專利名稱：一種紅豆杉植物細胞種子穩定培養方法
技術領域：
本發明專利涉及一種細胞種子穩定培養方法，特別是指一種紅豆杉植物細胞種子穩定培養方法，屬于種子培養技術領域。
背景技術：
紫杉醇(Taxol)是最早從紅豆杉植物樹皮中分離提取出來的一種二萜類生物堿，作為治療晚期卵巢癌、乳腺癌的首選抗癌藥，從1992年上市后，因資源缺乏，價格昂貴。目前紫杉醇原料藥來源主要有三種途徑一種是從紅豆杉種植枝葉中提取后得到紫杉醇，但因紅豆杉生長緩慢，生產周期長達3飛年，枝葉中紫杉醇含量低，導致紫杉醇的提取成本高。二是通過Baccatin III和1(TDAB等前體半合成紫杉醇，但所需要的半合成前 體也來源于種植枝葉，同樣受到提取原料來源的限制，仍然不能滿足臨床和試驗對紫杉醇的大量需求。三是各國科學家采用植物細胞培養技術來解決紫杉醇藥源緊缺的問題，通過紅豆杉植物細胞大規模培養技術生產紫杉醇被認為是目前替代種植和半合成紫杉醇原料藥來源的最重要的途經之一，其特點是1、細胞生產培養周期短、紫杉醇含量高(通過對紫杉醇高產細胞優株篩選和條件優化后，可比原植物提高幾十倍)、產量大，成本低；2、細胞培養得到的產物分布簡單，雜質含量少，便于后續分離；3、用于提取紫杉醇的原料來源穩定可控，可在人為控制條件下按市場需求在反應器內進行無限、連續、均勻地大規模生產；4、沒有化肥、農藥或重金屬帶來的污染，也沒有栽培植物所受到的病蟲害和細菌的侵害，是真正無菌、無毒的綠色產品；5、不需大量砍伐、采挖植物，保護土地資源，保護了生態平衡；6、除提供紫杉醇外，還可生產各種紫杉烷類前體及其他有抗癌活性的新化合物。中國、美國、加拿大、韓國、日本等國對應用紅豆杉植物細胞培養技術生產紫杉醇進行了大量研究，但是科學家的研究熱點主要集中在紫杉醇高產上面，至今沒有提出一套紅豆杉細胞種子長期穩定繼代培養的技術方案，因種子質量和生長狀態差異太大，生長緩慢，生長過程中會不斷產生紅色或褐色類物質，種子繼代培養時經常出現過敏變紅或衰老死亡變褐而失敗的技術難題，導致植物細胞培養生產紫杉醇時批次之間的紫杉醇含量穩定性差，是紅豆杉植物細胞大規模培養產業化生產紫杉醇面臨的共性技術難題，所以盡管從1992年開始進行紅豆杉細胞培養產業化生產紫杉醇的技術攻關，至今很少研究團隊能進入中試和產業化階段，沒有辦法培養質量和生長狀態穩定的紅豆杉細胞種子是細胞培養失敗的主要原因之一。
發明內容
本發明的目的是提供一種經濟可行、工藝簡單可控、成本低并能夠穩定培養紅豆杉植物細胞種子的方法，得到質量和生長狀態穩定的種子。本發明的技術方案是這樣的該紅豆杉植物細胞種子穩定培養方法，依次包括下述步驟(I)對繼代培養的種子進行取樣，檢測種子終生物量(以干重計，后面相同)、培養液終pH、培養液終電導率、培養液終糖度；(2)根據種子終生物量的大小，通過倒去培養液或加入水，將種子終生物量調整到5 10g/L ；(3)根據培養液終糖度大小，加入糖溶液將種子繼代培養時培養液初始糖度提高到 15 25g/L ；(4)根據培養液終電導率大小,加入B5培養基或濃縮B5培養基將種子繼代培養時培養液初始電導率提高到2. 5^3. 5mS/cm。(5)將初始生物量控制在2. 5^3. 5g/L，培養液初始pH控制在5. (Γ6. O，攪拌轉速控制在l(Tl30rpm，罐壓控制在O. 03、. 07Mpa，培養溫度控制在25° C，調節通氣量大小并通過溶氧電極控制培養液溶氧為20飛0%，在黑暗條件下進行種子繼代培養；(6)當步驟(5)中的繼代培養的種子，同時滿足A、B、C三個條件時A、培養液終糖度大于8g/L ;B、培養液終電導率大于2. 0mS/cm;C、培養液終pH小于6.0 ;按步驟(I廣(5)啟動下一次種子繼代培養。