一種牛骨骼肌特異性表達基因fatp1啟動子的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種牛骨骼肌特異性表達基因FATP1啟動子，其核心啟動子（-194至737）包含如SEQID所示的DNA序列，其長度為931bp。由于采用了上述技術方案，與現有技術相比，本發明根據研究發現牛FATP1基因啟動子具有骨骼肌特異性啟動特性，并利用這一特性設計了一種骨骼肌特異性表達啟動子載體，該啟動子可以在轉基因牛的培育中應用。該啟動子載體具有骨骼肌特異性啟動特性，而在除骨骼肌外的多種細胞中均無啟動活性，可見該啟動子在骨髂肌中特異性地啟動下游基因的表達，能夠滿足目的基因在骨骼肌中特異性表達的要求，為轉基因載體提供了一種重要的元件。
【專利說明】—種牛骨骼肌特異性表達基因FATP1啟動子
【技術領域】
[0001]本發明涉及分子遺傳學領域，尤其是是一種牛骨骼肌特異性表達基因FATPl啟動子。
【背景技術】
[0002]真核生物基因表達的時間和水平嚴格按照發育順序進行。某些特定基因表達的調節由轉錄因子特異性結合于調控區相關元件，成為轉錄起始的關鍵步驟，并最終導致基因的時間和空間表達。編碼組織特異蛋白的基因嚴格按照組織特異性和發育階段性表達，為基因表達調控機制提供了很好的研究|吳式。在特異聞效表達的轉基因動物中，獲得能廣泛應用的特異性啟動子非常重要。但啟動子的特異性由多個元件控制，在不同種類和不同發育時期起關鍵作用的調控元件并不相同，調控元件和反式作用因子之間的相互作用也十分復雜。因此要使外源基因能夠在動物組織中特異高效地表達，必須構建一個可以特異高效表達的動物表達載體，其中啟動子的選擇是重要的條件之一。啟動子是真核生物基因表達調控的順式作用元件，含有基因表達調控網絡的重要信息，決定基因表達的強度及特異性。
[0003]脂肪酸轉運蛋白I (Fatty Acid Transport Protein I, FATPl ),又名 SLC27al(solute carrier family 27 memberl),主要在脂肪和肌肉組織中表達，FATPl是整合跨膜蛋白，引導外源性脂肪酸進入細胞，參與脂肪酸的攝入和酯化，對細胞內甘油三酯的合成具有重要作用。利用該基因調控區的相關元件構建骨骼肌特異性表達載體是一種有效的方法。基于上述的原因，發明人經過研究發現牛FATPl基因的5’調控區具有骨骼肌特異性啟動特性，并構建了一種骨骼肌特異性表達啟動子載體。該啟動子在骨骼肌中具有明顯啟動特性，而在除骨骼肌外的多種細胞中啟動活性不顯著，說明該基因啟動子能在骨骼肌中特異性地啟動下游基因的表達，為通過轉基因技術來提高牛肉的品質提供了一種重要的調控元件。`
【發明內容】
[0004]本發明所提供了一種牛骨骼肌特異性表達基因FATPl啟動子，該啟動子的能夠顯著啟動骨骼肌細胞中下游基因的表達，對于骨骼肌以外的其他組織細胞沒有顯著啟動活性。
[0005]本發明是這樣實現的:牛骨骼肌特異性表達基因FATPl啟動子，其核心啟動子(-194至737)包含如SEQ ID所示的DNA序列，其長度為932bp。
[0006]所采用的重組核酸序列，其中含有上述的啟動子及其片段，這樣就可以使位于啟動子下游的目的基因在骨骼肌中特異性表達，作為分析、開發、改造骨骼肌特性的研究模型。還可以利用已有的分子生物學操作技術獲得包含目的基因的重組核酸，通過顯微注射等基因導入技術獲得轉基因胚胎，用于建立轉基因動物。重組核酸序列中的目的基因，含有下列的至少一種功能基因，主要包括提高肌肉品質基因，加快生長速度基因，抗病基因，提高飼料報酬的基因以及生產特定藥物的基因，這樣就可以在獲得骨骼肌特異性啟動特性之外，提高該重組核酸序列的性能，為轉基因牛的培育提供更多的功能性方向，增加其附加產值。[0007]本發明主要通過報告基因分析確定該啟動子的啟動特征。進行了如下實驗:
1、牛FATPl啟動子全長的克隆及序列分析
