 r/min,裝液量50mL/250 mL三角瓶條件下，震蕩培養144-168h。6.菌絲體干重及色素測量培養完畢后將培養物用2層紗布過濾洗清，恒溫真空干燥過夜(_70°C )，秤重，得到菌體干重。收集發酵液中的菌體，經恒溫干燥后得到干菌體，用研磨法粉碎細胞，精確稱取
0.Olg左右菌體，加入I 1 (V:V)丙酮石油醚混合液少許，在研缽中研磨，萃取直至菌體無色為止，用濾紙過濾萃取后的上清液，收集濾液并記錄萃取液體積。然后用石油醚將萃取液稀釋，根據￠-胡蘿卜素的特征吸收波長在450nm條件下，用分光光度法測定并利用回歸方程計算出￠-胡蘿卜素含量。7.結果
1)菌絲體干重32.5g/L 2)￠-胡蘿卜素含量2.6%
實施例ニ IOL機械攪拌發酵罐中發酵培養制備富含￠-胡蘿卜素菌株
1.菌株
三孢布拉氏霉菌ATCC 14271 ( + )和ATCC 14272 (-)
2.培養基
I)斜面PDA培養基的制備及組成取新鮮未發芽的土豆200g,去皮,切成3mmX3mm的塊狀，加入800-1000ml水，煮沸30min，然后用紗布過濾，濾液中加入蔗糖(或葡萄糖)20g，瓊脂15-20g，溶化后補水至1000ml，自然pH，分裝到試管中(每管51111)，121で滅菌301^11，制成斜面。2)種子培養基配方為(W/V):玉米粉 3%、大豆粉 3%、KH2P04 0. l%、MgS04 0 . 02%、VB1
0.001%、pH 6. 5。3)麩皮浸出液的制備方法取40. 8克麩皮，加入IOOOmL自來水，煮沸lh，雙層紗布過濾，濾液定容到IOOOmL得到麩皮浸出液。4)發酵培養基的配方取IOOmL麩皮浸出液，加入麥芽糖7. 16克、硫酸鎂0. 04克，大豆粉I克，KH2PO4O. 2克，大豆油I克，VB10. 001克。3.菌種活化
在無菌環境下將三孢布拉霉正負菌株分別接種到斜面PDA培養基中，置于培養箱內，28°C培養4d，待三孢布拉霉正負菌株分別長出孢子后，在無菌條件下，用無菌生理鹽水將斜面培養基中孢子刮洗下來，并配制成均勻的孢子懸液，使正負菌孢子懸液的濃度分別達到正菌IO3個孢子/mL，負菌IO4個孢子/mL。4.種子擴大培養
將一定量的正負菌分別以孢子懸液的方式接種到種子培養基中，種子培養基裝在250mL的三角瓶中，裝液量50mL，培養溫度為28°C，轉速200 r/min，正菌培養時間為20h，負菌培養時間為24小時，得到三孢布拉霉正負菌株種子液。5.發酵培養
在IOL機械攪拌發酵罐中將種子培養基接入發酵罐中，裝液量為6-7L，轉速為100-200rpm,通氣量為 I. 5-2. 0 VVM,罐壓 0. 03-0. 06MPa,滅完菌 pH 為 6-7,罐溫 26-28°C，正負菌種子液按1:5接入，接種量為8%，發酵35-40h后加入濃度為0. 3% ^ -紫羅蘭酮，培養時間為144-168h。6.菌絲體干重及色素測量
培養完畢后將培養物用2層紗布過濾洗清，恒溫(50°C)真空干燥過夜，秤重，得到菌體干重。收集發酵液中的菌體，經恒溫干燥后得到干菌體，用研磨法粉碎細胞，精確稱取0. Olg左右菌體，加入I 1 (V:V)丙酮石油醚混合液少許，在研缽中研磨，萃取直至菌體無色為止，用濾紙過濾萃取后的上清液，收集濾液并記錄萃取液體積。然后用石油醚將萃取液稀釋，根據￠-胡蘿卜素的特征吸收波長在450nm條件下，用分光光度法測定并利用回歸方程計算出￠-胡蘿卜素含量。7.結果
