專利名稱：采用特異性引物pcr檢測鼓槌石斛的方法
技術領域：
本發明涉及鼓槌石斛的分子生物學檢測，具體地說，涉及一種采用特異性引物PCR檢測鼓槌石斛的方法。
背景技術：
石斛，《山海經》已有記載，《本經》中被列為上品，是我國名貴的中藥材。性甘，微寒，歸胃、腎經，具有益胃生津，滋陰清熱的功效。《中國藥典》(2010版)收載的石斛為金釵石斛(Dendrobium nobile Lindl.)、鼓植石斛(Dendrobium chrysotoxum Lindl.)、流蘇石斛(Dendrobium fimbriatum Hook.)的栽培品種及其同屬植物近似種的新鮮或干燥莖。現代藥理研究表明，石斛中含有多糖等多種成分，對消化系統具有促進作用，以及抗衰老與免疫調節、抗腫瘤、治療白內障等多種作用。鼓槌石斛在中藥制藥以及花卉(又名金弓石斛)觀賞方面都有重要應用。鼓槌石斛中含有毛蘭素等多種成分，在抗癌、抗腫瘤方面效果明顯。但石斛屬種類繁多，僅供藥用的石斛屬植物就有39種。而且遍布各地有很多的習用品以及混偽品，如金石斛屬、石豆蘭屬、石仙桃屬等多個種。由于石斛的近似種以及混偽品過多，針對石斛的基源和藥材進行過深入的研究。傳統的鑒定方法包括基源鑒定、性狀鑒定、顯微鑒定以及理化鑒定等，現代的鑒別方法包括色譜法、質譜法、核磁共振法、差熱分析法、掃描電鏡技術、電泳等。鼓槌石斛與石斛屬內其它種性狀相似，形態學以及一些理化方法很難準確的鑒別其基源。而隨著現代分子生物學的研究深入和發展，一些分子標記技術如限制性片段長度多態性(RFLP)、隨機擴增多態DNA (RAPD)、ISSR標記、AFLP技術等得到了廣泛的應用，但它們也存在很多的不足。RFLP技術穩定、重復性強，但探針制備繁瑣；RAPD方法可以很好的揭示親緣物種間的演化關系，但不穩定，受實驗條件限制較大；ISSR標記具有快速、簡便、多態性高等優點，但其引物通用性差、擴增條件等需要針對性的設計；AFLP技術將RFLP和PCR技術完美結合，但其穩定性較差,且對操作者要求高、花費大。本發明結合以上方法和技術的優點，依據分子標記技術的原理和原則，設計出一個特異性的引物，并改良了 PCR反應的條件，目的是提出一種特異性鑒定鼓槌石斛的分子鑒別方法，為鼓槌石斛的藥材鑒別提供分子鑒定依據，并希望得到廣泛的實際應用推廣。
發明內容
本發明的目的是提供一種可快速、準確地檢測鼓槌石斛的特異性引物及含有該引物的試劑盒。本發明的另一目的是提供采用上述特異性引物PCR檢測鼓槌石斛的方法。為了實現本發明目的，本發明的一種鼓槌石斛(Dendrobium chrysotoxumLindl.)的PCR檢測特異性引物對，其包括上游引物F :5’ -CAAAGGATGGACGAACCCA-3’和下游引物 R :5’ -CGCAGCCAACGAGATGAIT-3’。本發明還提供含有上述PCR引物對的用于檢測鼓槌石斛的試劑盒。、
前述試劑盒中還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應緩沖液中的一種或多種。更優選地，前述試劑盒還包括標準陽性模板。本發明還提供所述試劑盒在檢測鼓槌石斛中的應用。本發明進一步提供采用上述特異性引物PCR檢測鼓槌石斛的方法，包括以下步驟I)提取樣品中的DNA ; 2 )以步驟I)中提取的DNA為模板，使用上述引物F和R，進行PCR擴增反應；3)分析PCR產物，即對上述擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據電泳檢測結果判定樣品中是否含有鼓槌石斛。其中，PCR反應體系以26 ill計為
模板 DNA3 jil
2.5fiM dNTPs2[,Li
2.5pM 引物FIliI
2.5pM 引物RUii
5U/j.ii Taq DNA聚合酶 Dye染料2 pi
10 x PCR反應緩沖液2.5叫
25mmol/'.L Mg2+2 Lil
ddH20補足至 26,uLPCR 反應條件為94°C 5min ；94°C lmin，58°C lmin，72°C I. 55min，共 30 個循環；72 °C 7 min。擴增反應結束后，若電泳檢測結果出現約400bp的DNA條帶,則該樣品含有鼓槌石斛。本發明基于鼓槌石斛的ITS序列，設計出可快速檢測鼓槌石斛的特異性引物，并在此基礎上建立了 PCR檢測體系，并改良了 PCR反應條件，使退火溫度增至58°C，為鼓槌石斛的藥材鑒別提供了分子鑒定依據，可從多種藥材中快速、準確地檢測出鼓槌石斛。根據該方法構建的檢測試劑盒操作簡便，特異性好，靈敏度高，可實現對鼓槌石斛的莖、葉或植物其它部位以及藥材的檢測，適于廣泛的推廣使用。