用軟件分析牛FATPl啟動子區域，設定為Pl片段，用在線軟件設計特異性引物，由生物工程有限公司合成；從牛背部最長肌組織提取組織DNA ;采用基因組PCR步移技術擴增出FATPl的啟動子。
[0008]瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增引物；對應物進行純化；送生物公司進行序列分析。
[0009]2、牛FATPl啟動子全長報告質粒的構建及鑒定
將提純后的目的基因和PGL3-Basic進行雙酶切，構建含有FATPl啟動子的重組質粒PGL3-FATP1-P1,并對其進行篩選和鑒定。
[0010]3、雙熒光素酶報告基因檢測報告質粒FATPl啟動子的活性
將FATPl啟動子報告質粒和PRL-TK共轉染到牛前脂肪細胞中，24h后裂解細胞，并收集裂解液進行雙熒光素酶檢測。
[0011]4、牛FATPl核心啟動子區的定位
(I)FATPl-Pl的5’端截短載體的構建以及FATPl核心啟動子區的初步鑒定設計特異性引物對FATPl-Pl 5’端進行截短，并構建重組報告質粒以檢測其啟動活性。截短片段分別命名為P2、P3。構建重組報告質粒PGL3-FATP1-P2、PGL3-FATP1-P3，并進行篩選，鑒定。然后對其進行雙熒光素酶活性檢測。
[0012](2)用脂質體轉染試劑盒將啟動子-熒光素酶報道質粒(pGL3_啟動子)和內參質粒PRL-TK共轉染到細胞中，并檢測熒光素酶報告基因的表達活性。
[0013](3)將缺失突變載體按照脂質體轉染試劑盒說明進行轉染，細胞接種于96孔板培養后，測定熒光素酶表達活性，并觀察不同缺失突變體對熒光素酶表達活性的影響。以上實驗獨立重復3次。
[0014](4)通過對缺失載體啟動子活性進行統計分析后，初步定位核心啟動子的位置。
[0015]5、對核心啟動子測序并進行功能分析
將pGL3-啟動子與PRL-TK共轉染到C2C12細胞系、小鼠脂肪細胞及原代小鼠乳腺細胞等10種細胞中，進行表達特異性驗證。
[0016]該啟動子能夠顯著啟動骨骼肌細胞中下游基因的表達，對于骨骼肌以外的其他組織細胞沒有顯著啟動活性。用脂質體轉染試劑盒將啟動子-熒光素酶報道質粒(PGL3-啟動子)和內參質粒PRL-TK共轉染到細胞中，并檢測熒光素酶報告基因的表達活性。
[0017]由于采用了上述技術方案，與現有技術相比，本發明根據研究發現牛FATPl基因啟動子具有骨骼肌特異性啟動特性，并利用這一特性設計了一種骨骼肌特異性表達啟動子載體，該啟動子可以在轉基因牛的培育中應用。該啟動子載體具有骨骼肌特異性啟動特性，而在除骨骼肌外的多種細胞中均無啟動活性，可見該啟動子在骨髂肌中特異性地啟動下游基因的表達，能夠滿足目的基因在骨骼肌中特異性表達的要求，為轉基因載體提供了一種重要的元件。【專利附圖】
【附圖說明】
附圖1為FATPl基因核心啟動子的PCR擴增產物電泳圖譜；其中 M 為表示 DNA marker (MarkerVII) ;1、2、3、4、5、6 表示 PCR 擴增產物；
附圖2為確認核心啟動子的實驗框圖；
附圖3為本發明的構建重組核苷酸圖。
【具體實施方式】
[0018]本發明的實施例:針對牛骨骼肌特異性表達基因FATPl啟動子，設計上游引物:GGGGTACCCACAGGATGG,下游引物:CCGCTCGAGCCACAGAGTCCTTTAITTGC，通過 PCR 擴增，克隆出核心啟動子(-194至737)包含如SEQ ID所示的DNA序列，其長度為93Ibp。
【權利要求】
1.一種牛骨骼肌特異性表達基因FATPl啟動子，其特征在于:其核心啟動子(-194至 ` 737)包含如SEQ ID所示的DNA序列，其長度為93Ibp。
【文檔編號】C12N15/113GK103509795SQ201210219239
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年6月29日 優先權日:2012年6月29日
【發明者】許厚強, 龔婷, 陳偉, 陳祥 申請人:貴州大學