進一步的，上述的紅豆杉植物細胞種子穩定培養方法，種子繼代培養時所述的種子初始生物量是3. Og/L，種子終生物量是7. 5g/L。進一步的，上述的紅豆杉植物細胞種子穩定培養方法，種子繼代培養時所述的溶氧是20 60%ο進一步的，上述的紅豆杉植物細胞種子穩定培養方法，種子繼代培養時所述的攪 拌轉速是30rpm,罐壓是O. 05Mpa。進一步的，上述的紅豆杉植物細胞種子穩定培養方法，種子繼代培養時所述的培養液初始糖度是21g/L，種子培養液終糖度是大于8g/L。進一步的，上述的紅豆杉植物細胞種子穩定培養方法，所述的糖是蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、可溶性淀粉的其中一種糖或兩種及兩種以上的糖組合。進一步的，上述的紅豆杉植物細胞種子穩定培養方法，種子繼代培養時所述的培養液初始電導率是3. Oms/cm,種子培養液終電導率是大于2. Oms/cm。進一步的，上述的紅豆杉植物細胞種子穩定培養方法，種子繼代培養時所述的培養液初始PH是5. (Γ6. O,培養液終pH是小于6. O。進一步的，上述的紅豆杉植物細胞種子穩定培養方法，所述的種子繼代時更換B5培養基或濃縮B5培養基占總體積的比例是50飛0%。現有植物細胞培養技術基本處于三角瓶小試規模，工藝控制操作不穩定，沒有對繼代培養時的種子初始生物量、培養液初始糖度、培養液初始電導率，培養液初始PH參數進行明確定義及相對準確的控制，也沒有對繼代培養結束后種子終生物量、培養液終糖度、培養液終電導率、培養液終PH參數進行明確定義及進行準確的控制，同時也沒有控制種子繼代培養時間，導致每次種子繼代培養時條件變化太大，種子質量和生長狀態難于控制，不斷發生過敏變紅和衰老死亡現象而培養失敗；本發明通過對繼代培養的種子質量和種子繼代培養的條件進行控制，確保每一次種子繼代培養后種子質量和生長狀態的穩定。現有技術為了預防種子繼代培養出現變紅變褐色的現象，添加了維生素C、活性碳等抗褐化劑和氨基酸類營養，雖然可以減少變紅變褐現象的發生，但增加了操作難度并增加了污染機會，本發明操作更簡單，無須額外添加抗褐化劑和營養物質，培養成功率高。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
，對本發明的權利要求作進一步的詳細說明，但不構成對本發明的任何限制，任何人在本發明權利要求范圍內所做的有限次的修改，仍在本發明權利要求范圍內。
本發明方法的具體步驟如下I、對需要繼代培養的種子進行取樣，檢測種子終生物量、培養液終pH、培養液終電導率、培養液終糖度；2、根據種子終生物量的大小，采用如表11所說的種子繼代培養時初始生物量的控制方法，通過倒去培養液或加入水，將種子終生物量調整到5 10g/L ；3、采用如表9所說的培養液初始糖度和培養液終糖度的調控方法，根據培養液終糖度大小，加入糖溶液將種子繼代培養時培養液初始糖度提高到15 25g/L ；4、采用如表8所說的培養液初始電導率和培養液終電導率的調控方法，根據培養液終電導率大小，加入B5培養基或濃縮B5培養基將種子繼代培養時培養液初始電導率提高到 2. 5 3. 5ms/cm ；5、對種子進行繼代培養將培養初始生物量控制在2. 5^3. 5g/L，培養液初始pH控制在5. (Γ6. O,攪拌轉速控制在l(Tl30rpm，罐壓調為O. 03、. 05Mpa, 25±2°C黑暗條件，靈活調節通氣量大小并通過溶氧電極控制溶氧為20飛0%，進行種子繼代培養；6、當步驟(5)中的繼代培養的種子，當同時滿足如下三個條件時A、培養液終糖度大于8g/L ;B、培養液終電導率大于2. Oms/cm ;C、培養液終pH小于6. O ;按步驟f 6方法啟動下次種子繼代培養。