1)菌絲體干重26.5g/L
2)￠-胡蘿卜素含量3. 1%
實施例三100L機械攪拌發酵罐中發酵培養制備富含￠-胡蘿卜素菌株
1.菌株三孢布拉氏霉菌ATCC 14271 ( + )和ATCC 14272 (-)
2.培養基
I)斜面PDA培養基的制備及組成取新鮮未發芽的土豆200g,去皮,切成3mmX3mm的塊狀，加入800-1000ml水，煮沸30min，然后用紗布過濾，濾液中加入蔗糖(或葡萄糖)20g，瓊脂15-20g，溶化后補水至1000ml，自然pH，分裝到試管中(每管51111)，121で滅菌301^11，制成斜面。2)種子培養基配方為(W/V):玉米粉 3%、大豆粉 3%、KH2P04 0. l%、MgS04 0 . 02%、VB1
0.001%、pH 6. 5。3)麩皮浸出液的制備方法取40. 8克麩皮，加入IOOOmL自來水，煮沸lh，雙層紗布過濾，濾液定容到IOOOmL得到麩皮浸出液。4)發酵培養基的配方取IOOmL麩皮浸出液，加入麥芽糖7. 16克、硫酸鎂0. 04克，大豆粉I克，KH2PO4O. 2克，大豆油I克，VB10. 001克。3.菌種活化
在無菌環境下將三孢布拉霉正負菌株分別接種到斜面PDA培養基中，置于培養箱內，28°C培養4d，待三孢布拉霉正負菌株分別長出孢子后，在無菌條件下，用無菌生理鹽水將斜面培養基中孢子刮洗下來，并配制成均勻的孢子懸液，使正負菌孢子懸液的濃度分別達到正菌IO3個孢子/mL，負菌IO4個孢子/mL。4.種子擴大培養
將一定量的正負菌分別以孢子懸液的方式接種到種子培養基中，種子培養基裝在250mL的三角瓶中，裝液量50mL，培養溫度為28°C，轉速200 r/min，正菌培養時間為20h，負菌培養時間為24小時，得到三孢布拉霉正負菌株種子液。5.發酵培養
在100L機械攪拌發酵罐中將種子培養基接入發酵罐中，裝液量為50-60L，轉速為Orpm，通氣量為I ”] ，罐壓0.03-0.0610^，滅完菌？11為6-7，罐溫26-28で，正負菌種子液按1:5接入，接種量為2%，發酵35-40h后加入濃度為0. 3%^-紫羅蘭酮，培養時間為144-168h。6.菌絲體干重及色素測量
培養完畢后將培養物用2層紗布過濾洗清，恒溫(_70°C)真空干燥過夜，秤重，得到菌體干重。收集發酵液中的菌體，經恒溫干燥后得到干菌體，用研磨法粉碎細胞，精確稱取0.Olg左右菌體，加入I 1 (V:V)丙酮石油醚混合液少許，在研缽中研磨，萃取直至菌體無色為止，用濾紙過濾萃取后的上清液，收集濾液并記錄萃取液體積。然后用石油醚將萃取液稀釋，根據￠-胡蘿卜素的特征吸收波長在450nm條件下，用分光光度法測定并利用回歸方程計算出￠-胡蘿卜素含量。7.結果
1)菌絲體干重21.5g/L
2)￠-胡蘿卜素含量4. 8%。
權利要求
1.一種利用三孢布拉氏霉菌發酵制備￠-胡蘿卜素的方法，其特征在于包括如下步驟 (1)菌種活化在無菌環境下將三孢布拉霉正負菌株分別接種到斜面PDA培養基中，置于培養箱內，28°C培養4d，待三孢布拉霉正負菌株分別長出孢子后，在無菌條件下，用無菌生理鹽水將斜面培養基中孢子刮洗下來，并配制成均勻的孢子懸液，使正負菌孢子懸液的濃度分別達到正菌IO3個孢子/mL，負菌IO4個孢子/mL ； (2)種子培養將正負菌分別以孢子懸液的方式接種到種子培養基中，種子培養基裝在250mL的三角瓶中，裝液量50mL，培養溫度為28°C，轉速200 r/min，正菌培養時間為20h，負菌培養時間為24小時，得到三孢布拉霉正負菌株種子液； (3)發酵培養將達到對數生長期的正負菌種子液按1:5的比例在無菌的條件下混合，再以1%_10%的接種量接入發酵培養基中培養144-168h ;所述發酵培養基的配制方法為取40. 