圖I為利用本發明設計的特異性引物對進行PCR檢測，鑒定鼓槌石斛及石斛屬其他種的電泳結果；其中，1-6為鼓槌石斛；7-12為金釵石斛；13-18為流蘇石斛；19-21為鐵皮石斛；22-23為球花石斛；24-25為重唇石斛；26_27為流蘇金石斛；28_29為細莖石斛；30為齒瓣石斛；31為束花石斛；32為美花石斛；33為細葉石斛；34為疊鞘石斛；35為密花石斛；CK為空白對照；M為DNA marker。圖2為本發明特異性引物對的靈敏度檢測電泳結果；其中，1-3DNA模版濃度為0.69ng/ u I ;4-6DNA 模版濃度為 I. 38ng/ u I ;7_9DNA模版濃度為 2. 07ng/ u I ;CK 為空白對照，M 為 DNA marker。圖3為利用本發明的特異性引物PCR檢測市售鼓槌石斛樣品的電泳結果；其中，1-4及9-12有擴增條帶，顯示為陽性，鑒定為鼓槌石斛；其他無擴增條帶，顯示為陰性，鑒定樣品不是鼓槌石斛；CK為空白對照，M為DNA marker0
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，以下實施例均按照常規實驗條件，如Samtoook等分子克隆實驗手冊(New York:Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的操作技術規程，或按照制造廠商所建議的實驗條件；所用原料均為市售商品。 實施例I用于檢測鼓槌石斛的PCR引物的合成從GenBank中共獲得鼓槌石斛、金釵石斛、流蘇石斛、鐵皮石斛等石斛屬ITS序列170條，利用生物學軟件MEGA 5.0對比上述序列，找出鼓槌石斛所有不同于其他種的變異位點。根據變異位點的位置，分別在ITS序列的上、下游各設計約20個堿基的引物；利用生物學軟件DNAMAN對設計的引物進行分析，最終確定合適的引物對，上游引物F5’ -CAAAGGATGGACGAACCCA-3’ 和下游引物 R5’ -CGCAGCCAACGAGATGATT-3 ’。引物合成由諾賽公司完成。實施例2利用PCR引物檢測鼓槌石斛的特異性和靈敏度分析I. I樣本來源本實施例中采用的石斛包括鼓槌石斛、金釵石斛、流蘇石斛、鐵皮石斛、球花石斛、重唇石斛、流蘇金石斛、細莖石斛、齒瓣石斛、美花石斛、細葉石斛、疊鞘石斛、束花石斛、密花石斛，分別購自四川雅安、云南瑞麗、廣西百色、貴州赤水、云南思茅、云南西雙版納等地。1.2DNA 提取將上述樣品，每個樣品取約30mg，加入滅菌小鋼珠，用磨樣機磨成粉末，利用試劑盒法提取DNA。試劑盒購自TianGen公司，型號為植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)200prepsoI. 3樣品DNA的梯度稀釋檢測上述提取的鼓槌石斛樣品的DNA濃度，為20. 7ng/ yl。將DNA樣品進行梯度稀釋，稀釋后的濃度分別為0. 69ng/ u l、1.38ng/iil、2. 07ng/yl，于_20°C保存備用。I. 4PCR 反應反應體系(26ii I):模板 DNA3 |il
2.5|liM dNTPs2j.il
2.5pM 引物FIpl 2.5pM 引物 R I jil
5U/^I Taq DNA聚合酶0.20
Dye染料2pl
10 x PCR反應緩沖液2.5^1
25mmoi/L Mg~+2^il
ddH20補足至 26jil。PCR 反應條件為94°C 5min ；94°C lmin, 58 °C lmin, 72 °C I. 55min，共 30 個循環；72 °C 7min。I. 5 結果取擴增產物L，在1%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，電壓為140V，35分鐘后在紫外光下檢測電泳結果，如果出現約400bp的條帶，則證明所檢樣品為鼓槌石斛。電泳檢測結果如圖I所示，泳道1-6為鼓槌石斛樣品，均能擴增出約400bp的DNA條帶，而同屬其他種、則未出現條帶。上述結果表明實施例I中設計的引物特異性強。分別以上述稀釋的DNA樣品為模板進行PCR擴增反應。PCR擴增程序和擴增產物檢測方法同上(點樣量為L)。結果如圖2所示，當DNA模板被稀釋至0. 69ng/ U I時，條帶不明顯。因此，該引物對鼓槌石斛的檢測靈敏度可達0.69ng/iU，即可檢出樣品中約
2.07ng的鼓槌石斛，檢測靈敏度高。實施例3利用PCR引物檢測市售的鼓槌石斛樣品I. I從市場上收集16種不同的石斛樣品，每個樣品取約30mg，加入滅菌小鋼珠，用磨樣機磨成粉末，利用試劑盒法提取DNA。試劑盒購自TianGen公司，型號為植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)200preps。I. 2 使用 ITS 通用引物 ITS 5F :5’ -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’ 和 ITS 4R 5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’分別進行PCR檢測提取的各DNA樣品的質量。