實施例I紅豆杉植物細胞種子來源和種子繼代培養條件I、材料和培養條件供試材料為本公司篩選實驗室誘導篩選并繼代培養的中國紅豆杉細胞株，以B5為基本培養基，添加 lmg/L NAA、0.2mg/L 6 BA、30g/L 蔗糖、100mg/L Vc 和 292. 8mg/L L 谷氨酰胺作為繼代培養基，繼代時采用IOOOml的三角瓶內裝400ml培養體積，按2:3比例接入紅豆杉植物細胞種子和B5培養基，然后將三角瓶置于23 27°C恒溫室內的搖床上，以120rpm搖床轉速進行振蕩培養，細胞繼代培養擴14天后作為種子做正交優化試驗。2、細胞培養物樣品的檢測方法①細胞鮮重的測定細胞培養物用120目尼龍篩網濾過，細胞用水沖洗三次后，再用干紗布吸干細胞表面水分，在電子天平上稱其重量，用g/L表示。②細胞干重的測定，鮮細胞置于恒溫烘箱中，60°C烘干至恒重，用電子天平稱其重量，用g/L表示。③糖度測定用糖度儀(北京萬成北增精密儀器有限公司)測定，用g/L表示。④pH測定用pHS 25型pH計(上海精密科學儀器有限公司)測定。⑤電導率測定用DDSllA型電導率儀(上海雷磁儀器有限公司)測定，用ms/cm表
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⑥溶氧測定采用梅特勒溶氧電極在線檢測，用％表示。3、生長條件優化方法60ml B5培養基裝入250ml三角瓶內，培養基根據選取的正交表配方配制，接入40ml中國紅豆杉種子培養基中，在23 27°C、120rpm搖床轉速及黑暗條件下進行生長試驗。實施例2初始生物量、種子培養時間和培養液初始糖度對中國紅豆杉細胞生長的影響60ml培養基裝入250ml三角瓶內，以B5培養基為基礎配方，添加lmg/L NAA和 0.2mg/L的6 BA，根據表I和表2的4因素3水平L9 (34)正交試驗表配制成25g/L、16g/L、10g/L蔗糖濃度的不同培養基配方，接入40ml的細胞種子后使培養物中的初始生物量分別為I. 87 g/L、2. 81 g/L和3. 74 g/L，然后將搖瓶均勻置于25±2°C的恒溫室內的搖床上，以120 rpm搖床轉速進行振蕩培養，細胞種子繼代培養到第7、9、11天取樣，檢測培養物中的細胞終生物量和培養液終pH、培養液終電導率、培養液終糖度。從表I和表2正交試驗可得到如下結論I、種子初始生物量在2. 81 g/L時，每升培養物中每克細胞每天鮮重和干重的增加速度都最快，而種子初始生物量在I. 87 g/L和3. 74 g/L時細胞生長速度明顯要慢，特別是在I. 87 g/L較低初始生物量時生長最慢，證明細胞生長有一最低密度效應，和現有文獻研究結果相同，因此將合適的細胞種子初始生物量定在2. 5^3. 5g/L之間。2、種子培養時間對細胞生長的影響在細胞生長的前期7、天，有利于鮮重的增力口，而后期擴11天有利于干重的增加，綜合鮮干重數據，在第擴11天進行細胞種子繼代培養比較合適。3、培養液初始糖度對細胞生長的影響培養液初始糖度10g/L時，細胞生長速度明顯要快，培養液初始糖度為16g/L和25g/L時細胞生長要慢，過高的培養液初始糖度減慢了細胞的生長速度，結合2的結論種子在第911天進行繼代培養比較合適，按糖度平均消耗為O. 26g/L/d/g為依據，為了確保種子生長狀態和質量能維持穩定，將合適的培養液初始糖度定在15 25g/L。表I L9 (34)正交試驗設計表
權利要求
