專利名稱：一種縮短植物細胞懸浮培養周期的方法
技術領域：
本發明專利屬于生物技術領域。
背景技術：
·細胞懸浮培養是生產植物次生代謝物的重要手段之一。但是，植物懸浮細胞生長速度緩慢、培養周期長成了細胞懸浮培養的環節多、成本高等關鍵問題。本發明利用RNAi原理，通過降低植物p53基因的表達，以達到縮短植物懸浮細胞培養周期、提高細胞培養密度目的。
發明內容
構建植物細胞表達載體。通過比對Genbank注冊的植物p53基因的核苷酸序列，選定其兩個保守區各30-100個堿基對的核苷酸序列分別為正向片段I和II，并以其為依據分別設置其對應的反向序列(I’和II’ );根據兩對正、反序列設計出合適的引物，在PCR擴增過程中，使正反片段分別引入限制性內切酶位點(EcoR I和Hind III)和相應的⑶-AG內含子端部序列。經過酶切、再連接、轉化、克隆和鑒定后，得到了四片段的I-AC-II’ -II-CT-I’序列產物；該產物插入到PCAMBIA2300植物表達載體，導入農桿菌感受態EHA105，篩選出能轉化植物的工程菌。以甘草為例獲得甘草轉化體。從甘草幼苗的上胚軸上誘導愈傷組織；早期愈傷組織與農桿菌工程菌共培養；隨后在含抗生素的培養基中進行選擇培養，篩選出抗性愈傷組織并進行繼代培養；將松散的抗性愈傷組織在液體培養基振蕩培養；培養物過篩后繼續進行懸浮培養，獲得穩定的懸浮細胞。高產懸浮細胞系的篩選。利用看護培養手段，從懸浮細胞中篩選生長速度快的單細胞系愈傷組織；將該愈傷組織在液體培養基中振蕩培養；培養物過篩后繼續進行懸浮培養，獲得由單細胞和小細胞團組成的懸浮系；對該懸浮系的細胞生長周期、主要代謝產物含量進行等鑒定并穩定性試驗，獲得的生長懸浮細胞作為種子進入大規模。細胞懸浮培養基及培養條件的優化。通過培養基和培養條件的優化，獲得植物細胞生長和產物積累的最適碳氮源、pH、溫度、溶氧量和最佳接種量等發酵工藝參數，為進一步進行大規模細胞懸浮培養提供了依據。主要用途利用本發明方法獲得的培養周期短、成本低、生產效率高的細胞，將在大規模開發和生產藥用植物有效成分方面將發揮著關鍵作用。
具體實施例方式以甘草為例-干涉p53基因制備生長周期短的細胞懸浮系的方法構建植物細胞表達載體通過Genbank注冊的所有植物p53基因的核苷酸序列，選定其兩個保守區各50個堿基對的核苷酸序列分別為正向片段I和II，并以其為依據分別設置其對應的反向序列(I’和II’ );根據兩對正、反序列設計出合適的引物，在PCR擴增過程中，使正反片段分別引入限制性內切酶位點(EcoR I和Hind III)和相應的⑶-AG類內含子端部核苷酸序列。結果見表I。經過酶切、再連接、轉化、克隆和鑒定后，得到了四片段的I-AC-II’ -II-CT-I’序列產物；該產物插入到PCAMBIA2300植物表達載體，導入感受態農桿菌EHA105，篩選出能轉化植物細胞的工程菌pCAM-RNAi-p53。表I p53基因保守區域DNA片段及其PCR引物的核苷酸序列
權利要求
1.一種縮短植物細胞懸浮培養周期的方法。其特征是 .1.構建p53基因RNAi表達載體工程菌。通過比對Genbank注冊的植物p53基因的核苷酸序列，任選其兩個保守區核苷酸序列分別為正向片段I、II，并設置其對應的反向序列I’和II’;結合引物設計引入⑶-AG類內含子端部堿基，通過PCR構建I-AC-II’ -II-CT-I’的RNAi片段；篩選出插在pCAMBIA2300表達載體并能轉化植物細胞的工程菌。.2.從外植體誘導早期愈傷組織；早期愈傷組織與根瘤農桿菌工程菌共培養；隨后在含抗生素的培養基中進行選擇培養，篩選出抗性愈傷組織并進行繼代培養；將松散的抗性愈傷組織在液體培養基振蕩培養；培養物過篩后繼續進行振蕩懸浮培養，獲得穩定的懸浮細胞系。. 3.利用看護培養手段，從懸浮細胞中篩選出生長速度快、由單細胞系形成的愈傷組織；將該愈傷組織在液體培養基中振蕩培養；培養物過篩后繼續進行懸浮培養，獲得由單細胞和小細胞團組成的懸浮系；對該懸浮系的細胞形態大小、生長周期、主要代謝產物含量及其穩定性等進行鑒定，最后獲得的懸浮細胞作為種子進入大規模培養。 .4.通過培養基和培養條件的優化，獲得植物細胞生長和產物積累的最適碳氮源、pH、溫度、溶氧量和最佳接種量等主要發酵工藝參數。
全文摘要
一種縮短植物細胞懸浮培養周期的方法，本發明屬于生物技術領域。首先，選定p53基因的兩個保守區分別為正向片段I、II以及對應的反向序列I’和II’；構建I-GU-II’-II-AG-I’的RNAi片段；篩選出其插在pCAMBIA2300植物表達載體的根瘤農桿菌工程菌。然后，以甘草為例，農桿菌介導法依次獲得p53轉化的愈傷組織及其穩定表達的懸浮細胞。再次，通過看護培養，利用懸浮細胞，篩選生長速度快、效果好的單細胞系愈傷組織以及由此形成的懸浮細胞系。最后，通過培養工藝優化，獲得懸浮細胞生長和產物積累的最佳發酵工藝參數。利用本發明方法獲得的培養周期短、密度大、成本低、生產效率高的細胞系，為大規模開發和生產藥用植物有效成分提供優質種源。
文檔編號C12N5/02GK102839190SQ20121022972
公開日2012年12月26日 申請日期2012年7月5日 優先權日2012年7月5日
發明者李興林, 高潔, 曹愛佳, 韓楊, 肖天劍, 趙俊, 張黎明, 滿淑麗, 高文遠 申請人:天津科技大學