PCR反應體系模板 DNA3 ^il
2.5f.iM dNTPs2‘li1
2.5|iM 引物 ITS5FI |il
引物 1TS4RUlI
5U/f,il Taq DMA聚合醻0.2^1
Dye染料2u\
10 x PCR反應緩沖液2.5^1
25nrmol/L Mg;.-2f.il
CkiH2O補足至 26i_il。PCR 反應條件為94°C 5min ；94°C lmin，50°C lmin，72°C I. 55min，共 30 個循環；72 °C 7min。設置空白對照，DNA模板用等量ddH20代替，證明DNA的質量達到檢測的要求，并確定了合適的DNA模板量為3 ii L。I. 3利用實施例I設計的特異性引物F和R，對16個樣品的總DNA進行PCR擴增，PCR反應體系和擴增條件如下PCR 反應體系(26 ill):
模板 DNA3 jil
2.5mM dNTPs2iLil
2.5jiM引物FI卩I
2.5jiM 引物RIjil
5U/jil Taq DNA聚合酶0.2^1
Dye染料2^1
IOxPCR反應緩沖液2.5叫
25rnnioI/L Mj +2‘u.l
CidH2O撲足至 26pl。PCR 反應條件為94°C 5min ；94°C lmin，58°C lmin，72°C I. 55min，共 30 個循環；72 °C 7min。I. 4取PCR擴增產物，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結束后在凝膠成像儀上檢測結果。結果如圖3所示，16個樣品中，泳道1-4及9-12出現約400bp的擴增條帶，結果顯示為陽性。其余結果呈陰性，表明1-4及9-12泳道對應的樣品為鼓槌石斛，其余樣品不是鼓槌石斛。經鑒定，5-8泳道對應的樣品為金釵石斛，13-16泳道對應的樣品為流蘇石斛。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
權利要求
1.鼓槌石斛(Dendrobiumchrysotoxum Lindl.)的PCR檢測特異性引物對,其特征在于，其包括 上游引物 F :5’ -CAAAGGATGGACGAACCCA-3’ 和 下游引物 R :5’ -CGCAGCCAACGAGATGAIT-3’。
2.含有權利要求I所述引物對的用于檢測鼓槌石斛的試劑盒。
3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反應緩沖液中的一種或多種。
4.根據權利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標準陽性模板。
5.采用權利要求I所述的特異性引物PCR檢測鼓槌石斛的方法，其特征在于，包括以下步驟 1)提取樣品中的DNA； 2)以步驟I)中提取的DNA為模板，使用權利要求I所述的引物F和R，進行PCR擴增反應; 3)分析PCR產物。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，PCR反應體系以26計為模板DNA3^12.5^iM dN l Ps2|il2.5pM 引物FIiil2.5pM 引物RI pi5U7uS Taq DNA聚合酶0_2#Dye 染料2fil10 x PCR反應緩沖液2.5^125mmol/L Mg:+2jilddH20補足至 26|il。
7.根據權利要求5或6所述的方法，其特征在于，PCR反應條件為94°C5min ；94°C lmin,58°C lmin,72°C 1.55min，共 30 個循環；72°C 7min。
8.權利要求2-4任一項所述的試劑盒在檢測鼓槌石斛中的應用。
全文摘要
本發明提供一種采用特異性引物PCR檢測鼓槌石斛的方法，其是基于鼓槌石斛的ITS序列，設計出可快速檢測鼓槌石斛的特異性引物F和R(如Seq ID No.1和2所示)，并在此基礎上建立了PCR檢測體系，為鼓槌石斛的藥材鑒別提供了分子鑒定依據，可從多種藥材中快速、準確地檢測出鼓槌石斛。根據該方法構建的檢測試劑盒操作簡便，特異性好，靈敏度高，可實現對鼓槌石斛的莖、葉或植物其它部位以及藥材的檢測，適于廣泛的推廣使用。
文檔編號C12Q1/68GK102732513SQ20121020891
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月19日 優先權日2012年6月19日
發明者鄭司浩, 陳士林, 黃林芳 申請人:中國醫學科學院藥用植物研究所