1.一種紅豆杉植物細胞種子穩定培養方法，其特征在于，依次包括下述步驟 (1)對繼代的種子進行取樣，檢測種子終生物量、培養液終pH、培養液終電導率、培養液終糖度； (2)根據種子終生物量的大小，通過倒去培養液或加入水，將種子終生物量調整到5 10g/L ； (3)根據種子培養液終糖度大小，加入糖溶液將種子繼代培養時培養液初始糖度提高到 15 25 g/L ； (4)根據種子培養液終電導率大小,加入B5培養基或濃縮B5培養基將種子繼代培養時培養液初始電導率提高到2. 5^3. 5 ms/cm ； (5)將培養初始生物量控制在2.5^3. 5g/L，種子繼代培養時培養液初始pH控制在5.0 6. O，攪拌轉速控制在l(Tl30rpm，罐壓控制在0. 03 0. 07Mpa，25±2°C黑暗條件，調節通氣量大小并通過溶氧電極控制溶氧為20飛0%，進行種子繼代培養； (6)當步驟(5)中的繼代培養的種子，同時滿足A、B、C三個條件時A、培養液終糖度大于8g/L ;B、培養液終電導率大于2. Oms/cm ;C、培養液終pH小于6. 0 ;按步驟(1) (5)啟動下一次種子繼代培養。
2.根據權利要求I所述的紅豆杉植物細胞種子穩定培養方法，其特征在于，種子繼代培養時所述的種子初始生物量控制在3. Og/L，種子終生物量控制在7. 5g/L。
3.根據權利要求I所述的紅豆杉植物細胞種子穩定培養方法，其特征在于，種子繼代培養時所述的溶氧控制在30 50%。
4.根據權利要求I所述的紅豆杉植物細胞種子穩定培養方法，其特征在于，種子繼代培養時所述的攪拌轉速控制在30rpm，罐壓控制在0. 05Mpa，培養溫度控制在25° C，在黑暗條件下進行培養。
5.根據權利要求I所述的紅豆杉植物細胞種子穩定培養方法，其特征在于，種子繼代培養時所述的培養液初始糖度是21g/L，種子培養液終糖度大于8g/L。
6.根據權利要求I所述的紅豆杉植物細胞種子穩定培養方法，其特征在于，所述的糖是蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、可溶性淀粉的其中一種糖或兩種及兩種以上的糖組合。
7.根據權利要求I所述的紅豆杉植物細胞種子穩定培養方法，其特征在于，種子繼代培養時所述的培養液初始電導率是3. Oms/cm,種子培養液終電導率大于2. Oms/cm。
8.根據權利要求I所述的紅豆杉植物細胞種子穩定培養方法，其特征在于，種子繼代培養時的培養液初始PH范圍是5. (T6. 0，培養液終pH小于6. O。
9.根據權利要求I所述的紅豆杉植物細胞種子穩定培養方法，所述的種子繼代培養時更換B5培養基或濃縮B5培養基體積占總體積的比例是5(T60%。
全文摘要
本發明公開一種紅豆杉植物細胞種子穩定培養方法，旨在提供一種經濟可行、工藝簡單可控、成本低并能夠穩定培養紅豆杉植物細胞種子的方法；該方法是1)對繼代種子取樣檢測；2)種子終生物量調整到5~10 g/L；3)培養液初始糖度提高到15~25 g/L；4)培養液初始電導率提高到2.5~3.5ms/cm；5)培養初始生物量控制在2.5~3.5g/L，初始pH控制在5.0~6.0，攪拌進行種子繼代培養；6)當步驟5)中的繼代培養的種子滿足A、培養液終糖度大于8g/L或B、培養液終電導率大于2.0ms/cm或C、培養液終pH小于6.0；按步驟1)~5)啟動下一次種子繼代培養；屬于種子培養技術領域。
文檔編號C12N5/04GK102965329SQ20121050620
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月30日 優先權日2012年11月30日
發明者李干雄, 侯云屏, 古志淵, 駱雪蘭, 曾騰鋒, 吳永艷, 肖華 申請人:廣東科倫藥業有限公司