8克麩皮，加入IOOOmL自來水，煮沸lh，雙層紗布過濾，濾液定容到IOOOmL得到麩皮浸出液；取IOOmL麩皮浸出液，加入麥芽糖7. 16克、硫酸鎂0. 04克，大豆粉I克，KH2PO4 0. 2克，大豆油I克，VB10. 001克，即得； (4)￠-胡蘿卜素提取將發酵培養后的培養物過濾洗清，-700C 50°C，恒溫真空干燥過夜，得到干菌體，用研磨法粉碎細胞，加入體積比為I :1的丙酮-石油醚混合液后研磨萃取，直至菌體無色為止，過濾萃取后的上清液，得萃取液，結晶，干燥。
2.根據權利要求I所述利用三孢布拉氏霉菌發酵制備P-胡蘿卜素的方法，其特征在于步驟(3)的發酵培養為搖瓶中發酵培養，接種量為6%，在溫度為28°C，初始pH為6. 5，搖床轉速為200 r/min，裝液量50 mL/250 mL三角瓶條件下，震蕩培養144_168h。
3.根據權利要求I所述利用三孢布拉氏霉菌發酵制備P-胡蘿卜素的方法，其特征在于步驟(3)的發酵培養為IOL機械攪拌發酵罐培養，裝液量為6-7L，轉速為100-200rpm，通氣量為I. 5-2. 0 VVM，罐壓0. 03-0. 06MPa，滅完菌pH為6-7，罐溫26_28°C，三孢布拉氏霉正負菌種子液按1:5，接種量為6%-10%，發酵35-40h后加入濃度為0. 1%-0. 5%P -紫羅蘭酮，培養時間為144-168h。
4.根據權利要求I所述利用三孢布拉氏霉菌發酵制備￠-胡蘿卜素的方法，其特征在于步驟(3)的發酵培養為100L機械攪拌發酵罐培養，裝液量為50-60 L，轉速為0 rpm，通氣量為I VVM，罐壓0. 03-0. 06MPa，滅完菌pH為6-7，罐溫26-28°C，三孢布拉氏霉正負菌種子液按1:5接入，接種量為1%_3%，發酵35-40h后加入濃度為0. 1%-0. 5% P -紫羅蘭酮，培養時間為144-168h。
5.根據權利要求I所述利用三孢布拉氏霉菌發酵制備￠-胡蘿卜素的方法，其特征在于步驟(2)的種子培養基配方為(W/V)::玉米粉3%、大豆粉3%、KH2PO4 0. 1%、MgSO40.02%、Vbi 0. 001%、pH 6. 5。
6.根據權利要求1-5任一項所述利用三孢布拉氏霉菌發酵制備￠-胡蘿卜素的方法，其特征在于所述三孢布拉氏霉菌為三孢布拉氏霉正菌ATCC 14271 ( + )和三孢布拉氏霉負菌ATCC 14272 (_)。
全文摘要
本發明公開了一種利用三孢布拉氏霉菌發酵制備β-胡蘿卜素的方法，包括將三孢布拉氏霉菌ATCC14271(+)和ATCC14272(-)活化后，經過種子培養，在優選的發酵工藝條件下按一定的接種量和接種比接入發酵培養基中發酵，最終得到β-胡蘿卜素含量較高的菌絲體。采用本發明的方法可以獲得成本低、效價高且天然優質的β-胡蘿卜素產品。
文檔編號C12R1/645GK102757995SQ20121020889
公開日2012年10月31日 申請日期2012年6月25日 優先權日2012年6月25日
發明者林建國, 王常高, 胡瑛, 蔡俊, 顏作文 申請人:湖北工業大學